Summary
Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av protokollen for lunge metastasering analysen (PuMA). Denne modellen tillater forskere å studere metastatisk osteosarcoma (OS) cellevekst i lungevev bruker widefield fluorescens eller AC confocal laserskanning mikroskopet.
Abstract
Lunge metastasering analysen (PuMA) er en ex vivo lunge explant og lukket celle kultur-systemet, som tillater forskere å studere biologi lunge kolonisering i osteosarcoma (OS) ved fluorescens mikroskopi. Denne artikkelen gir en detaljert beskrivelse av protokollen, og diskuterer eksempler på innhenting bildedataene på metastatisk vekst ved hjelp av widefield eller AC confocal fluorescens mikroskopi plattformer. Fleksibiliteten til PuMA modellen tillater forskere å studere ikke bare veksten av OS celler i lunge-microenvironment, men også å vurdere effekten av anti-metastatisk therapeutics over tid. AC confocal mikroskopi gir enestående og høy oppløsning bilder av OS celle interaksjon med lunge parenchyma. Videre PuMA modellen er kombinert med fluorescerende fargestoffer eller fluorescerende protein genetisk journalister, kan forskerne studere lunge microenvironment, mobilnettet og subcellular, gen funksjon og promoter aktivitet i metastatisk OS celler. PuMA modellen gir et nytt verktøy for osteosarcoma forskere oppdage nye metastasering biologi og vurdere aktiviteten til romanen anti-metastatisk, målrettet terapi.
Introduction
Bedre utfall pediatriske pasienter med metastatisk osteosarcoma (OS) fortsatt kritisk udekket kliniske behov 1. Dette underbygger betydningen av å utvikle nye molecularly-målrettet terapi. Konvensjonelle chemotherapeutics som mål svulst celle spredning ikke har vist seg for å være effektive i behandling av metastatisk sykdom og dermed romanen strategier må mot selve metastatisk prosessen 2. Gjeldende artikkelen drøfter de praktiske sidene av en relativt ny type ex vivo lunge metastasering modell, lunge metastasering analysen (PuMA) utviklet av Mendoza og kolleger3, som gir nyttig verktøy i å oppdage nye molekylær drivere i lunge metastasering progresjon i OS 4,5. Før du fortsetter, men det ville være klokt å kort berører flere aktuelle modeller for metastasering, og hvordan PuMA modellen tilbyr flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle i vitro søk.
Mest eksperimentelle modeller brukes til å studere metastasering utgjør i vitro og vivo systemer som recapitulate et bestemt trinn eller flere trinn i metastatisk kaskade. Disse trinnene omfatter: 1) kreftceller migrere fra den primære svulsten, 2) intravasation i nærliggende fartøy (blod og lymfatiske) og transitt i sirkulasjon, 3) arrestere på sekundær, 4) bloduttredelse og overlevelse på sekundære området, 5) dannelse micrometastases og 6) veksten i Stangeriaceae metastaser (figur 1). In vitro modeller av metastasering ha 2-dimensjonal (2D) overføring og 3-dimensjonale (3D) Matrigel invasjon analyser som er omtalt i detalj andre steder 6. I vivo modeller, de to brukte modell-systemene inkluderer: 1) den spontane metastasering modell er der en kreftceller er orthotopically injiseres i en bestemt vev type til en lokal svulst som spontant kaster metastatisk celler til fjerntliggende områder; 2) eksperimentelle metastasering modell er hvor kreftceller som injiseres i blodkaret oppstrøms av målet orgelet. For eksempel en hale vene injeksjon av tumor celler resultater i utvikling lunge metastaser5,7,8. Andre eksperimentelle metastasering modeller inkluderer injeksjon av kreftceller i milten eller hvem stemning som resulterer i utviklingen av leveren metastaser9,10. Praktiske hensyn til modellene i vivo er diskutert i detalj ved Welch 11. En annen i vivo modell brukes å studere metastasering i pediatric sarkomer er nedsatt nyre subcapsular svulst implantasjon modell som resulterer i lokale tumor formasjon og spontan metastasering til lungene 12,13. En mer teknisk krevende teknikk som intravital videomicroscopy kan visualisere direkte, i sanntid, interaksjoner mellom metastatisk kreftceller og microvasculature av et metastatisk nettsted (dvs. lungene eller leveren) som beskrevet av MacDonald14 og Entenberg15, eller kreft cellen bloduttredelse i chorioallantoic membranen som beskrevet av Kim 16.
