Summary
O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.
Abstract
O ensaio de metástase pulmonar (PuMA) é um ex vivo explante de pulmão e o sistema de cultura de célula fechada que permite aos pesquisadores estudar a biologia da colonização de pulmão no osteossarcoma (OS) por microscopia de fluorescência. Este artigo fornece uma descrição detalhada do protocolo e discute exemplos de obtenção de dados de imagem em crescimento metastático usando widefield ou plataformas de microscopia de fluorescência confocal. A flexibilidade do modelo PuMA permite que os pesquisadores a estudar não só o crescimento de células do sistema operacional no microambiente do pulmão, mas também para avaliar os efeitos da terapêutica antimetastático ao longo do tempo. Microscopia confocal permite sem precedentes, de alta resolução de imagem de interações de celular so com o parênquima pulmonar. Além disso, quando o modelo de PuMA é combinado com corantes fluorescentes ou repórteres genética de proteína fluorescente, pesquisadores podem estudar o microambiente pulmonar, estruturas celulares e subcelulares, função do gene e atividade de promotor em células metastáticas do sistema operacional. O modelo da PuMA oferece uma nova ferramenta para investigadores de osteossarcoma descobrir a nova biologia metástase e avaliar a atividade da novela terapias anti metastáticas, direcionadas.
Introduction
Melhorado os resultados para pacientes pediátricos com metástase osteossarcoma (OS) continua a ser uma necessidade crítica de clínicas atendidas 1. Isto ressalta a importância do desenvolvimento de novas terapias de alvo molecular. Chemotherapeutics convencional que a proliferação de células de tumor alvo não provaram para ser eficazes no tratamento da doença metastática e, assim, novas estratégias deve direcionar o próprio processo metastático 2. O atual artigo aborda os aspectos práticos de um tipo relativamente novo de ex vivo modelo metástase do pulmão, o ensaio de metástase pulmonar (PuMA) desenvolvido por Mendoza e colegas3, que fornece uma ferramenta útil na descoberta de novos motoristas moleculares em progressão de metástases pulmonares em OS 4,5. Antes de prosseguir, no entanto, seria prudente tocar brevemente sobre vários modelos atuais de metástase, e como o modelo da PuMA oferece diversas vantagens sobre os convencionais em vitro ensaios.
Modelos mais experimentais usados para estudar a metástase é composto por sistemas in vitro e in vivo que recapitular uma etapa específica ou várias etapas da cascata metastática. Estas etapas incluem: células de tumor 1) migrando longe o tumor primário, 2) intravasation em navios nas proximidades (sangue ou linfático) e trânsito na circulação, 3) prender no site secundário, 4) extravasamento e sobrevivência no local secundário, formação de 5) de micrometastases e 6) crescimento em metástases vascularizados (Figura 1). Modelos in vitro de metástase podem incluir a migração de 2-dimensional (2D) e 3-dimensional (3D) Matrigel invasão os ensaios que são revisados em detalham em outro lugar 6. Para os modelos na vivo , os dois sistemas modelo comumente usados incluem: 1) o modelo espontâneo de metástase é onde um células tumorais são orthotopically injetado em um tipo específico de tecido para formar um tumor local que derrama espontaneamente células metastáticas para locais distantes; 2) o modelo experimental de metástase é onde as células do tumor são injetadas para o vaso sanguíneo montante do órgão alvo. Por exemplo, uma injeção veia cauda dos resultados de células de tumor no pulmão do desenvolvimento metástases5,7,8. Outros modelos experimentais metástase incluem injeção de células de tumor no baço ou veia mesentérica, que resulta no desenvolvimento de metástases hepáticas9,10. Considerações práticas desses modelos na vivo são discutidas em detalhe por Welch 11. Outro modelo na vivo costumava estudar metástase em sarcomas pediátricos é o modelo de implantação de tumor subcapsular renal rim que resulta na formação de tumor local e metástases espontânea para os pulmões 12,13. Uma técnica mais tecnicamente exigente como tele-microscopia intravital pode visualizar diretamente, em tempo real, as interações entre as células do câncer metastático e a microvasculatura de um site metastático (ie. pulmão ou fígado) conforme descrito por MacDonald14 e Entenberg15, ou extravasamento de células de câncer na membrana corioalantoicas como descrito por Kim 16.
O modelo de PuMA é um ex vivo, explante de tecido do pulmão, sistema de cultura fechado onde o crescimento de células tumorais fluorescentes pode ser longitudinalmente observado através de microscopia de fluorescência durante um período de um mês (ver Figura 2A). Este modelo recapitula os estágios iniciais de colonização de pulmão (passos 3 a 5) na cascata metastática. Algumas vantagens principais do modelo PuMA sobre modelos convencionais em vitro são: 1) fornece uma oportunidade para medir o crescimento de células de câncer metastático em um microambiente 3D que mantém muitas características do microambiente do pulmão longitudinalmente em vivo 3; 2) puMA permite ao pesquisador avaliar se a derrubada de um tratamento de gene ou drogas de candidato tem atividade antimetastática no contexto de um microambiente pulmonar 3D; 3) o modelo de PuMA é flexível, com vários tipos de plataformas de microscopia fluorescência (Figura 2B) tais como a microscopia de fluorescência widefield ou microscopia confocal de varredura a laser, exemplos de cada um são mostrados na Figura 2 & D, respectivamente. Este artigo irá discutir como usar o modelo de PuMA para obter dados de imagem longitudinais sobre o crescimento metastático da proteína verde fluorescente melhorada (eGFP)-expressar, células humanas osteossarcoma de alto e baixo metastático (MNNG e HOS células, respectivamente) usando baixa ampliação widefield fluorescência. Exemplos de imagens, uma tintura fluorescente que rotula o parênquima pulmonar e uma proteína fluorescente vermelha repórter genética que rotula as mitocôndrias no so células no modelo PuMA usando microscopia confocal de varredura a laser também são discutidos.
