Summary

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].

Abstract

فحص الرئة ورم خبيث (PuMA) هو نظام الثقافة الخلية المغلقة تسمح للباحثين لدراسة بيولوجيا الاستعمار الرئة في أوستيوساركوما (نظام التشغيل) بالفحص المجهري الأسفار و السابقين فيفو اكسبلانت الرئة. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً للبروتوكول، ويناقش أمثلة للحصول على بيانات الصورة في النمو المنتشر باستخدام ويديفيلد أو منصات مجهرية الأسفار [كنفوكل]. مرونة طراز بوما يسمح للباحثين لدراسة ليس فقط نمو الخلايا OS في المكروية الرئة، ولكن أيضا تقييم آثار العلاجات المضادة المنتشر على مر الزمن. مجهرية [كنفوكل] يسمح للتصوير لم يسبق لها مثيل، والاستبانة تفاعلات الخلية OS مع حمة الرئة. وعلاوة على ذلك، عندما طراز بوما يقترن بالأصباغ الفلورية أو الصحفيين الجينية بروتين فلوري، يمكن دراسة الباحثين المكروية الرئة والهياكل الخلوية وسوبسيلولار، ووظيفة الجينات ونشاط المروج في الخلايا المنتشر من نظام التشغيل. يوفر طراز بوما أداة جديدة للباحثين osteosarcoma اكتشاف جديد ورم خبيث البيولوجيا وتقييم نشاط رواية العلاجات المضادة المنتشر، مستهدفة.

Introduction

لا يزال تحسين النتائج للأطفال المرضى مع osteosarcoma المنتشر (OS) حرجة غير الملباة سريرية 1. وهذا يؤكد أهمية تطوير علاجات جديدة تستهدف جزيئيا. يجب أن تستهدف تشريعات التقليدية أن انتشار الخلايا السرطانية الهدف لم يثبت أن تكون فعالة في علاج المرض المنتشر، وهكذا رواية استراتيجيات عملية المنتشر نفسه 2. المادة الحالية تتناول الجوانب العملية لنوع جديد نسبيا من السابقين فيفو الرئة ورم خبيث النموذجي، مقايسة خبيث الرئوية (PuMA) وضعتها ميندوزا والزملاء3، الذي يوفر أداة مفيدة في اكتشاف جديد الجزيئية من السائقين في الرئة ورم خبيث تطور في نظام التشغيل 4،5. قبل المتابعة، ومع ذلك، فإنه سيكون من الحكمة أن أتطرق بإيجاز إلى العديد من النماذج الحالية لورم خبيث، وكيف طراز بوما يوفر العديد من المزايا على مدى التقليدية في المختبر فحوصات.

النماذج التجريبية الأكثر المستخدمة لدراسة ورم خبيث تتألف من نظم في المختبر و في فيفو أن الخص خطوة معينة أو عدة خطوات لتتالي المنتشر. وتشمل هذه الخطوات: 1) ورم الخلايا المهاجرة بعيداً عن الورم الرئيسي، 2) إينترافاسيشن إلى السفن القريبة (الدم أو اللمفاوية) والعبور داخل الدورة الدموية، 3) إلقاء القبض على الموقع الثانوي، 4) التسرب والبقاء على قيد الحياة في موقع ثانوي، 5) تشكيل ميكروميتاستاسيس، و 6) النمو إلى الانبثاث فاسكولاريزيد (الشكل 1). يمكن أن تتضمن نماذج في المختبر من ورم خبيث ثنائي الأبعاد (2D) الهجرة وثلاثي الأبعاد (3D) فحوصات غزو ماتريجيل التي تستعرض بالتفصيل في أماكن أخرى 6. للنماذج في فيفو ، نظامان النموذجية المستخدمة عادة تشمل: 1) هو نموذج خبيث عفوية أورثوتوبيكالي حقن نوع أنسجة محددة لتشكيل ورم محلي الذي يلقي تلقائياً الخلايا المنتشر فيها خلايا السرطانية إلى مواقع بعيدة؛ 2) نموذج تجريبي خبيث حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في الأوعية الدموية المنبع للجهاز الهدف. على سبيل المثال، ذيل حقن الوريد لورم الخلايا النتائج في التنمية الرئة الانبثاث5،،من78. وتشمل نماذج خبيث تجريبية أخرى حقن الخلايا السرطانية في الطحال أو الوريد المساريقي العلوي الذي يؤدي إلى تنمية الانبثاث الكبد9،10. -ناقش بالتفصيل الاعتبارات العملية لهذه النماذج في فيفو ولش 11. في فيفو نموذج آخر يستخدم لدراسة ورم خبيث في طب الأطفال الطويلا هو نموذج غرس الورم اختلال الكلي الكلوي مما يؤدي إلى تشكيل الورم المحلية وورم خبيث عفوية إلى 12،الرئتين13. تصور تقنية أكثر من الناحية التقنية شاقة مثل فيديوميكروسكوبي إينترافيتال يمكن مباشرة، في الوقت الحقيقي، التفاعلات بين خلايا السرطان المنتشر وميكروفاسكولاتوري من موقع المنتشر (أي. الرئة أو الكبد) كما وصفها ماكدونالد14 وانتينبيرج15، أو سرطان الخلية التسرب في غشاء تشوريوالانتويك كما وصفت كيم 16.