PuMA modellen er en ex vivo, lunge vev explant, lukket kultur-systemet der veksten av fluorescerende kreftceller kan langs observeres via fluorescens mikroskopi over en periode på en måned (se figur 2A). Denne modellen viser den innledende stadiet av lungekreft kolonisering (trinn 3 til 5) i metastatisk kaskade. Store fordeler av PuMA modellen over konvensjonelle i vitro modeller er: 1) gir en mulighet til å måle langs metastatisk kreft cellevekst i en 3D microenvironment som beholder mange funksjoner i lunge microenvironment i vivo 3; 2) puMA lar forskeren å vurdere om knockdown av en kandidat genet eller narkotika behandling har anti-metastatisk aktivitet i forbindelse med en 3D lunge microenvironment; 3) PuMA modellen er fleksibel med mange typer fluorescens mikroskopi plattformer (figur 2B) som widefield fluorescens mikroskopi eller laser-skanning AC confocal mikroskopi vises eksempler på hver i figur 2C & D, henholdsvis. Denne artikkelen vil drøfte hvordan PuMA modellen til å anskaffe langsgående bildebehandling på metastatisk veksten av forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP)-uttrykke, menneskelige høyt og lavt metastatisk osteosarcoma celler (MNNG og HOS cellene, henholdsvis) bruker lav forstørrelse widefield fluorescens. Eksempler på imaging en fluorescerende fargestoff som etiketter lunge parenchyma og en rød-fluorescerende protein genetisk reporter som etiketter mitokondrier i OS celler i PuMA modellen med AC confocal mikroskopi laserskanning er også diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller som bildebehandling data ble innhentet ble utført med godkjenning av Animal Care og bruk komiteen av National Cancer Institute, National Institutes of Health. Alle dyr protokoller diskutert og portrettert i artikkelen video er godkjent av University of British Columbia dyr omsorg.
1. forberedelse av kreftceller til injeksjon og materialer for PuMA modellen
Merk: Løsninger og celler vil være nok for 1 musen. Skalere opp nødvendig hvis mer mus brukes i studien. Hvis media oppskrifter, se tabell 1 og tabell 2.
- Forvarm 5 mL av en-Media i et 15 mL konisk rør i et 37 oC vannbad.
- Smelt 1,2% lavt Smeltepunkt agarose løsningen (i sterilt vann) bruker lab mikrobølgeovn.
- Overføre 5 mL av smeltet agarose til en 15 mL konisk rør, og holde varmen i et 37 oC vannbad. Sikre det smeltet agarose er på 37 oC og flytende før lunge insufflation trinnet.
- Pre chill 30 mL av cellekultur grade PBS med 1 X penn/strep i en isen bøtte.
- I en godt av en 6-vel plate, pre suge en gelatin svamp i 1,5 mL av B-media. Svampen vil være støtte ankeret for lunge skiver.
- Sikre OS cellene er ca 70-90% confluent på dagen for prosedyren. Ikke bruk celler som er over confluent eller hvis mediet er oransje til gul siden cellene er vanligvis stresset og har redusert levedyktighet på dette punktet. For cellelinjer osteosarcoma, MNNG og HOS, brukes 5 x 105 i et volum på 100 μL til å injisere i halen åre 1 musen. Oppskalere tilsvarende hvis mer mus brukes for studien.
- Høste kreftceller bruker 0,25% trypsin-EDTA (3 mL for en MT75 kolbe eller 2 mL i 10 cm kultur parabol). Når celler begynner å løfte opp platen, nøytralisere trypsin-EDTA med komplett. Nedspinning celler og skyll når med cellekultur grade PBS. Resuspend pellets i 5 mL av PBS.
- Utføre en celletall standard metoder. Det er best å gjøre mer celle suspensjon enn hva er egentlig nødvendig siden tap av cellen suspensjon ofte oppstår under nål uavgjort opp og mislykkede injeksjon forsøk.
- Utføre en Trypan-blå utelukkelse analysen på et utvalg av cellen suspensjon å vurdere levedyktigheten til cellene. Fortsette hvis cellen viser 90% levedyktighet eller høyere.
- Injisere 5 x 105 celler i et volum på 100 μL. For å forberede et overskudd av 2 X av dette beløpet, skal 1 x 106 celler være spunnet ned og resuspended i 0,2 mL HBSS.
- Sett celle suspensjon i en isen bøtte mens forbereder musene injeksjon.
2. hale blodåre injeksjon og lunge Insufflation
Merk: Løsninger og celler i denne delen vil være nok for 1 musen. Skalere opp nødvendig hvis mer mus brukes i studien. En liste av utstyr, materialer og Kirurgiske instrumenter brukes i følgende trinn, se tabell 3 og Tabell 4.
- Varm en kvinnelig mus (år 6-8 ukens) under en varme lampe for 5 min for å gjøre deres hale vene mer synlig tilsynelatende. For murine K7M2 eller K12 celler, bruk Balb/c mus; for menneskelige MG63.3, MG63, MNNG og HOS celler, kan du bruke alvorlig kombinert immunsvikt mus.
- Kontroller at celle suspensjon er uniform av forsiktig risting røret. Utarbeide forsiktig celle suspensjon i 1 mL sprøyten uten nålen. Cap sprøyte med en 27 måle pinne. Kontroller at nålen skråkant på samme side som volum markeringene på nålen.
- Plasser musen i restrainer, og vattpinnen halen med en alkohol-tørke.
- Fortsette å utføre en hale blodåre injeksjon og injisere den 100 μL celle suspensjon. 5 min etter injeksjon, plasserer musen i en CO2 kammer og begynne euthanasia standarden Driftsmetoden (som omriss av dine dyr institusjon). Cervical forvridning bør ikke brukes som et middel for euthanasia siden prosedyren vil skade luftrøret.
- Når musen er euthanized, begynne utarbeidelse av laminær strømning panseret for insufflation av musen lunge med agarose/en-media løsning. Innen laminær strømning panseret, sette opp et arbeidsområde med sterilt notisblokken. På dette pad vil du plassere din steriliserte instrumenter, IV kateter, IV forlengelsesslangen og tyngdekraften perfusjon apparater (se supplerende figur 1).