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Protocol
Todos os protocolos de animais, dos quais foram obtidos dados de imagem foram realizados com a aprovação do cuidado Animal e Comissão de uso do Instituto Nacional do câncer, os institutos nacionais de saúde. Todos os animais protocolos discutidos e retratado no artigo vídeo foram aprovados pelo Comitê de cuidados animais Universidade da Colúmbia Britânica.
1. preparação de células tumorais para injeção e materiais para o modelo PuMA
Nota: A quantidade de células e soluções será suficiente para 1 rato. Aumenta conforme necessário se mais ratos são usados no estudo. Para receitas de mídia, consulte a tabela 1 e tabela 2.
- Pré-aqueça 5ml de mídia-A em um tubo cônico de 15 mL em banho maria a 37 oC.
- Derreta a 1,2% baixa fusão agarose solução (em água estéril) usando o microondas de laboratório.
- Transferir 5ml do agarose derretido em um tubo cônico de 15 mL e aquecer em banho maria a 37 oC. Garantir que a agarose derretida é 37 oC e líquido antes da etapa de insuflação pulmonar.
- Pre-frio 30 mL de cultura de células da classe PBS suplementado com 1 X caneta/inflamada em um balde de gelo.
- Em um poço de uma placa de 6, pre-embeba uma esponja gelatinosa em 1,5 mL de B-media. A esponja será a âncora de suporte para as fatias de pulmão.
- Certifique-se de células do sistema operacional são cerca de 70-90% confluentes no dia do procedimento. Não use pilhas que são excesso confluente ou se a mídia é laranja para amarelo desde que as células geralmente estão estressadas e diminuíram a viabilidade neste ponto. Para as linhas de célula de osteossarcoma, MNNG e HOS, 5 x 105 em um volume de 100 μL será usado para injetar na veia da cauda do 1 rato. Upscale em conformidade se mais ratos são utilizados para o estudo.
- Colha as células do tumor usando 0,25% do trypsin-EDTA (3 mL para um balão de T75 ou 2 mL em um prato de cultura de 10 cm). Quando as células estão começando a levantar a placa, neutralize o tripsina-EDTA com mídia completa. Gire para baixo as células e lave uma vez com o grau de cultura celular PBS. Resuspenda o pellet em 5 mL de PBS.
- Realizar uma contagem de células por métodos padrão. É melhor fazer a suspensão de células mais do que o que realmente é necessário desde perda de suspensão de células, muitas vezes ocorre durante a agulha elaborar e tentativas de injeção.
- Realize um ensaio de exclusão Trypan azul em uma amostra de suspensão de células para avaliar a viabilidade das células. Prossiga somente se a célula mostrar viabilidade 90% ou superior.
- Injete 5 x 105 células em um volume de 100 μL. Para preparar um excesso de 2 X deste montante, devem ser giradas para baixo e resuspended em 0,2 mL de HBSS a 1 x 106 células.
- Coloque a suspensão de células em um balde de gelo enquanto prepara os ratos para a injeção.
2. cauda veia injeção e insuflação pulmonar
Nota: A quantidade de soluções e células nesta seção será suficiente para 1 rato. Aumenta conforme necessário se mais ratos são usados no estudo. Para obter uma lista dos equipamentos, materiais e instrumentos cirúrgicos utilizados nas etapas a seguir, consulte a tabela 3 e tabela 4.
- Aquecer um rato fêmea (6-8 semanas de idade) sob uma lâmpada de aquecimento por 5 min para fazer a sua cauda veia mais visivelmente aparente. Para as células K7M2 ou K12 murino, usar camundongos Balb/c; para células humanas MG63.3, MG63, MNNG e HOS, use ratos de imunodeficiência combinada grave.
- Certifique-se que a suspensão de eritrócitos é uniforme, agitando suavemente o tubo. Elaborar cuidadosamente a suspensão de células para a seringa de 1 mL sem a agulha. Tampa da seringa com um 27 medidor de agulha. Certifique-se que o bisel da agulha é o mesmo lado que as marcas de volume na agulha.
- Coloque o mouse na retenção e limpar o rabo com uma compressa com álcool.
- Proceda para realizar uma injeção de veia de cauda e injetar a 100 μL da suspensão celular. 5 min após a injeção, posicione o mouse em uma câmara de2 CO e começar o procedimento operacional padrão de eutanásia (como contorno pela vossa Comissão institucional cuidados com animais). Deslocamento cervical não deve ser usado como um meio de eutanásia, desde que o procedimento irá danificar a traqueia.
- Uma vez que o mouse é eutanásia, começa a preparação do exaustor de fluxo laminar para insuflação do pulmão do rato com a solução de agarose/A-media. Dentro do capô de fluxo laminar, configure uma área de trabalho com a sua almofada estéril. Sobre esta placa você colocará seus instrumentos esterilizados, cateter IV, IV conjunto de extensão e aparelho de perfusão de gravidade (ver suplementar Figura 1).
- Posicione o mouse no recumbancy dorsal. Com uma tesoura pequena estéril, disse cuidadosamente para fora o esterno para expor a cavidade torácica. Tome cuidado para não perfurar o pulmão, pois será usada uma solução de agarose/A-media para insufle o pulmão.
