Praktiska överväganden studera metastaserande lungcancer kolonisationen i osteosarkom med pulmonell metastas-analys

Summary

Syftet med denna artikel är att ge en detaljerad beskrivning av protokollet för pulmonell metastaser analysen (PuMA). Denna modell tillåter forskare att studera metastaserat osteosarkom (OS) celltillväxt i lungvävnaden med en widefield fluorescens eller confocal laserskanning Mikroskop.

Abstract

Pulmonell metastaser analysen (PuMA) är en ex vivo lung explant och stängda cellodlingssystem som tillåter forskare att studera biologi lung kolonisationen i osteosarkom (OS) genom fluorescensmikroskopi. Denna artikel ger en detaljerad beskrivning av protokollet, och diskuterar exempel erhålla bilddata på metastaserad tillväxt med widefield eller confocal fluorescence mikroskopi plattformar. Flexibiliteten i PuMA modellen tillåter forskare att studera inte bara tillväxten av OS celler i de lung mikromiljö, men också att bedöma effekterna av anti metastaserande therapeutics över tid. Konfokalmikroskopi ger oöverträffad, högupplöst avbildning av OS cell interaktioner med lungparenkym. Dessutom när PuMA modellen kombineras med fluorescerande färger eller fluorescerande protein genetiska reportrar, kan forskare studera den lung mikromiljö, cellulär och subcellulär strukturer, geners funktion och arrangören aktivitet i metastaserande OS celler. PuMA modellen innehåller ett nytt verktyg för osteosarkom forskare att upptäcka nya metastaser biologi och bedöma aktiviteten av romanen anti metastaserande, riktade terapier.

Introduction

Förbättrade resultat för pediatriska patienter med metastaserat osteosarkom (OS) är fortfarande en kritisk ej tillgodosett kliniskt behov ¹. Detta understryker vikten av att utveckla nya molekylärt inriktade terapier. Konventionella kemoterapeutika som mål tumör cell spridning inte har visat sig vara effektiv vid behandling av metastaserad sjukdom, och därmed nya strategier måste rikta metastaserande processen i sig ². Den nuvarande artikeln diskuterar de praktiska aspekterna av en relativt ny typ av ex vivo lung metastaser modell, pulmonell metastaser analysen (PuMA) utvecklats av Mendoza och kollegor³, vilket ger ett användbart verktyg att upptäcka nya Molekylär drivrutiner i lungan metastaser progression i OS ^4,5. Innan du fortsätter, men det vore klokt att kort beröra flera aktuella modeller av metastaser och hur PuMA modellen erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella in vitro- testmetoder.

Mest experimentella modeller används för att studera metastaser bestå av in vitro- och in-vivo -system som recapitulate antingen ett konkret steg eller flera steg i metastaserande kaskad. Åtgärderna omfattar bland annat: 1) tumörceller migrera bort från den primära tumören, 2) intravasation i närliggande fartyg (blod- eller lymfsystemet) och transitering inom cirkulation, 3) gripa vid sekundär plats, 4) extravasering och överlevnad på den sekundära platsen, 5) bildande av micrometastases, och 6) tillväxt i vaskulariserad metastaser (figur 1). In vitro -modeller för metastaser kan omfatta 2-dimensionell (2D) migration och 3-dimensionell (3D) Matrigel invasion analyser som granskas i detalj på annan plats ⁶. För in-vivo modeller, de två vanligaste modellsystem inkluderar: 1) spontana metastaser modell är där en tumörceller är orthotopically injiceras i en specifik vävnadstyp att bilda en lokal tumör som spontant skjul metastaserande celler till avlägsna platser. (2) experimentella metastaser modell är där tumörceller injiceras i blodkärlen uppströms i målorganet. Exempelvis en svans ven injektion av tumör celler resultat i utveckling lung metastaser^5,7,8. Andra experimentella metastaser modeller inkluderar injektion av tumörceller i mjälte eller mesenteriska ven vilket resulterar i utvecklingen av levermetastaser^9,10. Praktiska överväganden av dessa in-vivo -modeller diskuteras i detalj av Welch ¹¹. En annan i vivo modell används för att studera metastaser i pediatriska sarkom är nedsatt njur subkapsulär tumör implantation modell vilket resulterar i lokala tumörbildning och spontana metastasering till lungorna ^12,13. En mer tekniskt krävande teknik såsom intravital videomicroscopy kan direkt visualisera, i realtid, interaktioner mellan metastaserande cancerceller och mikrocirkulation av en metastasplats (dvs. lung- eller leverproblem) som beskrivs av MacDonald¹⁴ och Entenberg¹⁵, eller cancer cell extravasering i chorioallantoic membran som beskrivs av Kim ¹⁶.

