Praktiska överväganden studera metastaserande lungcancer kolonisationen i osteosarkom med pulmonell metastas-analys
Summary
Syftet med denna artikel är att ge en detaljerad beskrivning av protokollet för pulmonell metastaser analysen (PuMA). Denna modell tillåter forskare att studera metastaserat osteosarkom (OS) celltillväxt i lungvävnaden med en widefield fluorescens eller confocal laserskanning Mikroskop.
Abstract
Pulmonell metastaser analysen (PuMA) är en ex vivo lung explant och stängda cellodlingssystem som tillåter forskare att studera biologi lung kolonisationen i osteosarkom (OS) genom fluorescensmikroskopi. Denna artikel ger en detaljerad beskrivning av protokollet, och diskuterar exempel erhålla bilddata på metastaserad tillväxt med widefield eller confocal fluorescence mikroskopi plattformar. Flexibiliteten i PuMA modellen tillåter forskare att studera inte bara tillväxten av OS celler i de lung mikromiljö, men också att bedöma effekterna av anti metastaserande therapeutics över tid. Konfokalmikroskopi ger oöverträffad, högupplöst avbildning av OS cell interaktioner med lungparenkym. Dessutom när PuMA modellen kombineras med fluorescerande färger eller fluorescerande protein genetiska reportrar, kan forskare studera den lung mikromiljö, cellulär och subcellulär strukturer, geners funktion och arrangören aktivitet i metastaserande OS celler. PuMA modellen innehåller ett nytt verktyg för osteosarkom forskare att upptäcka nya metastaser biologi och bedöma aktiviteten av romanen anti metastaserande, riktade terapier.
Introduction
Förbättrade resultat för pediatriska patienter med metastaserat osteosarkom (OS) är fortfarande en kritisk ej tillgodosett kliniskt behov 1. Detta understryker vikten av att utveckla nya molekylärt inriktade terapier. Konventionella kemoterapeutika som mål tumör cell spridning inte har visat sig vara effektiv vid behandling av metastaserad sjukdom, och därmed nya strategier måste rikta metastaserande processen i sig 2. Den nuvarande artikeln diskuterar de praktiska aspekterna av en relativt ny typ av ex vivo lung metastaser modell, pulmonell metastaser analysen (PuMA) utvecklats av Mendoza och kollegor3, vilket ger ett användbart verktyg att upptäcka nya Molekylär drivrutiner i lungan metastaser progression i OS 4,5. Innan du fortsätter, men det vore klokt att kort beröra flera aktuella modeller av metastaser och hur PuMA modellen erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella in vitro- testmetoder.
Mest experimentella modeller används för att studera metastaser bestå av in vitro- och in-vivo -system som recapitulate antingen ett konkret steg eller flera steg i metastaserande kaskad. Åtgärderna omfattar bland annat: 1) tumörceller migrera bort från den primära tumören, 2) intravasation i närliggande fartyg (blod- eller lymfsystemet) och transitering inom cirkulation, 3) gripa vid sekundär plats, 4) extravasering och överlevnad på den sekundära platsen, 5) bildande av micrometastases, och 6) tillväxt i vaskulariserad metastaser (figur 1). In vitro -modeller för metastaser kan omfatta 2-dimensionell (2D) migration och 3-dimensionell (3D) Matrigel invasion analyser som granskas i detalj på annan plats 6. För in-vivo modeller, de två vanligaste modellsystem inkluderar: 1) spontana metastaser modell är där en tumörceller är orthotopically injiceras i en specifik vävnadstyp att bilda en lokal tumör som spontant skjul metastaserande celler till avlägsna platser. (2) experimentella metastaser modell är där tumörceller injiceras i blodkärlen uppströms i målorganet. Exempelvis en svans ven injektion av tumör celler resultat i utveckling lung metastaser5,7,8. Andra experimentella metastaser modeller inkluderar injektion av tumörceller i mjälte eller mesenteriska ven vilket resulterar i utvecklingen av levermetastaser9,10. Praktiska överväganden av dessa in-vivo -modeller diskuteras i detalj av Welch 11. En annan i vivo modell används för att studera metastaser i pediatriska sarkom är nedsatt njur subkapsulär tumör implantation modell vilket resulterar i lokala tumörbildning och spontana metastasering till lungorna 12,13. En mer tekniskt krävande teknik såsom intravital videomicroscopy kan direkt visualisera, i realtid, interaktioner mellan metastaserande cancerceller och mikrocirkulation av en metastasplats (dvs. lung- eller leverproblem) som beskrivs av MacDonald14 och Entenberg15, eller cancer cell extravasering i chorioallantoic membran som beskrivs av Kim 16.
PuMA modellen är en ex vivo, lunga vävnad explant, stängda kultur system där tillväxten av fluorescerande tumörceller längdriktningen kan observeras via fluorescensmikroskopi under en period av en månad (se figur 2A). Denna modell recapitulates de inledande skedena av lung kolonisering (steg 3 till 5) i metastaserande kaskad. Några viktiga fördelar av PuMA modell över konventionella in vitro- modeller är: 1) det ger en möjlighet att longitudinellt mäta metastaserande cancer celltillväxt i en 3D närmiljön som behåller många funktioner i de lung mikromiljö i vivo 3; (2) puMA gör det möjligt för forskaren att bedöma om knockdown en kandidat gene eller drogmissbruk behandling har anti metastaserande aktivitet i samband med en 3D lung närmiljön; (3) PuMA modellen är flexibel med många typer av fluorescence mikroskopi plattformar (figur 2B) såsom widefield fluorescensmikroskopi eller laserskanning konfokalmikroskopi, visas exempel på varje i figur 2 c & D, respektive. Denna artikel kommer att diskutera hur du använder PuMA modellen för att få longitudinella imaging data för förbättrad grönt fluorescerande protein (andra) metastaserande tillväxt-uttrycker, mänskliga höga och låga metastaserat osteosarkom celler (MNNG och HOS celler, respektive) använder låg-förstoring widefield fluorescens. Exempel på imaging ett fluorescerande färgämne som etiketter lungparenkym och ett rött fluorescerande protein genetiska reporter som etiketter mitokondrier i OS celler i PuMA modellen med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi diskuteras också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Följande tekniska artikel beskriver några praktiska aspekter av PuMA modellen studera lungcancer kolonisationen i OS. Vissa kritiska steg i protokollet där forskare bör vara extra försiktig inkluderar följande:
(a) kanylering av luftstrupen. Luftstrupen kan lätt skadas medan dissekera den omgivande muskler och bindväv. Nålen på katetern kan dessutom enkelt skjutas genom luftstrupen. Ägna stor uppmärksamhet åt hur avfasningen nålspetsen kommer in till luftstrupen när du sätter k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Arnulfo Mendoza som tillhandahöll utbildning i PuMA-tekniken. Vi skulle dessutom vilja erkänna Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), och Sam Aparicio (BC Cancer Agency) för användning av deras Mikroskop under loppet av denna studie. Denna forskning stöds (delvis) av intramurala forskningsprogrammet av det nationella Institutes of Health, Center for Cancer Research, pediatrisk onkologi gren. M.M.L. stöddes av National Institutes av hälsa intramurala besöker Fellow Program (15335 award) och stöds för närvarande av en Joan Parker Fellowship i metastaser forskning. P.H.S. stöds av British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