- Quando dissecando fora do esterno, disse passado da entrada torácica em ambos os lados da traqueia. Expor a traqueia, embora a dissecar os tecidos moles circundantes.
- Canule a traqueia com um cateter IV de 20 calibre. Vagamente um nó cirúrgico usando sutura catgut estéril ao redor da traqueia canulada.
- Anexe uma extensão de IV conjunto da traqueia catheterized para a seringa de 10 mL de aparelho de perfusão de gravidade.
- Combine o pré-aquecido 37 oC agarose (5 mL) e A mídia (5 mL) em uma mistura 1:1. Despeje a solução de agarose/A-media líquida para a seringa de 10 mL do dispositivo de perfusão de gravidade. Antes da insuflação dos pulmões com solução de agarose/A-media, certifique-se de que todo o comprimento do conjunto de extensão foi preparado com agarose/A-media, eliminando desse modo insuflação inadvertida de amostras do pulmão com ar.
- Encha o pulmão a solução de agarose/A-media até o pulmão está totalmente insuflado.
- Uma vez que o pulmão está totalmente insuflado, remover a cânula e firmemente amarrar o nó cirúrgico para evitar o vazamento da mídia-agarase/A solução através da traqueia.
- Prossiga para dissecar para fora o Sá (traqueia, coração e pulmão) da cavidade torácica. Tome cuidado para não perfure ou danificar a superfície do pulmão.
- Lugar o pluck (em nenhuma orientação específica) no pre-refrigerado 30 mL de PBS suplementado com 1 X caneta/inflamada e permitir que a mídia de agarose/A solidificar por 20 min.
- Usando bem tesoura e pinça, corte pequenos pedaços do pulmão (3 x 1,5 mm), como indicado na figura 1A. Fatias menores do pulmão podem ser facilmente fotografadas usando um objectivo X 2,5. Várias fatias podem ser cortadas por condição experimental, normalmente de 4-10 fatias por grupo.
Nota: Para cada grupo experimental, coloque as rodelas de pulmão em um poço separado (placa de 6) contendo uma esponja de gelatina 2 x 2 cm previamente embebida em B-media. A quantidade de mídia por bem deve ser de 1,5 mL. Mude os meios de comunicação a cada 2-3 dias. Para estudos de drogas, a frequência da mudança a mídia/droga é usuário determinado.
3. Widefield fluorescência por imagens do pulmão fatias e análise
Nota: Para fluorescência widefield fatias de imagem, menores são cortadas (3 x 1,5 x 1 mm) para montar a seção de pulmão em 1 imagem utilizando um objectivo X 2,5.
Aquisição de imagem em um microscópio de fluorescência widefield:
- Fatias de pulmão são tipicamente fotografadas em 0, 3, 7 e 14 dias pós-injeção. No ambiente estéril do gabinete biológico, transferir com cuidado as fatias de pulmão da gelatina esponjas para um vidro estéril 35mm-fundo redondo prato. Cuide-se para dab fora o excesso de líquido da fatia pulmão como o excesso de líquido irá atuar como um espelho e refletem a luz fluorescente, proveniente das células do tumor.
- Disponha as fatias de pulmão em uma maneira similar, representada na figura 1A. Cada coluna representaria uma condição experimental diferente. Tome cuidado para não Cruz-contaminar os pulmões com a pinça. Enxague com 70% de etanol e seque antes de manusear as fatias do pulmão de um outro grupo experimental.
- Otimizar os parâmetros de imagem (ie. ganho, deslocamento, exposição tempo, binning) que fornece o melhor contraste entre as células tumorais fluorescente e tecido pulmonar de fundo no controle (veículo não tratado) grupo. Use os mesmos parâmetros do grupo controle para os grupos experimentais de imagem. Salve como formato de imagem tiff.
- Para uma referência de escala, tire uma foto digital de um micrômetro no mesmo objetivo.
- Desde que o pulmão autofluorescência muda ao longo do tempo, os parâmetros de imagem devem ser ajustados para os pulmões de controle cada sessão de imagens. Os parâmetros de imagem para uma sessão podem não ser necessariamente ideais para sessões de imagens subsequentes.
Análise de imagem:
Nota: As seguintes etapas de processamento de imagem são feitas com ImageJ 1,51 h software pacote 17.
- Abra um arquivo de imagem no ImageJ (Figura 3A).
- Subtrair o fundo: processo > fundo subtrair > raio de bola de Rolling (iniciar com 50 pixels), desmarque a opção "Luz de fundo" (Figura 3B).
- Converter a imagem para o formato de 8 bits: imagem > tipo > 8 bits (Figura 3).
- Definir unidades para pixels: imagem > Enter "Pixels" na unidade de comprimento, insira 1 no "Pixel de largura", "Altura do Pixel", "Profundidade do Voxel". Marque a caixa de "Global" para aplicar a imagens subsequentes.
- Usando a ferramenta de seleção Polygon, delinear a forma da fatia inteira do pulmão e determinar a área (pixel2) da fatia total do pulmão. Esse valor será usado para calcular o peso percentual do tumor do pulmão.
- Imagem de limiar: imagem > ajustar > limiar > destacar "Padrão" e "B & W" > use o controle deslizante de limiar a imagem, tal que a maioria das células tumorais é realçada com precisão. Pressionar "Aplicar" irá resultar em uma imagem preto e branca, onde o pulmão é todo preto, e as lesões fluorescentes são brancas (Figura 3D). Pressionar "Aplicar" uma segunda vez irá inverter a imagem onde todas as estruturas fluorescentes agora são formas pretas (Figura 3E).