طراز بوما هو السابقين فيفو، explant أنسجة الرئة، ونظام الثقافة المغلقة حيث نمو الخلايا السرطانية الفلورسنت طوليا يلاحظ عبر الفحص المجهري الأسفار على مدى فترة شهر (انظر الشكل 2 أ). ويجمل هذا النموذج في المراحل الأولى من الاستعمار الرئة (الخطوات من 3 إلى 5) في تتالي المنتشر. بعض المزايا الرئيسية من طراز بوما على النماذج التقليدية في المختبر : 1) أنه يتيح فرصة لقياس نمو الخلايا السرطان المنتشر في المكروية 3D الذي يحتفظ بالعديد من ميزات المكروية الرئة طوليا في فيفو 3؛ 2) من طراز بوما يسمح الباحث لتقييم ما إذا كان ضربة قاضية لعلاج الجينات أو المخدرات مرشح النشاط المضادة المنتشر في سياق المكروية 3D الرئة؛ 3) من طراز بوما يتسم بالمرونة مع أنواع عديدة من الأسفار منصات مجهرية (الشكل 2) مثل ويديفيلد fluorescence مجهرية أو ليزر المسح المجهري [كنفوكل]، وترد أمثلة لكل في الشكل 2 & د، على التوالي. وسوف تناقش هذه المقالة كيفية استخدام طراز بوما للحصول على بيانات التصوير الطولي على النمو المنتشر من البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-إذ يعرب، عن الخلايا البشرية osteosarcoma المنتشر العالية والمنخفضة (مننج ويخدم الخلايا، على التوالي) باستخدام الأسفار ويديفيلد تضخم منخفض. وتناقش أيضا أمثلة من التصوير صبغة فلورسنت التي تسميات حمة الرئة، وبروتين الأحمر نيون الخلايا الوراثية المراسل الذي تسميات الميتوكوندريا في نظام التشغيل في طراز بوما باستخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل].

Protocol

وأجريت جميع البروتوكولات الحيوانية التي تم الحصول على بيانات التصوير بالموافقة على “رعاية الحيوان” و “استخدام اللجنة” للمعهد الوطني للسرطان، والمعاهد الوطنية للصحة. كافة البروتوكولات الحيوان ناقش وصورت في المقالة الفيديو أقرتها اللجنة الرعاية الحيوانية في جامعة كولومبيا البريطانية. <…

Representative Results

تضخم منخفض ويديفيلد fluorescence مجهرية بالنسبة ويديفيلد fluorescence الفحص المجهري لشرائح الرئة بوما، تبين الصور التمثيلية وتحديد مقدار البيانات في الشكل 2، و الشكل 4A و ب. المزيف المنتشر لخطو…

Discussion

المادة التقنية التالية توضح بعض الجوانب العملية من طراز بوما في دراسة الاستعمار الرئة في نظام التشغيل. فيما يلي بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول بحيث أن الباحثين ينبغي أن تأخذ الرعاية الإضافية:

أ) كانوليشن من القصبة الهوائية. القصبة الهوائية يمكن أن تتلف بسهولة أثناء تشري…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نشكر الدكتور أرنولفو مندوزا الذي وفر التدريب في تقنية بوما. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نعترف بيليغوز تشاند خانا، سوزان غارفيلد (NCI/المعاهد الوطنية للصحة)، ووسام أباريسيو (وكالة السرطان قبل الميلاد) لتوفير استخدام مجاهر بها أثناء هذه الدراسة. وأيد “البرنامج البحوث الداخلية” “المعاهد الوطنية للصحة”، مركز “بحوث السرطان”، طب الأورام فرع هذا البحث (جزئيا). M.M.L. أيده “المعاهد من البرنامج الصحي الوطني الداخلية زيارة زميل” (جائزة 15335)، وتدعمها حاليا على “جوان باركر زمالة” في “أبحاث ورم خبيث”. P.H.S. معتمد من قبل “مؤسسة مكافحة السرطان في كولومبيا البريطانية”.

Materials

Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS ATCC CRL-1547 highly metastatic OS cell line
HOS ATCC CRL-1543 poorly metastatic OS cell line
MG63.3 Amy LeBlanc Laboratory (NCI) N/A highly metastatic OS cell line
MG63 ATCC CRL-1427 poorly metastatic OS cell line
10X M199 media Thermofisher 11825015 Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized) Thermofisher 15230-147 Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution Thermofisher 25080094 Component of A-media & B-media
Hydrocortizone Sigma-Alrich H6909 Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable Sigma-Alrich R0635-5MG Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution Thermofisher 15140122 Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml) Sigma-Alrich I0516-5ML Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose Thermofisher 11965092 Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM) Thermofisher 25030081 Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum Thermofisher 16000044 Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Thermofisher 14190144 Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermofisher 14175095 Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermofisher 25200114 Used in cell culture.
DAR4M Enzo ALX-620-069-M001 Used to label lung parenchyma.
Name Company Catalog Number Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM Zeiss N/A Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM Zeiss N/A Inverted LSM confocal microscope
SCID mice Charles River N/A NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam Harvard Apparatus 59-9863 Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose Lonza 50100 Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle Fisherscientific 14-826-87 Used for tail vein injection.
10 ml syringe BD 309604 Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter Terumo SR-OX2032CA Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile) Medisca 8342 Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs BD 326895 For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves Fisherscientific Varies with size Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler Staples Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler Pipette.com HS29022A Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish Ibidi 81158 Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier VWR 56617-014 Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture Braun N/A Used to tie off cannulated trachea.
Name Company Catalog Number Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp Roboz RS-5910 For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip Roboz RS-5132 For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip Roboz RS5135 For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width Roboz RS-8120 For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz RS-8100 For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade Roboz RS-5880 For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length Roboz RS-5960 For general dissection.

References

  1. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
  2. Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
  3. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  4. Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
  5. Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
  6. Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
  7. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  8. Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
  9. Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
  10. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  11. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  12. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
  13. El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
  14. MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
  15. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  16. Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
  19. Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
  20. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  21. Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
  22. Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
  23. Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
  24. Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
  25. Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. J. Vis. Exp. (133), e56332, doi:10.3791/56332 (2018).

View Video