Summary

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

Published: March 12, 2018
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Summary

この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS) 細胞の成長の研究に研究を許可します。

Abstract

肺転移アッセイ (プーマ) は、肺植前のヴィヴォと閉じた細胞培養系蛍光顕微鏡による骨肉腫 (OS) で肺を植民地化の生物学を研究する研究者を許可します。この資料では、プロトコルの詳細な説明を提供し、広視野または共焦点蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用して転移の成長上の画像データを得るの例について説明します。プーマ モデルの柔軟性により、肺微小環境の OS 細胞の成長だけでなく研究にも時間をかけて抗転移治療の効果を評価する研究者です。共焦点顕微鏡による肺実質と OS 細胞相互作用の前例のない、高解像度のイメージングが可能です。また、プーマ モデルを蛍光色素や蛍光タンパク質遺伝子記者と組み合わせれば、肺微小環境、細胞および細胞レベル下の構造、遺伝子機能および転移の OS 細胞におけるプロモーター活性研究者の研究することができます。プーマ モデルは、骨肉腫の研究者から新しい転移生物を発見し、新規抗転移、ターゲットを絞った治療法のアクティビティを評価するための新しいツールを提供します。

Introduction

転移性骨肉腫 (OS) の小児患者に対する改善結果重要な満たされていない臨床必要性1が残っています。これは、新しい分子標的療法の開発の重要性を強調します。ターゲット腫瘍細胞の増殖転移性疾患, とこのように新しい戦略の治療に有効であることを証明されていない従来の化学療法は2転移プロセス自体をターゲットする必要があります。現在の記事、メンドーサと同僚3、新しい発見に有用なツールを提供するによって開発された肺転移アッセイ (プーマ)前のヴィヴォ肺転移モデルの比較的新しいタイプの実用的な側面をについて説明しますOS 4,5で肺転移の進行で分子のドライバー。前に、しかし、転移、いくつかの現在のモデルは簡単に触れることが賢明だろう、試金する方法プーマ モデルは従来の in vitroでのいくつかの利点を提供しています。

特定のステップまたは転移の翼列のいくつかの手順を要約の in vitroin vivoの系の転移を研究に使用される最も実験的モデルを構成します。これらの手順が含まれます: セカンダリ サイト、4) 血管外漏出およびセカンダリ サイト、5) 形成の生存で原発腫瘍、2) intravasation から移行して近くの血管 (血液あるいはリンパ管) との循環の中のトランジットに 1) 腫瘍細胞 3) 逮捕微小、および 6) の血管転移 (図 1) に成長。転移のin vitroモデルの 2 次元 (2 D) 移行を含めることができますで検討している 3 次元 (3 D) マトリゲル浸潤アッセイ細部6では別の場所で。生体内でモデルの 2 つの一般的なモデル システムが含まれます: 1)自然転移モデルは、腫瘍細胞ががん転移細胞を自発的に投げかけているローカル腫瘍を形成する特定の組織型に注入遠いサイト;2)実験的転移モデルは、標的臓器の上流血管に腫瘍細胞を注入するところです。たとえば、開発肺転移5,7,8で腫瘍細胞結果の尾静脈注射など。実験的転移の他のモデルには、脾臓や肝臓転移9,10の開発に起因する腸間膜静脈に腫瘍細胞の注入が含まれます。これらの体内モデルの実用的な考慮事項は、ウェルチ11で詳しく説明します。もう一つは、体内の小児肉腫の転移を研究するために使用モデルは、肺12,13ローカル腫瘍形成および自然転移で起因する腎の腎被膜下腫瘍移植モデルです。生体顕微鏡など技術的に厳しい技術直接視覚化に転移性癌細胞と転移巣の微細血管系のリアルタイム相互作用 (すなわち肺や肝臓) マクドナルド14 のとおり。と Entenberg15、または前述の金16漿尿膜にがん細胞浸潤。

