الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية
Summary
والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
Abstract
فحص الرئة ورم خبيث (PuMA) هو نظام الثقافة الخلية المغلقة تسمح للباحثين لدراسة بيولوجيا الاستعمار الرئة في أوستيوساركوما (نظام التشغيل) بالفحص المجهري الأسفار و السابقين فيفو اكسبلانت الرئة. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً للبروتوكول، ويناقش أمثلة للحصول على بيانات الصورة في النمو المنتشر باستخدام ويديفيلد أو منصات مجهرية الأسفار [كنفوكل]. مرونة طراز بوما يسمح للباحثين لدراسة ليس فقط نمو الخلايا OS في المكروية الرئة، ولكن أيضا تقييم آثار العلاجات المضادة المنتشر على مر الزمن. مجهرية [كنفوكل] يسمح للتصوير لم يسبق لها مثيل، والاستبانة تفاعلات الخلية OS مع حمة الرئة. وعلاوة على ذلك، عندما طراز بوما يقترن بالأصباغ الفلورية أو الصحفيين الجينية بروتين فلوري، يمكن دراسة الباحثين المكروية الرئة والهياكل الخلوية وسوبسيلولار، ووظيفة الجينات ونشاط المروج في الخلايا المنتشر من نظام التشغيل. يوفر طراز بوما أداة جديدة للباحثين osteosarcoma اكتشاف جديد ورم خبيث البيولوجيا وتقييم نشاط رواية العلاجات المضادة المنتشر، مستهدفة.
Introduction
لا يزال تحسين النتائج للأطفال المرضى مع osteosarcoma المنتشر (OS) حرجة غير الملباة سريرية 1. وهذا يؤكد أهمية تطوير علاجات جديدة تستهدف جزيئيا. يجب أن تستهدف تشريعات التقليدية أن انتشار الخلايا السرطانية الهدف لم يثبت أن تكون فعالة في علاج المرض المنتشر، وهكذا رواية استراتيجيات عملية المنتشر نفسه 2. المادة الحالية تتناول الجوانب العملية لنوع جديد نسبيا من السابقين فيفو الرئة ورم خبيث النموذجي، مقايسة خبيث الرئوية (PuMA) وضعتها ميندوزا والزملاء3، الذي يوفر أداة مفيدة في اكتشاف جديد الجزيئية من السائقين في الرئة ورم خبيث تطور في نظام التشغيل 4،5. قبل المتابعة، ومع ذلك، فإنه سيكون من الحكمة أن أتطرق بإيجاز إلى العديد من النماذج الحالية لورم خبيث، وكيف طراز بوما يوفر العديد من المزايا على مدى التقليدية في المختبر فحوصات.
النماذج التجريبية الأكثر المستخدمة لدراسة ورم خبيث تتألف من نظم في المختبر و في فيفو أن الخص خطوة معينة أو عدة خطوات لتتالي المنتشر. وتشمل هذه الخطوات: 1) ورم الخلايا المهاجرة بعيداً عن الورم الرئيسي، 2) إينترافاسيشن إلى السفن القريبة (الدم أو اللمفاوية) والعبور داخل الدورة الدموية، 3) إلقاء القبض على الموقع الثانوي، 4) التسرب والبقاء على قيد الحياة في موقع ثانوي، 5) تشكيل ميكروميتاستاسيس، و 6) النمو إلى الانبثاث فاسكولاريزيد (الشكل 1). يمكن أن تتضمن نماذج في المختبر من ورم خبيث ثنائي الأبعاد (2D) الهجرة وثلاثي الأبعاد (3D) فحوصات غزو ماتريجيل التي تستعرض بالتفصيل في أماكن أخرى 6. للنماذج في فيفو ، نظامان النموذجية المستخدمة عادة تشمل: 1) هو نموذج خبيث عفوية أورثوتوبيكالي حقن نوع أنسجة محددة لتشكيل ورم محلي الذي يلقي تلقائياً الخلايا المنتشر فيها خلايا السرطانية إلى مواقع بعيدة؛ 2) نموذج تجريبي خبيث حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في الأوعية الدموية المنبع للجهاز الهدف. على سبيل المثال، ذيل حقن الوريد لورم الخلايا النتائج في التنمية الرئة الانبثاث5،،من78. وتشمل نماذج خبيث تجريبية أخرى حقن الخلايا السرطانية في الطحال أو الوريد المساريقي العلوي الذي يؤدي إلى تنمية الانبثاث الكبد9،10. -ناقش بالتفصيل الاعتبارات العملية لهذه النماذج في فيفو ولش 11. في فيفو نموذج آخر يستخدم لدراسة ورم خبيث في طب الأطفال الطويلا هو نموذج غرس الورم اختلال الكلي الكلوي مما يؤدي إلى تشكيل الورم المحلية وورم خبيث عفوية إلى 12،الرئتين13. تصور تقنية أكثر من الناحية التقنية شاقة مثل فيديوميكروسكوبي إينترافيتال يمكن مباشرة، في الوقت الحقيقي، التفاعلات بين خلايا السرطان المنتشر وميكروفاسكولاتوري من موقع المنتشر (أي. الرئة أو الكبد) كما وصفها ماكدونالد14 وانتينبيرج15، أو سرطان الخلية التسرب في غشاء تشوريوالانتويك كما وصفت كيم 16.