PuMA modellen är en ex vivo, lunga vävnad explant, stängda kultur system där tillväxten av fluorescerande tumörceller längdriktningen kan observeras via fluorescensmikroskopi under en period av en månad (se figur 2A). Denna modell recapitulates de inledande skedena av lung kolonisering (steg 3 till 5) i metastaserande kaskad. Några viktiga fördelar av PuMA modell över konventionella in vitro- modeller är: 1) det ger en möjlighet att longitudinellt mäta metastaserande cancer celltillväxt i en 3D närmiljön som behåller många funktioner i de lung mikromiljö i vivo ³; (2) puMA gör det möjligt för forskaren att bedöma om knockdown en kandidat gene eller drogmissbruk behandling har anti metastaserande aktivitet i samband med en 3D lung närmiljön; (3) PuMA modellen är flexibel med många typer av fluorescence mikroskopi plattformar (figur 2B) såsom widefield fluorescensmikroskopi eller laserskanning konfokalmikroskopi, visas exempel på varje i figur 2 c & D, respektive. Denna artikel kommer att diskutera hur du använder PuMA modellen för att få longitudinella imaging data för förbättrad grönt fluorescerande protein (andra) metastaserande tillväxt-uttrycker, mänskliga höga och låga metastaserat osteosarkom celler (MNNG och HOS celler, respektive) använder låg-förstoring widefield fluorescens. Exempel på imaging ett fluorescerande färgämne som etiketter lungparenkym och ett rött fluorescerande protein genetiska reporter som etiketter mitokondrier i OS celler i PuMA modellen med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi diskuteras också.

Protocol

Alla djur protokoll som tänkbar data erhölls utfördes med godkännande av djur vård och användning kommittén av National Cancer Institute, National Institutes of Health. Alla djur protokoll diskuterades och porträtteras i artikeln video har godkänts av utskottet University of British Columbia djur vård.

1. beredning av tumörceller för injektion och material för PuMA modellen

Obs: Mängden lösningar och celler kommer att räcka för 1 mus. Skala upp som behövs om fler möss används i studien. För media recept, se tabell 1 och tabell 2.

1. Pre varm 5 mL av en-Media i en 15 mL koniska rör i ett 37 ^oC vattenbad.
2. Smälta om 1,2% låg smälttemperatur agaros lösningen (i sterilt vatten) med lab mikrovågsugn.
3. Överföra 5 mL smält Agarens in i en 15 mL koniska rör och håll varm i vattenbad 37 ^oC. Se till att smälta agarosen är 37 ^oC och vätska innan det lung insufflation steget.
4. Pre chill 30 mL cellkultur grade PBS kompletteras med 1 X penna/strep i en ishink.
5. I en väl 6-well platta, pre Blötlägg en gelatinsvamp i 1,5 mL B-media. Svampen kommer att stöd ankaret för lung skivor.
6. Se till att OS cellerna är ca 70-90% konfluenta dag förfarandet. Använd inte celler som är alltför konfluenta eller om media är orange till gult eftersom cellerna är oftast stressade och har minskat lönsamheten på denna punkt. För de osteosarkom cellinjer, MNNG och HOS, kommer 5 x 10-⁵ i en volym av 100 μL att användas att injicera i svansen ven av 1 mus. Exklusiva följaktligen om fler möss används för studien.
7. Skörda tumörcellerna med 0,25% trypsin-EDTA (3 mL för en T75 kolv eller 2 mL i en 10 cm kultur maträtt). När celler börjar att lyfta plattan, neutralisera den trypsin-EDTA med komplett media. Snurra ner cellerna och skölj en gång med cellkultur grade PBS. Återsuspendera pelleten i 5 mL PBS.
8. Utföra en cell sammanräkning av standardmetoder. Det är bäst att göra mer cellsuspension än vad som faktiskt behövs eftersom förlust av cellsuspensionen ofta sker under nålen rita upp och misslyckade injektion försök.
9. Utföra en Trypan-blå utslagning analysen på ett urval av cellsuspensionen att bedöma lönsamheten för cellerna. Fortsätt endast om cellen visar 90% livskraft eller högre.
10. Injicera 5 x 10⁵ celler i en volym av 100 μL. För att förbereda ett överskott av 2 X av detta belopp, bör 1 x 10⁶ celler snurrade ner och resuspended i 0,2 mL HBSS.
11. Placera cellsuspension i en ishink samtidigt förbereda möss för injektion.

2. Slutgas ven injektion och Lung Insufflation

Obs: Mängden lösningar och celler i detta avsnitt kommer att räcka för 1 mus. Skala upp som behövs om fler möss används i studien. För en lista av utrustning, material och kirurgiska instrument som används i följande steg, se tabell 3 och tabell 4.