- Quantificação do número e forma das lesões:
Analisar > definir medidas > verificar "Área". Desmarque todas as outras caixas.
Analisar partículas > tamanho (pixel2): 0-infinito representa o intervalo de formas que irá enumerar ImageJ. Determine empiricamente a lesão menor que é considerada para ser uma célula de tumor único em imagens de veículo do dia 0. Use a área desta célula de tumor único como o limite inferior para as restantes imagens no conjunto de dados. Para o trabalho apresentado neste artigo, 11 pixel2 é definido como o limite inferior. O trabalho apresentado no vídeo de exemplo, 24 pixel2 é definido como o limite inferior. Deixe o intervalo de "Circularidade" como 0-1. "Show" pode ser definido como "Nada". Alternativamente, se "Mostrar" e "Contornos" é selecionada, é gerado um desenho de todas as formas contornadas. Verificar o "Exibir resultados" para uma janela separada das medições de pop-up. Opcionalmente, ter "Adicionar ao Gerenciador" caixa marcada vai salvar todas as formas quantificadas para um gerente de ROI, que pode ser salvos para referência futura. Depois de pressionar Okey, uma janela de "Resultados" irá aparecer contendo todas as formas enumeradas e medições de área (Figura 3F). - Copie e cole os dados da janela "Resultados" em uma planilha. Use a função matemática de soma no Excel para somar todas as áreas das Lesões metastáticas para aquela fatia de pulmão particular. Para avaliar o fardo de tumor de pulmão percentual da fatia do pulmão, divida a soma das áreas das Lesões metastáticas pela área total da fatia do pulmão. Este parâmetro também é conhecida como fração de área (A), que é descrita por Underwood 18.
Fardo de tumor de pulmão = soma da área de lesão metastática áreas/total da fatia de pulmão - Calcule o peso do tumor de pulmão para o resto das seções pulmonar no grupo controle e restantes grupos. Sinopse o fardo de tumor pulmonar média por grupo nos dias 0, 3, 7 e 14. Representante widefield fotos fluorescentes de alta e baixa metastáticas OS células de origem humanas crescendo no modelo PuMA em pontos de tempo progressivo são mostradas (Figura 4A). Um gráfico de linha, mostrando a mudança de dobra (normalizada para o dia 0) em fardo de tumor metastático por cento ao longo do tempo é mostrado (Figura 4B).
4. confocal fluorescência imagem latente do modelo PuMA
Nota: Para a imagem latente confocal, processamento do tecido é semelhante ao que na seção anterior exceto que fatias maiores do pulmão são cortadas (seções transversais completas, 1-2 mm de espessura) para permitir mais ROIs ser fotografada.
Rotulagem de parênquima pulmonar com DAR4M:
- Mergulhe as fatias de pulmão em 10 μμM de DAR4M (em HBSS) por 45 min a 37 ° C. DAR4M etiquetas de espécies reativas de nitrogênio dentro das células do pulmão.
- Depois de 45 min. de incubação, lave as fatias de pulmão com HBSS fresco.
- Coloque a fatia de pulmão em um vidro de 35mm-fundo redondo prato e a imagem no microscópio confocal.
- Os parâmetros de imagem para as imagens de exemplo mostrados na Figura 5 estão listados na tabela 5.
- Adquira uma pilha-Z para uma região de interesse. Use a espessura da fatia Z sugerida para amostragem de Nyquist. Um filme representativo de uma pilha 3D mostrando fluorescente verde OS células no tecido pulmonar DAR4M-etiquetado é fornecido no filme 1 e suplementar 1 filme.
Para as imagens confocal do exemplo mostradas na Figura 5, a sessão de imagem era terminal. Se imagem longitudinal é necessária, o uso de um 2-fóton ou fóton multi equipada LSM microscópio confocal para a imagem latente é aconselhável desde que há menos photodamage para viver tecidos19,20.
Imagem latente mito-RFP expressando MG63 células no modelo PuMA:
- Execute o protocolo de PuMA como contorno no passo 1 e 2 com o uso de células MG63 expressando a construção do mito-RFP.
- Coloque a fatia de pulmão em um vidro de 35mm-fundo redondo prato e a imagem no microscópio confocal.
- Os parâmetros de imagem para as imagens de exemplo mostrados na Figura 6 estão listados na tabela 6. Um filme representativo de uma pilha 3D mostrando células verde fluorescentes-OS com vermelho fluorescentes mitocôndrias é fornecido em Movie 2 e suplementar Movie 2.
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Representative Results
Microscopia de fluorescência widefield Low-ampliação
Para microscopia de fluorescência widefield de fatias de pulmão PuMA, imagens representativas e quantificação de dados é mostradas na Figura 2e Figura 4A e B. As propensões metastáticos para linhas de alta e baixa metastático célula são visualmente aparentes sobre pontos de tempo progressivo. Células MNNG eficientemente podem colonizar o tecido pulmonar Considerando que células HOS não podem crescer em tudo. De análise de imagem, dados quantitativos podem ser obtidos para avaliar o crescimento ao longo do tempo, conforme mostrado no gráfico da Figura 4B. Aquisição em pequeno aumento (2.5 X) é preferível a fim de capturar a fatia de pulmão inteiro em uma imagem. Esse método permite que imagens em lote de um grande número as fatias PuMA.