طراز بوما هو السابقين فيفو، explant أنسجة الرئة، ونظام الثقافة المغلقة حيث نمو الخلايا السرطانية الفلورسنت طوليا يلاحظ عبر الفحص المجهري الأسفار على مدى فترة شهر (انظر الشكل 2 أ). ويجمل هذا النموذج في المراحل الأولى من الاستعمار الرئة (الخطوات من 3 إلى 5) في تتالي المنتشر. بعض المزايا الرئيسية من طراز بوما على النماذج التقليدية في المختبر : 1) أنه يتيح فرصة لقياس نمو الخلايا السرطان المنتشر في المكروية 3D الذي يحتفظ بالعديد من ميزات المكروية الرئة طوليا في فيفو 3؛ 2) من طراز بوما يسمح الباحث لتقييم ما إذا كان ضربة قاضية لعلاج الجينات أو المخدرات مرشح النشاط المضادة المنتشر في سياق المكروية 3D الرئة؛ 3) من طراز بوما يتسم بالمرونة مع أنواع عديدة من الأسفار منصات مجهرية (الشكل 2) مثل ويديفيلد fluorescence مجهرية أو ليزر المسح المجهري [كنفوكل]، وترد أمثلة لكل في الشكل 2 & د، على التوالي. وسوف تناقش هذه المقالة كيفية استخدام طراز بوما للحصول على بيانات التصوير الطولي على النمو المنتشر من البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-إذ يعرب، عن الخلايا البشرية osteosarcoma المنتشر العالية والمنخفضة (مننج ويخدم الخلايا، على التوالي) باستخدام الأسفار ويديفيلد تضخم منخفض. وتناقش أيضا أمثلة من التصوير صبغة فلورسنت التي تسميات حمة الرئة، وبروتين الأحمر نيون الخلايا الوراثية المراسل الذي تسميات الميتوكوندريا في نظام التشغيل في طراز بوما باستخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
Protocol
Representative Results
Discussion
المادة التقنية التالية توضح بعض الجوانب العملية من طراز بوما في دراسة الاستعمار الرئة في نظام التشغيل. فيما يلي بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول بحيث أن الباحثين ينبغي أن تأخذ الرعاية الإضافية:
أ) كانوليشن من القصبة الهوائية. القصبة الهوائية يمكن أن تتلف بسهولة أثناء تشري…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور أرنولفو مندوزا الذي وفر التدريب في تقنية بوما. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نعترف بيليغوز تشاند خانا، سوزان غارفيلد (NCI/المعاهد الوطنية للصحة)، ووسام أباريسيو (وكالة السرطان قبل الميلاد) لتوفير استخدام مجاهر بها أثناء هذه الدراسة. وأيد “البرنامج البحوث الداخلية” “المعاهد الوطنية للصحة”، مركز “بحوث السرطان”، طب الأورام فرع هذا البحث (جزئيا). M.M.L. أيده “المعاهد من البرنامج الصحي الوطني الداخلية زيارة زميل” (جائزة 15335)، وتدعمها حاليا على “جوان باركر زمالة” في “أبحاث ورم خبيث”. P.H.S. معتمد من قبل “مؤسسة مكافحة السرطان في كولومبيا البريطانية”.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