1. Värma en kvinnlig mus (år 6-8 veckor) under en värme lampa för 5 min för att göra deras svans ven mer synligt uppenbart. För murina K7M2 eller K12 celler, Använd Balb/c-möss; för mänskliga MG63.3, MG63, MNNG och HOS celler, använder du svår kombinerad immunbrist möss.
2. Kontrollera att cellsuspensionen är enhetliga genom att försiktigt skaka röret. Noggrant utarbeta cellsuspensionen i 1 mL sprutan utan nålen. Locket på sprutan med en 27 gauge nål. Kontrollera att nålen avfasningen är på samma sida som volym markeringarna på nålen.
3. Placera musen i fasthållning och svabba svansen med en alkoholservett.
4. Fortsätt att utföra en svans ven injektion och injicera 100 μL av cellsuspensionen. 5 min efter injektionen, Placera musen i en CO₂ kammare och påbörja den dödshjälp normalförfarande (som disposition av ert utskott för institutionella djurvård). Cervikal dislokation bör inte användas som ett medel för dödshjälp eftersom förfarandet skadar luftstrupen.
5. När musen är euthanized, börja förbereda LAF för insufflation av mus lungan med lösningen agaros/en-media. Inom LAF, upprätta en arbetsplats med din sterila pad. På den här plattan kommer att du placera din steriliserade instrument, IV kateter, IV filändelsen set och gravitation perfusion apparater (se kompletterande Figur1).
6. Placera musen i dorsala recumbancy. Med sterila liten sax, noggrant dissekera ut bröstbenet att exponera brösthålan. Var noga med att inte punktera lungan eftersom en agaros/en-media lösning kommer att användas till insufflate lungan.
7. När dissekera ut bröstbenet, dissekera luftstrupen förbi bröstkorg inloppet på båda sidor. Avslöja luftstrupen genom att dissekera bort omgivande mjukdelar.
8. Hål i luftstrupen med en 20 gauge IV kateter. Löst knyt en kirurgisk Knut med steril katgut suturen runt kanylerade luftstrupen.
9. Fäst en IV utbyggnaden set från kateteriserade luftstrupen till 10 mL sprutan av gravitation perfusion apparater.
10. Kombinera de pre värmde 37 ^oC agaros (5 mL) och en-media (5 mL) i en 1:1 blandning. Häll flytande agaros/en-media lösningen i 10 mL sprutan av gravitation perfusion enheten. Innan insufflation av lungorna med agarosgelelektrofores/en-media lösning, se till att hela längden av den förlängning som man värdesätter med agarosgelelektrofores/en-media, därmed motverkar oavsiktlig insufflation av lung prover med luft.
11. Fyll lungorna agaros/en-media lösningen tills lungan är fullt insufflated.
12. När lungan är fullt insufflated, ta bort kanylen och binda fast kirurgisk Knut att förhindra läckage av agarase/en-media lösningen genom luftstrupen.
13. Fortsätt att dissekera ut mod (luftstrupe, hjärta och lunga) från brösthålan. Var noga med att inte punktion eller skada ytan av lungan.
14. Plats plocka (i ingen särskild orientering) i förväg kylda 30 mL PBS kompletteras med 1 X penna/strep och låta agaros/en-media att stelna i 20 min.
15. Använda fina sax och pincett, skär små bitar av lungan (3 x 1,5 mm) som visas i figur 1A. Mindre lung skivor kan avbildas enkelt med ett 2,5 X-objektiv. Flera segment kan skäras per experimentella tillstånd, vanligen 4-10 skivor per grupp.
    Obs: För varje experimentell grupp, placera lung skivor i en separat brunn (6-well platta) som innehåller en 2 x 2 cm gelatinsvamp pre indränkt i B-media. Mängden media per brunn bör vara 1,5 mL. Ändra media varje 2-3 dagar. För läkemedlet studier är frekvensen av ändra media/drogen användaren bestäms.

3. Widefield fluorescens avbildning av Lung skivor och analys

Obs: För widefield fluorescens imaging, mindre skivor skärs (3 x 1,5 x 1 mm) för att passa 1 bild med ett 2,5 X-objektiv avsnittet lung.

Bild förvärv på widefield fluorescens Mikroskop:

1. Lung skivor är normalt avbildas på 0, 3, 7 och 14 dagar efter injektion. I den sterila miljön av biologiska skåpet, noggrant överföra lung skivor från gelatin svampar till en steril 35 mm glas-botten runt skålen. Var noga med för att badda bort överflödig vätska från det lung-segmentet som överflödig vätska kommer att fungera som en spegel och återspegla fluorescerande ljus som kommer från tumörcellerna.
2. Ordna lung skivor på ett liknande sätt som avbildas i figur 1A. Varje kolumn skulle representera olika experimentella villkor. Var noga med att inte cross-förorena lungorna med pincetten. Skölj med 70% etanol och torka innan du hanterar lung skivor från en annan experimentell grupp.
3. Optimera parametrarna imaging (dvs. viktökning, offset, exponering tid, binning) som ger den bästa kontrasten mellan fluorescerande tumörceller och bakgrunden lungvävnad i kontrollen (fordon obehandlad) grupp. Använd samma parametrar från kontrollgruppen till bild de experimentella grupperna. Spara som tiff bild-format.
4. En skala referens, ta en digital bild av en mikrometer på samma mål.
5. Eftersom lung auto-fluorescens förändringar över tid, måste tänkbar parametrarna justeras till kontroll lungorna varje bildsession. Imaging parametrarna för en session kan inte nödvändigtvis vara optimal för efterföljande imaging sessioner.

Bildanalys:
Obs: Följande bild bearbetningssteg görs med ImageJ 1.51h programvara paketet ¹⁷.