Microscopia de fluorescência confocal de alta ampliação
Para a microscopia confocal de fatias de pulmão PuMA, imagens representativas são mostradas na Figura 5. As células MG63 eGFP-expressando individuais podem ser vistas na Figura 5A , em relação ao parênquima pulmonar, que é rotulado pelo corante fluorescente DAR4M na Figura 5B. Uma imagem mesclada é mostrada na Figura 5e um zoom imagem de uma célula de tumor fluorescente em um navio é mostrada na Figura 5. Filmes em 3D da Figura 5 e 5 D são mostrados no filme 1 e suplementar 1 filme, respectivamente. Imagem confocal de estruturas subcelulares, tais como as mitocôndrias são mostradas em Figura 6. Citosólico eGFP-expressão permite que as células do tumor de contorno na figura 6A, e as mitocôndrias rotuladas com RFP são mostradas na Figura 6B. Uma imagem mesclada é vista na Figura 6. Filmes em 3D da Figura 6 são mostrados no filme 2 e suplementar Movie 2. Imaging subcellular estruturas como as mitocôndrias pode ser combinado com outras etiquetas fluorescentes para estudar Biologia organela nas células metastáticas do sistema operacional. Ao adicionar mais etiquetas, certifique-se de que as linhas de laser e filtros de emissão são compatíveis com a proteína fluorescente/fluoróforo particular de interesse. Evite fluorophores/fluorescente proteínas cuja excitação e espectros de emissão estreita sobreposição de imagem.
Figura 1 : Diagrama ilustrando a cascata metastática. A cascata metastática pode ser dividida em vários passos limitante. (1) tumor metastático células deixando o local do tumor primário e invade no parênquima local; (2) intravasating de células de tumor em embarcações de sangue/linfático e trânsito dentro da circulação; (3) detenção de célula tumor no local secundário; (4) extravasamento de célula tumor fora da microvasculatura e da sobrevivência, no site do secundário; (5) crescimento em micrometastases; (6) crescimento em tumores metastáticos evidentes vascularizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Fatias de pulmão imaging PuMA usando widefield fluorescência e plataformas de microscopia de fluorescência confocal. (A) fatias de PuMA exemplo são mostradas em um prato de 35 milímetros de vidro-fundo. (B) equipamento confocal microscópio. (C) exemplo de imagem de baixa ampliação de uma fatia de PuMA com células de OS eGFP-expressão. Scalebar = imagem confocal 0,5 mm. (D) exemplo de uma sub-região de uma fatia de PuMA. Scalebar = 100 μm. (*) Parênquima pulmonar é rotulada vermelho por DAR4M (ver em baixo-relevo) e (∇) aponte para eGFP-expressando as células MG63. Scalebar = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Processamento de uma imagem de baixa ampliação de uma fatia de PuMA usando o ImageJ. (A) imagem original da PuMA. (B) subtração de fundo. (C) conversão de uma imagem de 8 bits. (D) a imagem de limiarização para realçar células tumorais fluorescente. (E) a inversão da imagem. (F) enumeração de formas discretas e quantificação das áreas de forma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Baixo-ampliação de imagens mostrando o crescimento do sistema operacional humana altamente e baixo metastático de células no modelo PuMA ao longo do tempo serial. (A) seriais imagens de células MNNG altamente metastáticas e metastático baixo HOS células são mostradas em 0, 3, 7 e 14 dias pós-injeção. As células MNNG são capazes de crescer melhor no microambiente pulmonar em contraste com as células HOS. Scalebar = 1 mm. (B) dobra-mudança na carga de tumor metastático por cento para células MNNG e HOS ao longo do tempo são mostrados como gráficos de linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Microscopia confocal de uma fatia de pulmão PuMA DAR4M-etiquetadas. Uma imagem representativa confocal de eGFP-expressando as células MG63 no tecido de pulmão PuMA rotulado com DAR4M. (A) verde canal mostrando células MG63 de eGFP-expressando (∇). (B) canal vermelho mostrando o corante DAR4M vinculação de espécies reativas de nitrogênio em células do parênquima pulmonar. A tintura destaca o parênquima pulmonar (#) e estruturas que se assemelha a um vaso sanguíneo (*). A borda do PuMA pulmão seção é denotado (↓). (C) mesclada imagem verde e vermelho. Scalebar = 100 μm. (D) uma imagem ampliada da caixa tracejada de branca (de C) mostra uma célula de tumor em um navio. Scalebar = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Microscopia confocal de mitocôndrias nas células do osteossarcoma no modelo PuMA. Uma imagem representativa confocal de mitocôndrias nas células de MG63 eGFP-expressando. (A) verde canal mostrando células MG63 de eGFP-expressando (∇). (B) canal vermelho mostrando o RFP localizada à mitocôndria (*). (C) mesclada imagem verde e vermelho. Scalebar = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meios de cultura | Receita |
| Mídia completa (500mL) | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| • 5 mL 10 X solução de caneta/estreptococo (10000U/mL) | |
| • 5 mL de L-glutamina (200 mM) | |
| A mídia (250mL) | •177.58 mL de água estéril |
| •50 mL 10 X mídia M-199 | |
| •15 mL de solução de bicarbonato de sódio 7,5% | |
| •2.25 mL de hydrocortizone 50mm | |
| acetato de retinol de 0,4 mg/ml •125 mL (em água estéril) | |
| • 5 mL de 10 X solução de caneta/estreptococo (10000U/mL) | |
| •50 mL de insulina bovina de 10mg/ml | |
| B-mídia (500ml) | •427.6 mL de água estéril |
| •50 mL 10 X mídia M-199 | |
| •15 mL de solução de bicarbonato de sódio 7,5% | |
| •2.25 mL de hydrocortizone 50mm | |
| acetato de retinol de 0,4 mg/ml •125 mL (em água estéril) | |
| • 5 mL de 10 X solução de caneta/estreptococo (10000U/mL) | |
| •50 mL de insulina bovina de 10mg/ml |
Tabela 1. Receitas para mídia completa, A mídia, mídia-B. Receitas para cultura celular e mídia para o ensaio de PuMA está listadas.