プーマ モデルは肺組織植前のヴィヴォ、閉じた文化システム、蛍光腫瘍細胞の成長混入すること縦蛍光顕微鏡による 1 ヶ月の期間にわたって (図 2 a参照)。このモデルは、転移のカスケードの肺植民地化 (手順 3 から 5) の最初の段階を繰り返します。従来の in vitroモデル プーマ モデルのいくつかの主要な利点がある: 1) で縦肺微小環境の多くの機能を保持する 3 D の微小環境の転移性癌細胞の成長を測定する機会を提供しますvivo 3;2) プーマにより候補遺伝子や薬物治療のノックダウンは、3 D 肺微小環境; のコンテキストで抗転移活性を持つかどうかを評価するために研究員3) プーマ モデルは、柔軟性に蛍光顕微鏡プラットフォーム (図 2 b) 広視野蛍光顕微鏡やレーザー走査型共焦点顕微鏡などの多くの種類とそれぞれの例図 2開発、それぞれ。プーマ モデルを使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) の転移の成長に縦の画像データを取得する方法を説明します-表現する、人間の高と低転移性骨肉腫細胞 (MNNG、HOS 細胞それぞれ) を使用して低倍率広視野蛍光。肺実質をラベル蛍光染料と OS 内のミトコンドリアを分類する遺伝のレポーター細胞の共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いたプーマ赤色蛍光タンパク質のイメージングの例についても説明します。

Protocol

画像データが得られた動物のすべてのプロトコルを動物愛護や国立がん研究所の利用委員会、国立衛生研究所の承認を得て行った。説明ビデオの資料に描かれているすべての動物プロトコルは、ブリティッシュ コロンビア大学動物の世話委員会によって承認されています。 1. 注入とプーマのモデルのための材料の腫瘍細胞の準備 注: ソリューション?…

Representative Results

低倍率広視野蛍光顕微鏡 プーマ肺のスライスの広視野蛍光顕微鏡、代表的な画像と定量化データは図 2、および図 4 aとBで示されています。高と低転移細胞の転移の性癖は進行時間のポイントを視覚的に明らかにされます。効率的に、MNNG セルは?…

Discussion

次の技術資料では、OS で肺を植民地化の勉強にプーマのモデルのいくつかの実用的な側面について説明します。研究者が細心の注意を取る必要がありますプロトコルのいくつかの重要なステップは次のとおりです。

) の気管カニューレ装着。気管は、周囲の筋肉や結合組織を解剖しながら簡単に破損することができます。さらに、カテーテルの針は気管を通じて簡単にプ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

博士 Arnulfo メンドーサ プーマ技術のトレーニングを提供者に感謝したいと思います。 さらに、この研究の過程で、顕微鏡の使用を提供するため夫妻チャンド khanna 博士、スーザン ガーフィールド (NCI/NIH) とサム アパリシオ (紀元前がん庁) を確認したいと思います。この研究は、癌研究、小児腫瘍学の支部センター国立歯科衛生研究の学内研究プログラムによって (の一部) に支えられました。M.M.L.、国家機関の健康学内研究員の研修 (15335 賞)、によって支えられた、現在転移研究のジョアン ・ パーカー交わりに支えられています。P.H.S. は、ブリティッシュ コロンビア州がん財団によってサポートされます。

Materials

Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS ATCC CRL-1547 highly metastatic OS cell line
HOS ATCC CRL-1543 poorly metastatic OS cell line
MG63.3 Amy LeBlanc Laboratory (NCI) N/A highly metastatic OS cell line
MG63 ATCC CRL-1427 poorly metastatic OS cell line
10X M199 media Thermofisher 11825015 Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized) Thermofisher 15230-147 Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution Thermofisher 25080094 Component of A-media & B-media
Hydrocortizone Sigma-Alrich H6909 Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable Sigma-Alrich R0635-5MG Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution Thermofisher 15140122 Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml) Sigma-Alrich I0516-5ML Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose Thermofisher 11965092 Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM) Thermofisher 25030081 Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum Thermofisher 16000044 Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Thermofisher 14190144 Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermofisher 14175095 Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermofisher 25200114 Used in cell culture.
DAR4M Enzo ALX-620-069-M001 Used to label lung parenchyma.
Name Company Catalog Number Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM Zeiss N/A Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM Zeiss N/A Inverted LSM confocal microscope
SCID mice Charles River N/A NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam Harvard Apparatus 59-9863 Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose Lonza 50100 Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle Fisherscientific 14-826-87 Used for tail vein injection.
10 ml syringe BD 309604 Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter Terumo SR-OX2032CA Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile) Medisca 8342 Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs BD 326895 For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves Fisherscientific Varies with size Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler Staples Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler Pipette.com HS29022A Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish Ibidi 81158 Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier VWR 56617-014 Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture Braun N/A Used to tie off cannulated trachea.
Name Company Catalog Number Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp Roboz RS-5910 For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip Roboz RS-5132 For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip Roboz RS5135 For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width Roboz RS-8120 For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz RS-8100 For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade Roboz RS-5880 For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length Roboz RS-5960 For general dissection.

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Cite This Article
Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. J. Vis. Exp. (133), e56332, doi:10.3791/56332 (2018).

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