1. Öppna en bildfil i ImageJ (figur 3A).
2. Subtrahera bakgrunden: Process > subtrahera bakgrunden > rullande boll radie (börja med 50 pixlar), avmarkera ”ljus bakgrund” (figur 3B).
3. Konvertera bilden till 8-bitars format: bild > typ > 8 - bitars (figur 3 c).
4. Ställa in enheter till pixlar: bild > Enter ”pixlar” i enheten av längden, anger du 1 i ”pixelbredd”, ”pixelhöjd”, ”Voxel djup”. Kryssrutan ”Global” gälla för efterföljande bilder.
5. Med Polygon markeringsverktyget, beskriver formen på hela lungan slice och Bestäm arean (pixel²) för det totala lung segmentet. Detta värde används för att beräkna procent tumör bördan av lungan.
6. Tröskelvärdet bild: bild > Justera > tröskel > Markera ”standard” och ”B & W” > Använd skjutreglaget till tröskel bilden så att majoriteten av tumörceller markeras korrekt. Att trycka på ”Apply” kommer att resultera i en svartvit bild där lungan är helt svart, och de fluorescerande lesionerna är vita (figur 3D). Att trycka på ”Apply” en andra gång kommer att invertera bilden där alla fluorescerande strukturer är nu svart former (figur 3E).
7. Kvantifiering av antal och form av lesioner:
   Analysera > Ange mått > Kontrollera ”område”. Avmarkera alla andra lådor.
   Analysera partiklar > storlek (pixel²): 0-oändlighet representerar spänna av former som ImageJ kommer att numrera. Empiriskt bestämma minsta lesionen som anses vara en enda tumör cell i dag 0 fordonet bilder. Använda området för denna enda tumör cell som den nedre gränsen för de återstående bilderna i datauppsättningen. För det arbete som presenteras i detta papper, är 11 pixel² inställd som den nedre gränsen. För det arbete som presenteras i exemplet video, är 24 pixel² inställd som den nedre gränsen. Lämna ”cirkulär” utbud som 0-1. ”Visa” kan ställas in på ”ingenting”. Alternativt om ”Visa” och ”konturer” är markerad, skapas en ritning av alla konturerade former. Kolla ”Visa resultat” för ett separat fönster mätningar att dyka upp. Eventuellt sparas med ”Lägg till manager” rutan är markerad alla former kvantifieras till en ROI manager, som kan sparas för framtida referens. Efter att trycka på OK, fönster ett ”resultat” upp som innehåller alla uppräknade former och området mätningar (figur 3F).
8. Kopiera och klistra in data från fönstret ”resultat” i ett kalkylblad. Använd matematiska funktionen Summa i Excel summera alla områden i de metastatiska lesionerna för att särskilt lung segment. För att bedöma procent lung tumör bördan av lung segment, dividera summan av metastatiska lesioner områdena av det sammanlagda området av lung segmentet. Denna parameter är också känd som området fraktion (en_A) som beskrivs ytterligare av Underwood ¹⁸.
   Lung tumör börda = summan av metastaserande områden/totala lesionsområdet lung slice
9. Beräkna den lung tumör bördan för resten av avsnitten lung i kontrollgruppen och resterande grupper. Rita den genomsnittliga lung tumör bördan per grupp över 0, 3, 7 och 14 dagar. Representant widefield fluorescerande bilderna av höga och låga metastaserande mänskliga OS celler växer i PuMA modellen vid progressiv tidpunkter visas (figur 4A). Ett linjediagram Visar den-faldig förändring (normaliserad till dag 0) procent metastaserande tumör börda över tid visas (figur 4B).

4. confocal fluorescens avbildning av PuMA modellen

Obs: För confocal imaging, vävnad behandling är liknande den i föregående avsnitt förutom att större lung skivor skärs (komplett tvärgående avsnitt, 1-2 mm tjock) för att möjliggöra mer ROIs att avbildas.

Märkning av lungparenkym med DAR4M:

1. Fördjupa lung skivor i 10 μμM av DAR4M (i HBSS) för 45 min vid 37 ° C. DAR4M etiketter reaktivt kväve arter inom celler i lungan.
2. Efter 45 min inkubering, skölj lung skivor med färska HBSS.
3. Placera lungcancer segmentet i en 35 mm glas-botten runt skålen, och bilden på confocal mikroskopet.
4. Imaging parametrarna för exempel bilderna visas i figur 5 listas i tabell 5.
5. Förvärva en Z-stack för en region av intresse. Använda föreslagna Z slice tjockleken för Nyquist provtagning. En representativ film av en 3D stapel visar grön fluorescerande OS celler i DAR4M-märkt lungorna finns i film 1 och kompletterande film 1.

För exempel confocal bilderna visas i figur 5, var bildsession terminal. Om längsgående imaging krävs, rekommenderas användning av 2-foton eller flera photon utrustat confocal LSM Mikroskop för avbildning eftersom det finns mindre photodamage till levande vävnader^19,20.
Imaging mito-RFP uttrycker MG63 celler i PuMA modellen:

1. Utföra protokollet PuMA som disposition i steg 1 och 2 med MG63 celler som uttrycker den mito-RFP konstruktion.
2. Placera lungcancer segmentet i en 35 mm glas-botten runt skålen, och bilden på confocal mikroskopet.
3. Imaging parametrarna för exempel bilderna visas i figur 6 visas i tabell 6. En representativ film av en 3D stapel visar grön fluorescerande OS celler med röd fluorescerande mitokondrier finns i film 2 och kompletterande film 2.

Representative Results

Låg-förstoring widefield fluorescensmikroskopi

För widefield fluorescensmikroskopi av PuMA lung skivor visas representativa bilder och kvantifiering data i figur 2 c, och figur 4A och B. De metastaserad böjelser för höga och låga metastaserande cellinjer är visuellt uppenbara över progressiva tidpunkter. MNNG celler kan effektivt kolonisera lungvävnad medan HOS celler inte kan växa alls. Bildanalys, kan kvantitativa data erhållas för att bedöma tillväxt över tid som visas i diagrammet i figur 4B. Anskaffningsvärde vid låg förstoring (2,5 X) är att föredra för att fånga hela lungan segmentet i en bild. Denna metod tillåter batch avbildning av ett stort antal PuMA skivor.