| Cultura de eritrócitos | Descrição | N º de catálogo | Companhia |
| MNNG-HOS | linha de celular OS altamente metastática | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | linha de celular OS mal metastática | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | linha de celular OS altamente metastática | N/A | Laboratório de Amy LeBlanc (ICN) |
| MG63 | linha de celular OS mal metastática | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 mídia | Mídia de base para A mídia e o B-mídia | 11825015 | Thermofisher |
| Água destilada (esterilizada) | Componente da mídia & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-mídia | |||
| 7,5 solução de bicarbonato de sódio % | Componente da mídia & | 25080094 | Thermofisher |
| B-mídia | |||
| Hydrocortizone | Componente da mídia & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-mídia | |||
| Solúvel em água-acetato de retinol | Componente da mídia-A & B-media | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Solução de penicilina/estreptomicina 10 X concentrada (10000 U/ml) | Componente da mídia & | 15140122 | Thermofisher |
| B-mídia, completa | |||
| Solução de insulina bovina (10mg/ml) | Componente da mídia & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-mídia | |||
| DMEM, glicose alta | Base mídia de mídia completa | 11965092 | Thermofisher |
| L-glutamina (200 mM) | Componente de mídia completa | 25030081 | Thermofisher |
| Soro fetal bovino | Componente de mídia completa | 16000044 | Thermofisher |
| Tampão fosfato de Dulbecco-salino | Usado em cultura de células | 14190144 | Thermofisher |
| Armazenado em buffer sais solução Hank é, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol | Usado para Ressuspender células antes da injeção | 14175095 | Thermofisher |
| Trypsin-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | Usado em cultura de células | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Usado para rotular o parênquima pulmonar | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tabela 2. Reagentes de cultura de células para A mídia, mídia-B e completar a mídia. Componentes para receitas de mídia, reagentes e amortecedores são listados com catálogo número e nome da empresa.
| Materiais | Descrição | N º de catálogo | Companhia |
| Zeiss 710 Confocal LSM | Microscópio confocal de LSM vertical | N/A | Zeiss |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Microscópio confocal de LSM invertido | N/A | Zeiss |
| Ratos SCID | BALANCE A CABEÇA. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, do sexo feminina, idade 6 a 8 semanas | N/A | Charles River |
| GelFoam | Usado como um suporte para cortes de tecido de pulmão | 59-9863 | Aparelhos de Harvard |
| SeaPlaque Agarose | Usado durante a insuflação do pulmão | 50100 | Lonza |
| seringa de 1 ml com 27 medidor de agulha | Usado para injeção de veia de cauda | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| seringa de 10 ml | Utilizado para insuflação do pulmão | 309604 | BD |
| cateter de calibre 20 | Usado durante a insuflação do pulmão | SR-OX2032CA | Terumo |
| Extensão de Abbott IV definir (30", estéril) | Usado durante a insuflação do pulmão | 8342 | Medisca |
| Compressas de álcool | Para limpar o rabo da veia antes da injeção | 326895 | BD |
| Luvas cirúrgicas estéreis | Asceptic entrega dos pulmões do mouse | Varia com o tamanho | Fisherscientific |
| régua de 30cm | Utilizado para insuflação do pulmão | Staples | |
| Coluna suporte de régua | Utilizado para insuflação do pulmão | HS29022A | PIPETTE.com |
| prato de cultura com fundo de vidro de 35 mm | Usado durante a imagem latente de fatias de pulmão | 81158 | Ibidi |
| Underpads absorventes com barreira de umidade à prova d'água | Usado para forrar a área de trabalho estéril de capuz biológica | 56617-014 | VWR |
| Sutura absorvível catgut simples | Usado para amarrar a traqueia canulada | N/A | Braun |
Tabela 3. Materiais para a PuMA. Material necessário para o protocolo da PuMA é listados com catálogo número e nome da empresa.
| Materiais | Descrição | N º de catálogo | Companhia |
| Dissecando micro tesouras 3.5" reta Sharp/Sharp | Para seções de pulmão de corte | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) longo serrilhada reta ponta Extra delicada 0.5mm | Para seções de manipulação/exploração pulmonar | RS-5132 | Roboz |
| Dica de 0,8 mm tempo serrilhada ligeira curva 4"(10 cm) | Para seções de manipulação/exploração pulmonar | RS5135 | Roboz |
| Polegar vestindo fórceps; Serrilhada; Delicada; 4.5" comprimento; Largura de ponta 1.3 mm | Para dissecação geral | RS-8120 | Roboz |
| Vestindo o fórceps 4.5" serrilhada 2.2 mm largura de ponta do polegar | Para dissecação geral | RS-8100 | Roboz |
| Extra fina Microtesoura Dissecting 3.5" reta Sharp/Sharp, lâmina de 20mm | Para dissecação geral | RS-5880 | Roboz |
| Tesoura de Knapp; Em linha reta; Sharp-contuso; Comprimento da lâmina de 27mm; 4" comprimento total | Para dissecação geral | RS-5960 | Roboz |
Tabela 4. Instrumentos cirúrgicos para PuMA. Vários instrumentos de aço inoxidável usados no protocolo são listados com catálogo número e nome da empresa.