- Plass musen i dorsal recumbancy. Med sterilt liten saks, nøye analysere ut sternum å avsløre brystet hulrom. Pass på å ikke punktere lungene siden en agarose/en-media løsning brukes til å insufflate lunge.
- Når dissekere ut sternum, dissekere forbi thorax innløp på begge sider luftrøret. Utsett luftrøret av dissecting unna omkringliggende bløtvev.
- Cannulate luftrøret med et 20 gauge IV kateter. Løst slå en kirurgisk knute bruker sterilt catgut Sutur rundt cannulated luftrøret.
- Knytte filtypen IV sett fra catheterized luftrøret 10 mL sprøyte av tyngdekraften perfusjon apparater.
- Kombinere forvarmes 37 oC agarose (5 mL) og en-media (5 mL) til en 1:1 blanding. Hell den flytende agarose/en-media løsningen i 10 mL sprøyte tyngdekraften perfusjon enheten. Før insufflation av lungene med agarose/en-media løsning, kan du sikre at hele lengden av har vært fylt med agarose/en-media, derved nekter utilsiktet insufflation av lunge prøver med luft.
- Fylle lungene agarose/en-media løsningen før lungene er fullt insufflated.
- Når lungene er helt insufflated, Fjern kanyle og fast tie av kirurgiske knute å hindre lekkasje av agarase/en-media løsning gjennom luftrøret.
- Fortsette å dissekere ut plukke (luftrøret, hjerte og lunge) fra brystet hulrom. Ta vare å ikke punktering eller skade overflaten av lungene.
- Sted plukke (i ingen spesiell orientering) i den pre kjølt 30 mL PBS supplert med 1 X penn/strep, og la det agarose/en-mediet å stivne for 20 min.
- Bruke fine saks og pinsetter, kuttet i små biter av lunge (3 x 1,5 mm) som vist i figur 1A. Mindre lunge skiver kan avbildes enkelt ved hjelp av en 2,5 X-målet. Flere stykker kan kuttes per eksperimentelle tilstand, vanligvis 4-10 stykker per gruppe.
Merk: For hver forsøksgruppen, plassere lunge skiver i en egen brønn (6-vel plate) som inneholder en 2 x 2 cm gelatin svamp pre dynket i B-media. Mengden av media per brønn bør være 1,5 mL. Endre media hver 2-3 dager. For medikament studier er frekvensen av endring media/stoffet bruker bestemt.
3. Widefield fluorescens Imaging av lunge skiver og analyse
Merk: For widefield fluorescens tenkelig, mindre stykker er kuttet (3 mm x 1,5 x 1 mm) for å tilpasses delen lunge 1 bilde ved hjelp av en 2,5 X-målet.
Bildeopptak på widefield fluorescens mikroskop:
- Lunge skiver er vanligvis avbildet på 0, 3, 7 og 14 dager etter injeksjon. Sterilt miljø av biologiske skapet, nøye overføre lunge skiver fra gelatin svamper et sterilt 35 mm glass-nederst rundt parabolen. Ta vare for å dab av overskytende væske fra lunge sektoren som overskytende væske vil fungere som et speil og reflektere fluorescerende lys kommer fra kreftceller.
- Ordne lunge skiver på en lignende måte avbildet i figur 1A. Hver kolonne representere en annen eksperimentell tilstand. Ta vare å ikke kryss-smitte lungene med pinsett. Skyll med 70% etanol og tørke før behandling lunge skiver fra en annen forsøksgruppen.
- Optimalisere tenkelig parametrene (dvs. gevinst, forskyvning, eksponering tid, binning) som gir den beste kontrasten mellom fluorescerende kreftceller og bakgrunn lungevev i kontrollen (vehicle ubehandlet) gruppe. Bruk de samme parameterne fra kontrollgruppen for å image eksperimentelle gruppene. Lagre som tiff image formatter.
- For en skala referanse, ta et digitalt bilde av en mikrometer på samme mål.
- Siden lunge auto-fluorescens endres over tid, må tenkelig parameterne justeres til kontroll lungene hver tenkelig økt. Tenkelig parameterne for en økt være ikke nødvendigvis optimalt for etterfølgende tenkelig økter.
Bildeanalyse:
Merk: Følgende bilde behandling utføres med ImageJ 1.51h programvare pakke 17.
- Åpne en bildefil i ImageJ (figur 3A).
- Trekke bakgrunn: prosessen > trekke bakgrunn > rullende ballen radius (start med 50 piksler), uncheck "Lys bakgrunn" (figur 3B).
- Konverterer bildet til 8-biters format: Image > Type > 8 - biters (Figur 3 c).
- Angi enheter til piksler: Image > Enter "Piksler" i enhet av lengde, skriver du inn 1 i "Pixel bredde", "Pixel høyde", "Voxel dybde". Sjekk "Global" for å bruke etterfølgende bilder.
- Bruk markeringsverktøy Polygon omrisset av figuren på hele lunge sektoren og bestemme området (piksel2) av den totale lunge-sektoren. Denne verdien brukes til å beregne prosent svulst byrden av lunge.
- Terskelen bilde: bilde > Juster > terskelen > markere "Standard" og "B & W" > bruke glidebryteren terskelen bildet slik at fleste av kreftceller utheves nøyaktig. Trykke "Apply" vil resultere i en svart / hvitt bilde der lungene er helt svart, og fluorescerende lesjonene er hvit (figur 3D). Trykk «Bruk» en gang vil snu bildet der alle fluorescerende strukturer er nå svarte figurer (figur 3E).