Hög förstoring confocal fluorescensmikroskopi

För konfokalmikroskopi PuMA lung skivor visas representativa bilder i figur 5. Enskilda andra-uttryckande MG63 celler kan ses i figur 5A i förhållande till lungparenkym, som är märkt av den DAR4M fluorescerande färgämnen i figur 5B. En sammanslagen bild visas i figur 5 c, och en zoomad bilden av en fluorescerande tumör cell i ett fartyg visas i figur 5 d. 3D filmer av figur 5 c och 5 D visas i film 1 och kompletterande film 1, respektive. Confocal imaging subcellulära strukturer såsom mitokondrierna visas i figur 6. Cytosoliska andra-uttryck tillåter disposition tumörcellerna i figur 6A, och mitokondrierna märkt med RFP visas i figur 6B. En sammanslagen bild ses i figur 6 c. 3D filmer av figur 6 c visas i film 2 och kompletterande film 2. Imaging subcellulära strukturer såsom mitokondrier kan kombineras med andra fluorescerande etiketter att studera organell biologi i metastaserande OS celler. När du lägger till fler etiketter, säkerställa att laserlinjerna och utsläpp filter är kompatibel med viss fluorophore/fluorescerande proteinet av intresse. Undvika imaging fluorophores/fluorescerande proteiner vars excitation och utsläpp spectra nära överlappning.

Figur 1 : Diagram som illustrerar metastaserande kaskad. Metastaserande kaskad kan delas upp i flera, hastighetsbegränsande stegen. (1) metastaserande tumör celler lämnar webbplatsen primärtumör och invaderar in lokala parenkymet; (2) tumör celler intravasating i blod/lymfatiska kärl och transitering inom cirkulationen; (3) tumör cell gripandet på den sekundära platsen; (4) tumör cellen extravasering ut från mikrocirkulation och överlevnad i den sekundära platsen; (5) tillväxt i micrometastases; (6) tillväxt i vaskulariserad overt metastaserande tumörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Imaging PuMA lung skivor använder widefield fluorescens och confocal fluorescence mikroskopi plattformar. (A) exempel PuMA skivor visas i en glas-botten 35 mm maträtt. (B) confocal Mikroskop utrustning. (C) exempel låg förstoring-bild av en PuMA skiva med andra-uttryck OS celler. Scalebar = 0,5 mm. (D) exempel confocal bilden av en underregion PuMA bitens. Scalebar = 100 μm. (*) Lungparenkym är märkt röd av DAR4M (se infälld) och (∇) peka på andra-uttryckande MG63 celler. Scalebar = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 . Bearbetning av en låg förstoring bild av en PuMA segment med ImageJ. (A) PuMA originalbilden. (B) subtraktion av bakgrund. (C) konvertering till en 8-bitars bild. (D) tröskelvärde bilden Markera fluorescerande tumörceller. (E) inversion av bilden. (F) uppräkning av diskreta former och kvantifiering av formområden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 . Låg-förstoring seriell bilder visar tillväxten av högt och lågt metastaserande mänskliga OS celler i PuMA modellen över tiden. (A) seriell bilder av mycket metastaserande MNNG och låg metastaserande HOS celler visas på 0, 3, 7 och 14 dagar efter injektion. MNNG celler kan växa bättre i den lung närmiljön i motsats till HOS cellerna. Scalebar = 1 mm. (B) faldig förändring i procent metastaserande tumör börda för MNNG och HOS celler över tiden visas som linje grafer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : Konfokalmikroskopi DAR4M-märkt PuMA lung bitens. En representativ confocal bild av andra-uttryckande MG63 celler i PuMA lungvävnad märkt med DAR4M. (A) gröna kanalen visar andra-uttryckande MG63 celler (∇). (B) röda kanalen visar DAR4M färgämnet bindande till reaktiva kväve arter i parenkymet lungceller. Färgämnet belyser lungparenkym (#), och strukturer som liknar ett blodkärl (*). Kanten av PuMA lung avsnitt är betecknas (↓). (C) sammanfogad grön och röd bild. Scalebar = 100 μm. (D) en zoomad bild av den streckade vita rutan (från C) visar en tumör cell i ett fartyg. Scalebar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 : Konfokalmikroskopi av mitokondrier i osteosarkom celler i PuMA modellen. En representativ confocal bild av mitokondrier i andra-uttryckande MG63 celler. (A) gröna kanalen visar andra-uttryckande MG63 celler (∇). (B) röda kanalen visar på RFP lokaliserad till mitokondrierna (*). (C) sammanfogad grön och röd bild. Scalebar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kultur Media	Recept
Komplett Media (500mL)	•440 mL DMEM
	•50 mL FBS
	•5 mL 10 X penna/strep lösning (10000U/mL)
	•5 mL L-glutamin (200 mM)
A-Media (250mL)	•177.58 mL sterilt vatten
	•50 mL 10 X M-199 media
	•15 mL 7,5% natriumbikarbonatlösning
	•2.25 mL 50 mM hydrocortizone
	•125 mL 0,4 mg/ml retinol acetat (i sterilt vatten)
	•5 mL 10 X penna/strep lösning (10000U/mL)
	•50 mL 10mg/ml bovint insulin
B-media (500ml)	•427.6 mL sterilt vatten
	•50 mL 10 X M-199 media
	•15 mL 7,5% natriumbikarbonatlösning
	•2.25 mL 50 mM hydrocortizone
	•125 mL 0,4 mg/ml retinol acetat (i sterilt vatten)
	•5 mL 10 X penna/strep lösning (10000U/mL)
	•50 mL 10mg/ml bovint insulin

Tabell 1. Recept för komplett Media, A-media, B-media. Recept för cellodling och media för PuMA analysen listas.