| Parâmetros | 488 laser | 561 laser | |
| objetivo | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0.3 W (DIC) M27 | ||
| poder | 2% | 2% | |
| Habitai pixel | 1,61 | 1,61 | |
| Média | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Ganho de mestre | 820 | 814 | |
| Ganho digital | 1 | 0,51 | |
| Offset digital | -4.5 | -9.24 | |
| Pinhole | 51 | 57 | |
| Filtro ajustável | 496-553 | 570-618 | |
Tabela 5. Parâmetros para a imagem latente confocal de seções PuMA DAR4M-etiquetadas. Parâmetros de imagem específicos usados para obtidas as imagens confocal no jornal atual são fornecidos na tabela.
| Parâmetros | 488 laser | 561 laser | |
| objetivo | Plano-Apochromat 63 x 1,40 óleo DIC M27 | ||
| poder | 2% | 2% | |
| Habitai pixel | 0.6 | 0.6 | |
| Média | 2 (linha) | 2 (linha) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Ganho de mestre | 449 | 390 | |
| Ganho digital | 1 | 1.23 | |
| Offset digital | 0 | 0 | |
| Pinhole | 136 | 136 | |
| Filtro ajustável | 493-550 | 566-703 | |
Tabela 6. Parâmetros para a imagem latente confocal de mitocôndrias de células MG63 nas seções de PuMA. Parâmetros de imagem específicos usados para obtidas as imagens confocal no jornal atual são fornecidos na tabela.
Suplementar Figura 1: aparelho de perfusão de gravidade. O aparelho de perfusão de gravidade é usado para insufle o pulmão com uma solução de agarose/A-mídia líquida a 20 cm de pressão hidrostática de H20. A solução de agarose/A-media é derramada para a seringa de 10 mL, que é ligada por uma extensão de IV, definida como a traqueia canulada (não mostrada). Clique aqui para baixar esta figura.
Filme 1: rotação de uma imagem 3D confocal z-pilha do sistema operacional eGFP-expressando as células em uma fatia de pulmão PuMA DAR4M-etiquetadas. DAR4M (canal vermelho) é usado para realçar o parênquima pulmonar e eGFP-expressando as células MG63 também podem ser visto (canal verde). Scalebar = 100 μm. Clique aqui para baixar este movimento.
Movie 2: rotação de uma imagem 3D confocal z-pilha de mitocôndrias RFP-etiquetados no so eGFP-expressando células no modelo PuMA. Organelas subcelulares, tais como mitocôndrias são mostradas rotuladas com RFP (canal vermelho) em MG63 eGFP-expressando células (canal verde) no modelo de PuMA. Scalebar = 10 μm. Clique aqui para baixar este movimento.
Suplementar 1 filme: filme 3D com zoom de uma célula OS metastático em um navio no pulmão. Uma célula de MG63 eGFP-expressando é mostrada no navio dentro do microambiente do pulmão. Scalebar = 30 μM. Clique aqui para baixar este movimento.
Suplementar Movie 2: filme 3D com zoom de mitocôndrias em uma célula OS metastática no pulmão. Mitocôndrias rotuladas com RFP são mostradas nas células MG63 no microambiente do pulmão. Scalebar = 5 μM. Clique aqui para baixar este movimento.
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Discussion
O seguinte artigo técnico descreve alguns aspectos práticos do modelo PuMA em estudar a colonização de pulmão no sistema operacional. Alguns passos críticos no protocolo onde pesquisadores devem tomar cuidado extra incluem o seguinte:
a) canulação da traqueia. A traqueia pode ser facilmente danificada enquanto dissecando o circundante do músculo e do tecido conjuntivo. Além disso, a agulha do cateter pode facilmente ser empurrada através da traqueia. Preste atenção a como o bisel da agulha penetra a traqueia ao inserir a cânula.
b) furar ou danificar a superfície do pulmão. O pulmão pode ser facilmente perfurado ou danificado com dissecando tesoura enquanto removendo o esterno e expondo a cavidade torácica. Tenha cuidado quando dissecando fora o Sá da cavidade torácica. Furar ou danificar a superfície do pulmão causará a agarose líquido/A-media a vazar e o pulmão vai ser deflacionado.
c) remover mídia excesso de seções de pulmão enquanto imagem. Meio líquido em excesso ao redor da seção de pulmão pode causar um efeito de "espelho", quando vistos ao microscópio. O excesso de líquido pode refletir a luz fluorescente das células do tumor, assim, exagerando a área de fluorescência na imagem. Remoção de líquido em excesso de mídia irá impedir este artefato na imagem. Alternativamente, o artefato de imagem pode ser removido durante o pós-processamento das imagens.
d) Fotodano dos tecidos vivos. Quando usando uma lâmpada de mercúrio ou laser de um microscópio 1-fóton, certifique-se limitar o tempo exposto à luz. O percentual de intensidade/potência da fonte de luz pode também ser reduzido. Superexposição à fonte de luz pode causar photodamage no tecido pulmonar. Microscópios equipados com (LED) de diodos emissores de luz ou microscópios 2-fóton/multi-photon seria ideais porque eles produzem menos Fotodano durante estudos de imagiologia longitudinais.