- Kvantifisering av antall og form av lesjoner:
Analysere > angi målinger > Sjekk "Området". Fjern alle andre merker.
Analysere partikler > størrelsen (piksler2): 0-uendelig representerer området figurer som ImageJ vil nummerere. Empirisk bestemme minste lesjonen som anses for å være en enkelt svulst celle i dag 0 bilen bilder. Bruke området denne enkelt svulst celle som nedre grense for de øvrige bildene i datasettet. For arbeidet presentert i dette dokumentet, settes 11 pixel2 som nedre grense. For arbeidet presentert i eksemplet video, angis 24 pixel2 som nedre grense. La "Sirkularitet" område som 0-1. "Vis" kan settes til "Ingenting". Hvis "Vis" og "Disposisjoner" er valgt, genereres også en tegning av alle disponerte figurer. Sjekk "visningsresultater" for et eget vindu av målinger skal vises. Eventuelt vil å ha sjekket "Legg til manager"-boksen Lagre alle figurene kvantifisert til en avkastning manager, som kan lagres for fremtidig referanse. Etter trykker OK, vil en "Resultater"-vindu komme opp som inneholder alle opplistede former og området målinger (figur 3F). - Kopiere og lime inn data fra vinduet "Resultater" i et regneark. Bruke funksjonen Summer matematiske i Excel summere alle områder av metastatisk lesjonene for bestemt lunge sektoren. For å vurdere prosent lunge svulst byrden av lunge skive, dividere summen av områdene i metastatisk lesjoner av det totale arealet av lunge sektoren. Denne parameteren er også kjent som området brøkdel (enA) som beskrives ytterligere ved Underwood 18.
Lunge svulst byrden = summen av metastatisk lesjon områder/totalt lunge skive - Beregne lunge svulst byrden for resten av avsnittene lunge i kontrollgruppen og Gjenstående grupper. Tegne gjennomsnittlig lunge svulst byrden per gruppe over 0, 3, 7 og 14 dager. Representant widefield fluorescerende bilder av høyt og lavt metastatisk OS menneskeceller vokser i PuMA modellen i progressiv tidspunkt vises (figur 4A). Et linjediagram viser fold-endringen (normalisert dag 0) i prosent metastatisk svulst byrden over tid vises (figur 4B).
4. AC confocal fluorescens Imaging av PuMA modellen
Merk: For AC confocal imaging, vev behandling er lik som i forrige avsnitt bortsett fra at større lunge skiver kuttes (hele tverrgående inndelinger, 1-2 mm tykk) for å tillate mer ROIs til å avbildes.
Merking av lunge parenchyma med DAR4M:
- Fordype lunge skiver i 10 μμM av DAR4M (i HBSS) for 45 min på 37 ° C. DAR4M etiketter reaktivt nitrogen arter i cellene av lungene.
- Etter 45 minutter med inkubering, skyll lunge skivene med fersk HBSS.
- Sted lunge sektoren i en 35 mm glass bunn parabolen, og bildet på AC confocal mikroskop.
- Tenkelig parameterne for eksempel bildene som vises i figur 5 er oppført i tabell 5.
- Kjøpe en Z-stabel for et område av interesse. Bruke foreslåtte Z skive tykkelsen for Nyquist prøvetaking. En representant film av en 3D-stabel viser grønne fluorescerende OS celler i DAR4M-merket lungevev tilbys i filmen 1 og supplerende film 1.
For eksempel AC confocal bilder vist i figur 5, var tenkelig økten terminal. Hvis langsgående bildebehandling, bruk av 2-fotonet eller flere Foton utstyrt AC confocal LSM mikroskop for bildebehandling anbefales siden det er mindre photodamage til levende vev19,20.
Bildebehandling mito-RFP uttrykke MG63 celler i PuMA modellen:
- Utføre PuMA protokollen som disposisjon i trinn 1 og 2 med bruk av MG63 celler uttrykke mito-RFP Konstruer.
- Sted lunge sektoren i en 35 mm glass bunn parabolen, og bildet på AC confocal mikroskop.
- Tenkelig parameterne for eksempel bilder vist i figur 6 er oppført i tabell 6. En representant film av en 3D-stabel viser grønne fluorescerende OS celler med rød fluorescerende mitokondrier tilbys i Movie 2 og supplerende Movie 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lav forstørrelse widefield fluorescens mikroskopi
For widefield fluorescens mikroskopi av PuMA lunge skiver vises representant bilder og kvantifisering data i figur 2C, og figur 4A og B. Metastatisk propensities for høy og lav metastatisk cellelinjer er visuelt tydelig over progressiv tidspunkt. MNNG celler kan effektivt kolonisere lungevev mens HOS celler ikke kan vokse på alle. Fra bildeanalyse finnes kvantitative data for å vurdere over tid som vist i grafen til figur 4B. Kjøp på lav forstørrelse (2,5 X) foretrekkes for å fange opp hele lunge sektoren i ett bilde. Denne metoden tillater satsvise avbildning av et stort antall PuMA skiver.