Cell kultur reagenser	Beskrivning	Katalog nr.	Företaget
MNNG-HOS	Mycket metastaserande OS cellinje	CRL-1547	ATCC
HOS	dåligt metastaserande OS cellinje	CRL-1543	ATCC
MG63.3	Mycket metastaserande OS cellinje	EJ TILLÄMPLIGT	Amy LeBlanc laboratorium (NCI)
MG63	dåligt metastaserande OS cellinje	CRL-1427	ATCC
10 X M199 media	Base media för en-media och B-media	11825015	Thermofisher
Destillerat vatten (steriliserad)	Komponent A-Media &	15230-147	Thermofisher
	B-media
7,5% natriumbikarbonatlösning	Komponent A-Media &	25080094	Thermofisher
	B-media
Hydrocortizone	Komponent A-Media &	H6909	Sigma-Alrich
	B-media
Retinol acetat-vatten soluable	Komponent A-media & B-media	R0635 - 5MG	Sigma-Alrich
Penicillin/Streptomycin 10 X koncentrerad (10000 U/ml) lösning	Komponent A-Media &	15140122	Thermofisher
	B-media, komplett media
Bovint insulin lösning (10mg/ml)	Komponent A-Media &	I0516 - 5ML	Sigma-Alrich
	B-media
DMEM, hög glukos	Base media av komplett Media	11965092	Thermofisher
L-glutamin (200 mM)	Komponent i komplett Media	25030081	Thermofisher
Fetalt bovint Serum	Komponent i komplett Media	16000044	Thermofisher
Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning	Används i cellkultur	14190144	Thermofisher
Hanks buffrade salter lösning, inga kalcium, ingen magnesium, ingen fenolrött	Används för att resuspendera cellpelleten före injektion	14175095	Thermofisher
Trypsin-EDTA (0,25%), fenolrött	Används i cellkultur	25200114	Thermofisher
DAR4M	Används för att märka lungparenkym	ALX-620-069-M001	Enzo

Tabell 2. Cell kultur reagenser för en-media, B-media, och slutföra media. Komponenter för media recept, reagenser och buffertar listas med katalog nummer och företag namn.

Material	Beskrivning	Katalog nr.	Företaget
Zeiss 710 Confocal LSM	Upprätt LSM confocal mikroskopet	EJ TILLÄMPLIGT	Zeiss
Zeiss 780 Confocal LSM	Inverterad LSM confocal mikroskopet	EJ TILLÄMPLIGT	Zeiss
SCID möss	NICKA. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, Kvinna, ålder 6-8 veckor	EJ TILLÄMPLIGT	Charles River
GelFoam	Används som stöd för lung vävnadssnitt	59-9863	Harvard apparater
SeaPlaque agaros	Används under insufflation av lungan	50100	Lonza
1 ml spruta med 27 gauge nål	Används för svans ven injektion		Fisherscientific
		14-826-87
10 ml spruta	Används för insufflation av lungan	309604	BD
20 gauge kateter	Används under insufflation av lungan	SR-OX2032CA	Terumo
Abbott IV Förlängningssats (30 ”, steril)	Används under insufflation av lungan	8342	Medisca
Spritkompresser	För avtorkning svans ven före injektion	326895	BD
Sterila kirurgiska handskar	Asceptic inlämning av mus lungor	Varierar med storlek	Fisherscientific
30 cm linjal	Används för insufflation av lungan		Staples
Stöd stativ för linjalen	Används för insufflation av lungan	HS29022A	Pipette.com
35 mm glasbotten kultur maträtt	Används vid avbildning av lung skivor	81158	Ibidi
Absorberande underlägg med vattentät fuktspärr	Brukade linje sterila arbetsområdet i biologiska huven	56617-014	VWR
Katgut oformaterad resorberbar sutur	Används för att binda kanylerade luftstrupen	EJ TILLÄMPLIGT	Braun

Tabell 3. Material för PuMA. Material som krävs för protokollet PuMA listas med katalog nummer och företag namn.

Material	Beskrivning	Katalog nr.	Företaget
Micro dissekera sax 3,5-tums rak Sharp/Sharp	För skärande lung sektioner	RS-5910	Roboz
4 ”(10 cm) lång tandad rak Extra delikat 0,5 mm spets	För att manipulera/innehav lung sektioner	RS-5132	Roboz
4 ”(10 cm) lång tandad svag kurva 0,8 mm spets	För att manipulera/innehav lung sektioner	RS5135	Roboz
Thumb Dressing tången; Tandade; Delikat; 4,5 ”längd; Bredd 1,3 mm spets	För allmänna dissektion	RS-8120	Roboz
Thumb Dressing pincett 4,5 ”Serrated 2,2 mm spets bredd	För allmänna dissektion	RS-8100	Roboz
Extra fin mikro Dissecting sax 3,5-tums rak Sharp/Sharp, 20mm blad	För allmänna dissektion	RS-5880	Roboz
Knapp sax; Rakt; Sharp-Blunt; 27mm Bladlängd; 4 ”Totallängd	För allmänna dissektion	RS-5960	Roboz

Tabell 4. Kirurgiska instrument för PuMA. Olika rostfria instrument som används i protokollet anges med katalog nummer och företagets namn.

Parametrar	488 laser	561 laser
mål	Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27
makt	2%		2%
Pixel dwell	1,61		1,61
Genomsnitt	0		0
Zooma	1		1
Master vinst	820		814
Digitala vinst	1		0,51
Digital offset	-4,5		-9.24
Pinhole	51		57
Avstämbara Filter	496-553		570-618

Tabell 5. Parametrar för confocal avbildning av DAR4M-märkta PuMA sektioner. Specifika bildparametrar brukade erhålls confocal bilder i det aktuella papperet finns i tabellen.