O modelo PuMA pode ser adaptado e modificado para estudar os vários aspectos do processo de colonização do pulmão. Outra variante desta abordagem ex vivo é descrita por van den Bijgaart e colegas 21. Para estudos examinar os efeitos da atividade de gene knock-down ou antidrogas metastática no crescimento de células de tumor no pulmão, dimensionamento de volta o número de células injetadas de 5 x 105 3 x 105 é aconselhável uma vez que os efeitos da intervenção podem ser mascarados durante o crescimento exponencial de um inóculo de célula maior. Vários estudos têm usado o modelo PuMA para estudar os condutores de pulmão metastático progressão 4,5,8,22,23,24. Vários corantes fluorescentes indicador ou genes repórter fluorescente podem ser usado para as células do tumor de rótulo para verificar alterações na célula fisiologia ou gene expressão 8 no microambiente do pulmão.
Uma limitação do modelo PuMA inclui um número limitado de linhas celulares compatíveis. As linhagens celulares estabelecidas compatíveis com este ensaio são listadas por Mendoza e colegas 3 . Para linhas de células de alta e baixa metastático osteossarcoma, foram encontrados os siga pares de linhas celulares com uma relação clonal de crescer e manter sua propensão metastático no modelo PuMA: células humanas MG63.3 & MG63, MNNG & 143 e células HOS, murino K7M2 e K12 células. Pesquisadores devem determinar empiricamente ou não suas linhas de célula podem permanecer viáveis em B-media. Outra limitação a considerar é o comprimento limitado de tempo, que os tecidos do pulmão podem ser mantidos em vitro. Tecido pulmonar pode manter seus componentes celulares por 30 dias, além do que o tempo e os componentes celulares do pulmão começam a morrer. Portanto, estudar as interações entre células tumorais e células do estroma pulmonar não deve exceder 30 dias.
O modelo PuMA fornece um método sem precedentes para estudar OS como metástases células colonizam o tecido pulmonar. O aspecto mais marcante do modelo PuMA vem do fato de que vários baixa metastático OS linhas celulares (HOS, MG63, K12), cujos fenótipos na vivo tem sido caracterizada em outro lugar 25, não pode crescer no modelo PuMA. Em contraste, com uma relação clonal de células OS altamente metastáticas (MNNG, MG63.3, K7M2) têm uma maior propensão para colonizar o tecido de pulmão na vivo25 e no PuMA modelo. Isto sugere que os componentes celulares e extracelulares do microambiente pulmonar que evitar baixa linha de celular OS metastática de crescimento na vivo, ainda são mantidas no modelo PuMA apesar da falta de fluxo sanguíneo. Em outras palavras, o microambiente pulmonar do modelo PuMA ainda exerce uma pressão"seleção" que impede que células de OS metastáticas baixas crescendo no pulmão. Com efeito, estudando alta metastático OS células crescem em PuMA tem sido útil na identificação de novos drivers moleculares do fenótipo metastático 4,5. Além disso, para baixo-modulação genética do referido alvos nas células altamente metastáticos foi mostrado para diminuir a capacidade metastática em ambos o modelo da PuMA e in vivo 5. Para estudos de drogas antimetastático de candidato, o PuMA modelo pode ser usado para determinar qual intervalo de concentração pode reduzir a consequência metastática nos tecidos do pulmão, que por sua vez, pode então ser validado na vivo.
Aplicações futuras deste modelo devem explorar a infinidade de corantes fluorescentes comercialmente disponíveis e genes repórter para mergulhar profundamente em biologia básica da progressão de metástases OS. Por exemplo, corantes fluorescentes como 2', 7' diacetato - dichlorofluorescin ou dihydroethidium podem ser usados para avaliar o estado de redox das células tumorais no modelo PuMA. Os genes repórter fluorescente podem ser usados para estudar Biologia organela ou avaliar a atividade de promotor para determinar quais vias de sinalização são ativadas nas células altamente metastáticas do sistema operacional durante o processo de colonização. Tais abordagens podem ser usadas para visualizar se um tratamento medicamentoso tem atividade nas células do tumor crescendo no pulmão. Plataformas de microscopia fluorescente que produzem menos Fotodano aos tecidos, tais como microscópios equipados com LED ou 2-fóton/multiphoton microscópios confocal, pode ser usado estudar OS como metástases células migrar e invadir em todo os tecidos do pulmão. Além disso, interações de adesão entre células tumorais e células do estroma pulmonar podem ser monitoradas com genes repórter fluorescentes.
Para resumir, o papel atual aborda os aspectos práticos do modelo PuMA, desenvolvido pela primeira vez por Mendoza e colegas 3. É mostrado um exemplo do uso de baixa ampliação, widefield microscopia de fluorescência e microscopia confocal de alta resolução para avaliar o crescimento de células humanas de OS altos e baixos metastáticos. Têm sido descritas várias etapas críticas do protocolo. Além disso, as vantagens e limitações do modelo de PuMA tem sido discutidas. Futuras aplicações do modelo PuMA para estudar o processo de colonização do pulmão foram apresentadas, e espera-se que este modelo vai ter uma utilização mais alargada na Comunidade de pesquisa de osteossarcoma.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o Dr. Arnulfo Mendoza que forneceu treinamento na técnica de PuMA. Além disso, gostaríamos de reconhecer os Drs Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) e Sam Aparicio (BC Cancer Agency) para fornecer o uso de seus microscópios no decorrer deste estudo. Esta pesquisa foi apoiada (em parte) pelo programa de pesquisa Intramural de institutos nacionais de saúde, centro de pesquisa de câncer, filial de oncologia pediátrica. M.M.L. foi apoiado pelo programa nacional de institutos de saúde Intramural visitando Fellow (prêmio 15335) e atualmente é suportado por Joan Parker doutorado em pesquisa de metástase. EP é suportado pelo British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
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