Høy forstørrelse AC confocal fluorescens mikroskopi
For AC confocal mikroskopi av PuMA lunge skiver, er representant bilder vist i figur 5. EGFP-uttrykke MG63 enkeltceller kan ses i figur 5A i forhold til lunge parenchyma, som er merket med DAR4M fluorescerende fargestoff i figur 5B. En sammenslåtte bildet vises i figur 5C, og et zoomet bilde av en fluorescerende svulst celle i et fartøy er vist i figur 5 d. 3D-filmer figur 5C og 5 D vises i filmen 1 og supplerende film 1, henholdsvis. AC confocal imaging subcellular strukturer som mitokondrier vises i figur 6. Cytosolic eGFP uttrykk tillater disposisjon kreftceller i figur 6A, og mitokondrier merket med RFP er vist i figur 6B. En sammenslåtte bildet vises i figur 6C. 3D-filmer av figur 6C vises i Movie 2 og supplerende Movie 2. Imaging subcellular strukturer som mitokondrier kan kombineres med andre fluorescerende etiketter å studere organelle biologi i metastatisk OS celler. Når du legger til flere etiketter, kontroller at laser linjene og utslipp filtre er kompatible med bestemte fluorophore/fluorescerende protein av interesse. Unngå imaging fluorophores/fluorescerende proteiner som eksitasjon og utslipp spectra tett overlapper.
Figur 1 : Diagrammet illustrerer metastatisk kaskade. Metastatisk kaskade kan deles inn i flere, hastighetsbegrensning delaktiviteter. (1) metastatisk tumor celler forlate det primære svulst området og invaderer i den lokale parenchyma; (2) tumor celler intravasating blod/lymphatic fartøyer og transitt i sirkulasjon; (3) svulst celle arrestert på det sekundære området. (4) svulst cellen bloduttredelse ut fra microvasculature og overlevelse i det sekundære området. (5) vekst i micrometastases; (6) vekst i Stangeriaceae utilslørt metastatisk svulst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Bildebehandling PuMA lunge skiver widefield fluorescens og AC confocal fluorescens mikroskopi plattformer. (A) eksempel PuMA skiver vises i et glass bunn 35 mm fat. (B) AC confocal mikroskop utstyr. (C) eksempel lav forstørrelse bilde av en PuMA skive med eGFP uttrykk OS celler. Scalebar = 0,5 mm. (D) eksempel AC confocal bilde av en subregion en PuMA sektoren. Scalebar = 100 μm. (*) Lunge parenchyma er merket rød av DAR4M (se innfelt) og (∇) peker på eGFP-uttrykke MG63 celler. Scalebar = 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . En lav-forstørrelse bildet av en PuMA skive med ImageJ. (A) PuMA originalbildet. (B) subtraksjon av bakgrunnen. (C) konvertering til en 8-biters avbildning. (D) terskelverdi bildet å markere fluorescerende kreftceller. (E) inversjon i bilde. (F) opplisting av diskrete figurer og kvantifisering av form områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Lav forstørrelse serielle bilder viser veksten av høyt og lavt metastatisk menneskelige OS celler i PuMA modellen over tid. (A) serielle bilder av svært metastatisk MNNG cellene og lav metastatisk HOS vises på 0, 3, 7 og 14 dager etter injeksjon. MNNG celler kan vokse bedre i den lunge microenvironment i motsetning til HOS cellene. Scalebar = 1 mm. (B) Fold-endring i prosent metastatisk svulst byrde for MNNG og HOS celler over tid vises som stolpediagrammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : AC confocal mikroskopi en DAR4M-merket PuMA lunge sektoren. Et representativt AC confocal bilde av eGFP-uttrykke MG63 celler i PuMA lungevev merket med DAR4M. (A) grønne kanalen viser eGFP-uttrykke MG63 celler (∇). (B) røde kanalen viser DAR4M fargestoff binding til reaktivt nitrogen arter i lunge parenchyma celler. Fargestoff høydepunkter lunge parenchyma (#), og strukturer som ligner en blodåre (*). Kanten av PuMA lunge er merket (↓). (C) fusjonerte grønne og røde bildet. Scalebar = 100 μm. (D) et zoomet bilde av den stiplede hvite boksen (fra C) viser en svulst celle i et fartøy. Scalebar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : AC confocal mikroskopi av mitokondrier i osteosarcoma celler i PuMA modellen. Et representativt AC confocal bilde av mitokondrier i eGFP-uttrykke MG63 celler. (A) grønne kanalen viser eGFP-uttrykke MG63 celler (∇). (B) røde kanalen viser RFP lokalisert til mitokondrier (*). (C) fusjonerte grønne og røde bildet. Scalebar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kultur medier | Oppskrift |
| Komplett medier (500mL) | • 440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 mL 10 X penn/strep løsning (10000U/mL) | |
| •5 mL L-glutamin (200 mM) | |
| A-Media (250mL) | •177.58 mL sterilt vann |
| •50 mL 10 X M-199 media | |
| •15 mL 7,5% natrium bikarbonat løsning | |
| •2.25 mL av 50 mM hydrocortizone | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetate (i sterilt vann) | |
| •5 mL 10 X penn/strep løsning (10000U/mL) | |
| •50 mL 10mg/ml bovin insulin | |
| B-media (500ml) | •427.6 mL sterilt vann |
| •50 mL 10 X M-199 media | |
| •15 mL 7,5% natrium bikarbonat løsning | |
| •2.25 mL av 50 mM hydrocortizone | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetate (i sterilt vann) | |
| •5 mL 10 X penn/strep løsning (10000U/mL) | |
| •50 mL 10mg/ml bovin insulin |
Tabell 1. Oppskrifter for komplett medier, en-media, B-media. Oppskrifter for cellekultur og media for PuMA analysen er oppført.