Parametrar	488 laser	561 laser
mål	Plan-Apochromat 63 x / 1,40 olja DIC M27
makt	2%		2%
Pixel dwell	0,6		0,6
Genomsnitt	2 (linje)		2 (linje)
Zooma	2.3		2.3
Master vinst	449		390
Digitala vinst	1		1.23
Digital offset	0		0
Pinhole	136		136
Avstämbara Filter	493-550		566-703

Tabell 6. Parametrar för confocal avbildning av mitokondrier MG63 celler i PuMA sektioner. Specifika bildparametrar brukade erhålls confocal bilder i det aktuella papperet finns i tabellen.

Kompletterande Figur1: Gravity perfusion apparater. Gravitation perfusion apparaten används för att insufflate lungan med en flytande agaros/en-media lösning på 20 cm H₂0 hydrostatiska trycket. Agaros/en-media lösningen hälls i 10 mL sprutan, som fästas av IV förlängning anges till kanylerade luftstrupen (visas inte). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Film 1: Rotation en 3D confocal z-stack bild av andra-uttryckande OS celler i ett DAR4M-märkt PuMA lung segment. DAR4M (röd kanal) används för att belysa lungparenkym och andra-uttryckande MG63 celler kan ses (gröna kanalen). Scalebar = 100 μm. Vänligen klicka här för att hämta detta move.

Movie 2: Rotation av en 3D confocal z-stack bild av RFP-märkt mitokondrier i andra-uttryckande OS celler i PuMA modellen. Subcellulär organeller som mitokondrier visas märkta med RFP (röd kanal) i andra-uttryckande MG63 celler (grön kanal) i PuMA-modellen. Scalebar = 10 μm. Vänligen klicka här för att hämta detta move.

Kompletterande film 1: zoomad 3D-film av en metastaserande OS cell i ett fartyg i lungan. En andra-uttryckande MG63 cell visas i fartyg inom det lung mikromiljö. Scalebar = 30 μM. Vänligen klicka här för att hämta detta move.

Kompletterande Movie 2: zoomad 3D-film av mitokondrier i en metastaserande OS cell i lungan. Mitokondrier märkt med RFP visas i MG63 celler i de lung mikromiljö. Scalebar = 5 μM. Vänligen klicka här för att hämta detta move.

Discussion

Följande tekniska artikel beskriver några praktiska aspekter av PuMA modellen studera lungcancer kolonisationen i OS. Vissa kritiska steg i protokollet där forskare bör vara extra försiktig inkluderar följande:

(a) kanylering av luftstrupen. Luftstrupen kan lätt skadas medan dissekera den omgivande muskler och bindväv. Nålen på katetern kan dessutom enkelt skjutas genom luftstrupen. Ägna stor uppmärksamhet åt hur avfasningen nålspetsen kommer in till luftstrupen när du sätter kanylen.

(b) punktera eller skada ytan av lungan. Lungan kan lätt punkteras eller skadad med dissekera saxen samtidigt ta bort bröstbenet och utsätta brösthålan. Var försiktig när du dissekera ut plocka från brösthålan. Punktera eller skada ytan av lungan kommer att orsaka den flytande agaros/en-media att läcka ut och lungan kommer att vara tömd.

(c) bort överflödigt media från lungan sektioner medan imaging. Överskjutande flytande media kring avsnittet lungan kan orsaka en ”spegel”-effekt när de ses under mikroskop. Den överflödig vätskan kan återspegla fluorescerande ljus från tumörcellerna därmed överdriver fluorescens området i bilden. Borttagning av överflödig media vätska kommer att förhindra denna artefakt i bilden. Alternativt, den bild artefakten kan tas bort under efterbehandling av bilderna.

(d) Photodamage i levande vävnader. När du använder en kvicksilver lampa eller lasrar på 1-photon Mikroskop, var noga med att begränsa den tid som utsätts för ljus. Intensitet/power andelen ljuskällan kan också minskas. Överexponering för ljuskällan kan orsaka photodamage till lungorna. Mikroskop utrustad med lysdioder (LED) eller 2-photon/multi-photon Mikroskop skulle vara perfekt eftersom de producerar mindre åldrad hud under längsgående imaging studier.

PuMA modellen kan anpassas och modifieras för att studera många aspekter av lung colonization processen. En annan variant av detta ex vivo -tillvägagångssätt beskrivs av van den Bijgaart och kollegor ²¹. För studier rekommenderas undersöker effekterna av genen knock-down eller anti metastaserande drog aktivitet på tumör celltillväxt i lungan, skalning tillbaka antalet celler injiceras från 5 x 10⁵ till 3 x 10⁵ eftersom effekterna av ingripande kan maskeras under den exponentiella tillväxten av en större cell innoculum. Flera studier har använt PuMA modellen för att studera drivrutiner lung metastasutvecklingen ^{4,5,8,22,23,24}. Olika fluorescerande indikator färgämnen eller fluorescerande reporter gener kan användas till etikett tumörceller för att fastställa förändringar i cell fysiologi eller gen uttryck ⁸ i den lung mikromiljö.