| Celle kultur reagenser | Beskrivelse | Katalog nr. | Selskapet |
| MNNG-HOS | svært metastatisk OS celle linje | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | dårlig metastatisk OS celle linje | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | svært metastatisk OS celle linje | I/T | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) |
| MG63 | dårlig metastatisk OS celle linje | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 media | Base media for en-media og B-media | 11825015 | Thermofisher |
| Destillert vann (steriliseres) | Komponent A-media & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-media | |||
| 7,5% natrium bikarbonat løsning | Komponent A-media & | 25080094 | Thermofisher |
| B-media | |||
| Hydrocortizone | Komponent A-media & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-media | |||
| Retinol acetate vann Pam | Del av en-media og B-media | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Penicillin/Streptomycin 10 X konsentrert (10000 U/ml) løsning | Komponent A-media & | 15140122 | Thermofisher |
| B-media, komplett | |||
| Storfe insulin løsning (10mg/ml) | Komponent A-media & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-media | |||
| DMEM, høy glukose | Base media av komplett | 11965092 | Thermofisher |
| L-glutamin (200 mM) | Komplett-komponent | 25030081 | Thermofisher |
| Fosterets bovin Serum | Komplett-komponent | 16000044 | Thermofisher |
| Dulbeccos fosfat bufret saltvann | Brukes i cellekultur | 14190144 | Thermofisher |
| Hanks bufret salter løsning, ingen kalsium, magnesium ingen, ingen fenol-rød | Brukes til å resuspend celle pellet før injeksjon | 14175095 | Thermofisher |
| Trypsin-EDTA (0,25%), fenol rød | Brukes i cellekultur | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Som merket lunge parenchyma | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tabell 2. Celle kultur reagenser for en-media, B-medier, og fullføre media. Media oppskrifter, reagenser og buffere er oppført med katalog antall og selskapet navn.
| Materialer | Beskrivelse | Katalog nr. | Selskapet |
| Zeiss 710 AC Confocal LSM | Oppreist LSM AC confocal mikroskopet | I/T | Zeiss |
| Zeiss 780 AC Confocal LSM | Invertert LSM AC confocal mikroskopet | I/T | Zeiss |
| SCID mus | NIKK. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, kvinnelig, alderen 6-8 uker | I/T | Charles elv |
| GelFoam | Brukt som en støtte for lunge vev deler | 59-9863 | Harvard apparater |
| SeaPlaque Agarose | Brukes under insufflation av lunge | 50100 | Lonza |
| 1 ml sprøyte med 27 måle p | Brukes for hale blodåre injeksjon | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 ml sprøyte | Brukes til insufflation av lunge | 309604 | BD |
| 20 gauge kateter | Brukes under insufflation av lunge | SR-OX2032CA | TERUMO |
| Abbott IV utvidelse angitt (30", Sterile) | Brukes under insufflation av lunge | 8342 | Medisca |
| Alkohol vattpinner | For tørke hale vene før injeksjon | 326895 | BD |
| Sterilt kirurgiske hansker | Asceptic deler av musen lungene | Varierer med størrelsen | Fisherscientific |
| 30 cm linjal | Brukes til insufflation av lunge | Stifter | |
| Støtte står for linjalen | Brukes til insufflation av lunge | HS29022A | Pipette.com |
| 35 mm glassbunn kultur parabol | Brukes under bildebehandling av lunge skiver | 81158 | Ibidi |
| Absorberende Underpads med vanntett fuktsperre | Brukes til sterilt arbeidsområdet i biologiske panseret | 56617-014 | VWR |
| Catgut ren absorberbare Sutur | Brukes til å knytte av cannulated trachea | I/T | Braun |
Tabell 3. Materialer til PuMA. Materialer kreves for PuMA protokollen er oppført med katalog antall og selskapet navn.
| Materialer | Beskrivelse | Katalog nr. | Selskapet |
| Mikro dissekere saks 3,5-tommers direkte Sharp/skarp | Kutte lunge inndelinger | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) lenge taggete rett ekstra delikat 0,5 mm tips | Manipulere/holde lunge inndelinger | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 cm) lenge taggete svak kurve 0,8 mm tips | Manipulere/holde lunge inndelinger | RS5135 | Roboz |
| Tommel Dressing tang; Taggete; Delikat; 4.5" lengde; 1.3 mm tips bredde | For generelle disseksjon | RS-8120 | Roboz |
| Tommel Dressing tang 4,5" taggete 2,2 mm tips bredde | For generelle disseksjon | RS-8100 | Roboz |
| Ekstra fin mikro Dissecting saks 3,5-tommers direkte Sharp/skarp, 20mm blad | For generelle disseksjon | RS-5880 | Roboz |
| Knapp saks; Rett; Skarp-Blunt; 27mm blad lengde; 4" lengde | For generelle disseksjon | RS-5960 | Roboz |
Tabell 4. Kirurgiske instrumenter for PuMA. Ulike rustfritt stål instrumenter i protokollen er oppført med katalog antall og selskapet navn.
| Parametere | 488 laser | 561 laser | |
| målet | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27 | ||
| strøm | 2% | 2% | |
| Pixel bor | 1,61 | 1,61 | |
| Gjennomsnitt | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Master gevinst | 820 | 814 | |
| Digital fortjene | 1 | 0,51 | |
| Digital forskyvning | -4.5 | -9.24 | |
| Pinhole | 51 | 57 | |
| Tunable Filter | 496-553 | 570-618 | |
Tabell 5. Parametere for AC confocal imaging av DAR4M-merket PuMA. Bestemt bildeparametere brukt som fått AC confocal bildene i dagens papir er gitt i tabellen.
| Parametere | 488 laser | 561 laser | |
| målet | Plan-Apochromat 63 x / 1.40 olje DIC M27 | ||
| strøm | 2% | 2% | |
| Pixel bor | 0,6 | 0,6 | |
| Gjennomsnitt | 2 (linje) | 2 (linje) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Master gevinst | 449 | 390 | |
| Digital fortjene | 1 | 1.23 | |
| Digital forskyvning | 0 | 0 | |
| Pinhole | 136 | 136 | |
| Tunable Filter | 493-550 | 566-703 | |
Tabell 6. Parametere for AC confocal avbildning av mitokondrier MG63 celler i PuMA delene. Bestemt bildeparametere brukt som fått AC confocal bildene i dagens papir er gitt i tabellen.
Ekstra figur 1: Gravity perfusjon apparatet. Tyngdekraften perfusjon apparatet brukes til å insufflate lunge med en flytende agarose/en-media løsning på 20 cm H20 hydrostatisk trykk. Agarose/en-media løsningen strømmet inn 10 mL sprøyte, som er festet med en IV forlengelsesslangen til cannulated luftrøret (vises ikke). Klikk her for å laste ned dette tallet.
Film 1: rotasjon av et 3D AC confocal z-stack bilde av eGFP-uttrykke OS celler i en DAR4M-merket PuMA lunge skive. DAR4M (rød kanal) brukes til å markere lunge parenchyma og eGFP-uttrykke MG63 celler kan også være sett (grønn kanal). Scalebar = 100 μm. Klikk her for å laste ned dette trekket.
Movie 2: rotasjon av et 3D AC confocal z-stack bilde av RFP-merket mitokondrier i eGFP-uttrykke OS celler i PuMA modellen. Subcellular organelles som mitokondrier vises merket med RFP (rød kanal) i eGFP-uttrykke MG63 celler (grønne kanalen) i PuMA modellen. Scalebar = 10 μm. Klikk her for å laste ned dette trekket.
Ekstra film 1: zoomet 3D-film i metastatisk OS cellen i et fartøy i lungen. En eGFP-uttrykke MG63 celle vises i fartøyet i lunge-microenvironment. Scalebar = 30 μM. Klikk her for å laste ned dette trekket.
Ekstra Movie 2: zoomet 3D-film av mitokondrier i en metastatisk OS celle i lungen. Mitokondrier merket med RFP vises i MG63 celler i lunge-microenvironment. Scalebar = 5 μM. Klikk her for å laste ned dette trekket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende tekniske artikkelen beskriver noen praktiske sider ved PuMA modellen i å studere lunge kolonisering i OS. Noen viktige skritt i protokollen der forskere bør ta ekstra forsiktighet omfatter følgende:
a) cannulation av trachea. Luftrøret kan lett skades mens dissekere den omkringliggende muskler og bindevev. I tillegg kan nålen av kateter lett bli presset gjennom luftrøret. Oppmerksom på hvordan skråkant nålen går inn i luftrøret ved innsetting av kanyle.
b) punktering eller skade overflaten av lungene. Lungene kan lett punktert eller skadet med dissekere saks mens fjerne sternum og utsette brystet hulrom. Vær forsiktig når du dissekere ut plukke fra brystet hulrom. Punktering eller skade overflaten av lungene vil føre det flytende agarose/en-mediet å lekke ut og lungene vil være deflatert.
c) fjerne overflødig media fra lunge deler mens imaging. Overflødig væske media rundt delen lunge kan forårsake "speilet" sett under microscope. Overflødig væske kan gjenspeile fluorescerende lys fra kreftceller dermed overdriver fluorescens området i bildet. Fjerning av overflødig media væske vil hindre denne gjenstand i bildet. Alternativt kan bilde gjenstanden fjernes under etterbehandling av bildene.
d) Photodamage av levende vev. Når du bruker en kvikksølv pære eller lasere av 1-fotonet mikroskop, må du begrense tiden utsatt for lyset. Intensitet/strøm andelen lyskilden kan også reduseres. Overeksponering for lyskilden kan forårsake photodamage til lungevev. Mikroskop utstyrt med lys emitting dioder (LED) eller 2-Foton/multi-photon mikroskop ville være ideelt fordi de produserer mindre photodamage under langsgående tenkelig studier.