En begränsning av PuMA modellen innehåller ett begränsat antal kompatibla cellinjer. De etablerade cellinjer som är kompatibel med denna analys är listade efter Mendoza och kollegor ³ . För höga och låga metastaserat osteosarkom cellinjer, följ parar av närbesläktade cellinjer har visat sig växa och bibehålla deras metastaserande benägenhet i PuMA modellen: mänskliga MG63.3 & MG63 celler, MNNG & 143B och HOS celler, murina K7M2 och K12 celler. Forskare måste empiriskt bestämma huruvida deras cellinjer kan förbli livskraftig i B-media. En annan begränsning att överväga är den begränsade tid lungvävnad kan upprätthållas i vitro. Lungvävnad kan behålla dess cellulära komponenter för 30 dagar, efter denna tidpunkt och de cell-delarna av lungan börjar dö ut. Därför studerar samspelet mellan tumörceller och lung stromaceller bör inte överstiga 30 dagar.

PuMA modellen ger en oöverträffad metod för att studera hur metastaserande OS celler kolonisera lungvävnad. Det mest uppseendeväckande med PuMA modellen kommer från det faktum att flera låga metastaserande OS cellinjer (HOS, MG63, K12), vars in-vivo -fenotyper har präglats någon annanstans ²⁵, inte kan växa i PuMA-modellen. Däremot har närbesläktade mycket metastaserande OS celler (MNNG, MG63.3, K7M2) en större benägenhet att kolonisera lunga vävnad i vivo²⁵ och i PuMA modell. Detta tyder på att cellulära och extracellulära komponenterna i den lung närmiljön som hindrar låg metastaserande OS cellinjer från växer i vivo, fortfarande upprätthålls i PuMA modellen trots avsaknaden av blodflödet. Med andra ord, utövar de lung mikromiljö av PuMA modellen fortfarande en ”selektionstryck” som förhindrar låg metastaserande OS celler växer i lungan. Faktiskt, studerar hög metastaserande OS celler växer i PuMA har varit användbara för att identifiera nya molekylära drivrutiner av metastaserande fenotyp ^4,5. Dessutom genetiska down-modulering av nämnda målen i mycket metastaserande celler visade sig minska metastaserande kapacitet i både PuMA modellen och i vivo ⁵. För kandidat anti metastaserande drog studier, PuMA modell kan användas för att avgöra vilka koncentrationsintervall kan minska metastaserande utväxt i lungan vävnader, som i sin tur kan då vara validerade i vivo.

Framtida tillämpningar av denna modell bör utnyttja uppsjö av kommersiellt tillgängliga fluorescerande färgämnen och reporter gener för att gräva djupt i de grundläggande biologin av OS metastaser progression. Fluorescerande färgämnen som 2', 7' - dichlorofluorescin diacetat eller dihydroethidium kan exempelvis användas för att bedöma redox tumörceller i PuMA-modellen. Fluorescerande reporter gener kan användas för att studera organell biologi eller bedöma arrangören aktivitet för att avgöra vilka signalvägar aktiveras i mycket metastaserande OS celler under koloniseringen. Sådana metoder kan användas för att visualisera om en läkemedelsbehandling har aktivitet i tumörceller som växer i lungan. Fluorescerande mikroskopi plattformar som producerar mindre photodamage till vävnader, såsom LED-utrustade Mikroskop eller 2-photon/multiphoton confocal Mikroskop, kan användas för studera hur metastaserande OS celler migrerar och invadera hela lungvävnad. Dessutom kan vidhäftning interaktioner mellan tumörceller och lung stromaceller övervakas med fluorescerande reporter gener.

För att sammanfatta, diskuterar det nuvarande papperet de praktiska aspekterna av PuMA modell, först utvecklades av Mendoza och kollegor ³. Ett exempel för att använda låg-förstoring, widefield fluorescensmikroskopi och hög upplösning konfokalmikroskopi för att bedöma tillväxten av höga och låga metastaserande mänskliga OS celler visas. Flera kritiska steg i protokollet har beskrivits. Dessutom har fördelar och begränsningar av PuMA modellen diskuterats. Framtida tillämpningar av PuMA modellen att studera lungcancer colonization processen har lagts fram, och förhoppningen är att denna modell kommer att ha en bredare användning i osteosarkom forskarsamhället.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	highly metastatic OS cell line
HOS	ATCC	CRL-1543	poorly metastatic OS cell line
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	N/A	highly metastatic OS cell line
MG63	ATCC	CRL-1427	poorly metastatic OS cell line
10X M199 media	Thermofisher	11825015	Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized)	Thermofisher	15230-147	Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution	Thermofisher	25080094	Component of A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution	Thermofisher	15140122	Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose	Thermofisher	11965092	Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum	Thermofisher	16000044	Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Thermofisher	14190144	Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red	Thermofisher	14175095	Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermofisher	25200114	Used in cell culture.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Used to label lung parenchyma.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Inverted LSM confocal microscope
SCID mice	Charles River	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle	Fisherscientific	14-826-87	Used for tail vein injection.
10 ml syringe	BD	309604	Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter	Terumo	SR-OX2032CA	Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile)	Medisca	8342	Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs	BD	326895	For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves	Fisherscientific	Varies with size	Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler	Staples		Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler	Pipette.com	HS29022A	Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish	Ibidi	81158	Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014	Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	Used to tie off cannulated trachea.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip	Roboz	RS-5132	For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip	Roboz	RS5135	For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width	Roboz	RS-8120	For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width	Roboz	RS-8100	For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade	Roboz	RS-5880	For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length	Roboz	RS-5960	For general dissection.