PuMA modellen kan tilpasses og endret for å studere mange aspekter av lunge kolonisering. En annen variant av denne ex vivo er beskrevet av van den Bijgaart og kolleger 21. For studier er undersøke effekten av genet sammenleggbare eller anti-metastatisk narkotika aktivitet på svulst cellevekst i lungene, skaleringsprosenten tilbake antall celler injiseres fra 5 x 105 til 3 x 105 anbefalt siden effekten av intervensjon kan være maskert under eksponensiell vekst av en større celle innoculum. Flere studier har brukt PuMA modellen for å studere drivere lunge metastatisk progresjon 4,5,8,22,23,24. Ulike fluorescerende indikator fargestoffer eller fluorescerende reporter gener kan brukes til etiketten kreftceller for å fastslå endringer i celle fysiologi eller gene expression 8 i lunge-microenvironment.
En begrensning av PuMA modellen inkluderer et begrenset antall kompatible linjer. De etablerte cellelinjer som er kompatibel med denne analysen er oppført etter Mendoza og kolleger 3 . For høy og lav metastatisk osteosarcoma cellelinjer, oppfølging parene av clonally relaterte linjer har blitt funnet å vokse og opprettholde deres metastatisk tilbøyelighet i PuMA modellen: menneskelige MG63.3 & MG63 celler, MNNG & 143B og HOS celler, murine K7M2 og K12 celler. Forskere må empirisk bestemme hvorvidt deres linjer kan være levedyktig i B-medier. En annen begrensning å vurdere er et begrenset tidsrom lunge vev kan opprettholdes i vitro. Lungevev kan beholde sin cellulære komponenter for 30 dager, utover den tiden og cellulære komponenter av lunge begynner å dø ut. Derfor studere interaksjonen mellom kreftceller og lunge stromal celler må ikke overstige 30 dager.
PuMA modellen gir en enestående metode for å studere hvordan metastatisk OS celler kolonisere lungevev. Det mest slående aspektet av PuMA modellen kommer fra det faktum at flere lav metastatisk OS cellelinjer (HOS, MG63, K12), som i vivo fenotyper har vært preget andre steder 25, ikke kan vokse i PuMA modellen. Derimot har clonally relaterte svært metastatisk OS celler (MNNG, MG63.3, K7M2) en større tilbøyelighet til å kolonisere lunge vev i vivo25 og i PuMA modell. Dette tyder på at mobilnettet og ekstracellulære komponentene i lunge microenvironment som hindrer at lav metastatisk OS cellelinjer vokser i vivoer bevart i PuMA modellen selv blodstrøm. Med andre ord, utøver lunge-microenvironment av PuMA modellen fortsatt en "utvalg press" som hindrer at lav metastatisk OS cellene vokser i lungene. Faktisk studere høy metastatisk OS cellene vokse i PuMA er nyttige i å identifisere nye molekylær drivere metastatisk fenotypen 4,5. Videre genetisk ned-modulering av sa mål i svært metastatisk celler ble vist å redusere metastatisk kapasitet i både PuMA modellen og i vivo 5. Kandidaten anti-metastatisk medikament studier, PuMA modell kan brukes til å bestemme hvilke konsentrasjon område kan redusere metastatisk utvekst i lunge vev, som igjen kan deretter være godkjent i vivo.
Fremtidige anvendelser av denne modellen skal utnytte mengde kommersielt tilgjengelig fluorescerende fargestoffer og reporter gener for å dykke dypt inn grunnleggende biologi OS metastasering progresjon. Fluorescerende fargestoffer som 2, 7' - dichlorofluorescin diacetate eller dihydroethidium kan for eksempel brukes til å vurdere redoks kreftceller i PuMA modellen. Fluorescerende reporter gener kan brukes å studere organelle biologi eller vurdere promoter aktivitet for å avgjøre hvilke signalveier aktiveres i svært metastatisk OS celler under kolonisering prosessen. Disse kan brukes til å visualisere om en behandling har aktivitet i kreftceller vokser i lungene. Fluorescerende mikroskopi plattformer som produserer mindre photodamage vev, som LED utstyrte mikroskop eller 2-Foton/multiphoton AC confocal mikroskoper, kan brukes studere hvordan metastatisk OS cellene migrerer og invadere gjennom lunge vev. Videre kan vedheft interaksjoner mellom svulst cellene og lunge stromal overvåkes med fluorescerende reporter gener.
For å oppsummere, diskuterer dagens papir de praktiske sidene av PuMA modellen, først utviklet av Mendoza og kolleger 3. Et eksempel på bruk av lav-forstørrelse, widefield fluorescens mikroskopi og høy oppløsning AC confocal mikroskopi for å vurdere veksten av høyt og lavt metastatisk menneskeceller OS vises. Flere kritiske trinn av protokollen er beskrevet. I tillegg har fordeler og begrensninger av PuMA modellen vært diskutert. Fremtidige anvendelser av PuMA modellen å studere lunge kolonisering prosessen har blitt lagt frem, og håpet er at denne modellen vil ha en bredere bruk i osteosarcoma forskningen fellesskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Arnulfo Mendoza som gitt opplæring i PuMA teknikken. I tillegg ønsker vi å erkjenne Dr. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), og Sam Aparicio (BC kreft Agency) for å gi bruk av sine mikroskoper i løpet av denne studien. Denne forskningen ble støttet (delvis) av Intramural forskningsprogrammet av National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pediatric Oncology avdeling. M.M.L. ble støttet av National Institutes av helse Intramural besøke andre Program (pris 15335), og støttes av en Joan Parker Fellowship i metastasering forskning. P.H.S. støttes av British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
