ऑस्टियो में फेफड़े के मेटास्टेसिस परख का उपयोग मेटास्टेटिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण अध्ययन में व्यावहारिक विचार
Summary
इस अनुच्छेद के लक्ष्य को फेफड़े के मेटास्टेसिस परख (प्यूमा) के लिए प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करना है । यह मॉडल एक widefield प्रतिदीप्ति या फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फेफड़ों के ऊतकों में मेटास्टेटिक ऑस्टियो (OS) कोशिका वृद्धि का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं को अनुमति देता है ।
Abstract
फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस परख (प्यूमा) एक पूर्व vivo फेफड़ों explant और बंद सेल संस्कृति प्रणाली है कि शोधकर्ताओं ऑस्टियो में फेफड़ों औपनिवेशीकरण के जीवविज्ञान (ओएस) का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा । इस लेख प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है, और widefield या फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों का उपयोग मेटास्टेटिक विकास पर छवि डेटा प्राप्त करने के उदाहरण पर चर्चा । प्यूमा मॉडल का लचीलापन शोधकर्ताओं को न केवल फेफड़ों microenvironment में ओएस कोशिकाओं के विकास का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी समय के साथ विरोधी मेटास्टेटिक चिकित्सकीय के प्रभाव का आकलन करने के लिए. फोकल माइक्रोस्कोपी फेफड़ों पैरेन्काइमा के साथ अभूतपूर्व, ओएस सेल बातचीत के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, जब प्यूमा मॉडल फ्लोरोसेंट रंजक या फ्लोरोसेंट प्रोटीन आनुवंशिक पत्रकारों के साथ संयुक्त है, शोधकर्ताओं फेफड़े microenvironment, सेलुलर और सेलुलर संरचनाओं, जीन समारोह, और मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं में प्रमोटर गतिविधि का अध्ययन कर सकते हैं । प्यूमा मॉडल ऑस्टियो शोधकर्ताओं के लिए नए मेटास्टेसिस जीव विज्ञान की खोज और उपंयास विरोधी मेटास्टेटिक, लक्षित चिकित्सा की गतिविधि का आकलन करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
मेटास्टेटिक ऑस्टियो (ओएस) के साथ बाल चिकित्सा रोगियों के लिए बेहतर परिणाम अभी भी एक महत्वपूर्ण unmet नैदानिक आवश्यकता है 1। यह नई आणविक लक्षित चिकित्सा के विकास के महत्व को रेखांकित करता है । पारंपरिक chemotherapeutics है कि लक्ष्य ट्यूमर कोशिका प्रसार साबित नहीं किया है मेटास्टेटिक रोग के इलाज में कारगर है, और इस तरह उपंयास रणनीतियों मेटास्टेटिक प्रक्रिया ही 2लक्ष्य होना चाहिए । वर्तमान लेख पूर्व vivo फेफड़ों मेटास्टेसिस मॉडल के एक अपेक्षाकृत नए प्रकार के व्यावहारिक पहलुओं की चर्चा, फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस परख (प्यूमा) मेंडोज़ा और सहयोगियों द्वारा विकसित3, जो नए की खोज में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है ओएस 4में फेफड़ों मेटास्टेसिस प्रगति में आणविक ड्राइवरों,5. आगे बढ़ने से पहले, तथापि, यह समझदारी के लिए मेटास्टेसिस के कई मौजूदा मॉडलों पर संक्षेप में संपर्क होगा, और कैसे प्यूमा मॉडल पारंपरिक इन विट्रो परख पर कई लाभ प्रदान करता है ।
सबसे प्रयोगात्मक मॉडलों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया मेटास्टेसिस शामिल इन विट्रो और vivo में सिस्टम दोहराऊंगा या तो एक विशिष्ट कदम या मेटास्टेटिक झरना के कई कदम. इन चरणों में शामिल हैं: 1) ट्यूमर कोशिकाओं को प्राथमिक ट्यूमर से दूर पलायन, 2) पास के जहाजों में intravasation (रक्त या लसीका) और संचलन के भीतर पारगमन, 3) माध्यमिक साइट पर गिरफ्तारी, 4) extravasation और अस्तित्व में माध्यमिक साइट, 5) गठन micrometastases के, और 6) संवहनी मेटास्टेसिस (चित्रा 1) में वृद्धि. इन विट्रो में मेटास्टेसिस के मॉडल 2 आयामी (2d) प्रवास और 3 आयामी (3 डी) Matrigel आक्रमण परख जो विस्तार से समीक्षा कर रहे है कहीं 6में शामिल कर सकते हैं । vivo में मॉडल के लिए, दो आमतौर पर इस्तेमाल किया मॉडल सिस्टम में शामिल हैं: 1) सहज मेटास्टेसिस मॉडल है जहां एक ट्यूमर कोशिकाओं orthotopically एक विशिष्ट ऊतक प्रकार में इंजेक्शन के लिए एक स्थानीय ट्यूमर है जो सहज मेटास्टेटिक कोशिकाओं शेड फार्म कर रहे है दूर साइटों के लिए; 2) प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल है, जहां ट्यूमर कोशिकाओं को लक्ष्य अंग के रक्त वाहिका नदी के ऊपर में इंजेक्ट कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं के एक पूंछ नस इंजेक्शन के विकास फेफड़ों मेटास्टेसिस में परिणाम5,7,8। अंय प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल तिल्ली या mesenteric नस जो जिगर मेटास्टेसिस9,10के विकास में परिणाम में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन शामिल हैं । वीवो मॉडल में इन के व्यावहारिक विचार 11वेल्च द्वारा विस्तार से चर्चा कर रहे हैं । vivo में एक और मॉडल बाल चिकित्सा sarcomas में मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गुर्दे गुर्दे subcapsular ट्यूमर आरोपण मॉडल जो स्थानीय ट्यूमर गठन और फेफड़ों के लिए सहज मेटास्टेसिस में परिणाम 12,13है । ऐसे intravital videomicroscopy के रूप में एक और तकनीकी रूप से मांग तकनीक सीधे वास्तविक समय में, कल्पना कर सकते हैं, मेटास्टेटिक कैंसर की कोशिकाओं और एक मेटास्टेटिक साइट के microvasculature के बीच बातचीत (ie. फेफड़ों या जिगर) के रूप में मैकडोनाल्ड द्वारा वर्णित14 और Entenberg15, या कैंसर सेल extravasation chorioallantoic झिल्ली में 16किम द्वारा वर्णित के रूप में ।
प्यूमा मॉडल एक पूर्व vivo, फेफड़ों के ऊतक explant, बंद संस्कृति प्रणाली है जहां फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं के विकास longitudinally एक महीने की अवधि में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मनाया जा सकता है ( चित्रा 2aदेखें) । इस मॉडल मेटास्टेटिक झरना में फेफड़ों औपनिवेशीकरण (कदम 3 से 5) के प्रारंभिक चरणों recapitulates । इन विट्रो मॉडल में पारंपरिक से अधिक प्यूमा मॉडल के कुछ प्रमुख लाभ हैं: 1) यह longitudinally उपाय मेटास्टेटिक कैंसर कोशिका वृद्धि में एक 3d microenvironment है कि फेफड़ों के microenvironment के कई सुविधाओं को बरकरार रखती है के लिए एक अवसर प्रदान करता है वीवो 3; 2) प्यूमा अनुसंधानकर्ता को यह आंकलन करने की अनुमति देता है कि क्या किसी परीक्षार्थी के जीन या औषध उपचार के पछाड़ना में 3d लंग microenvironment के सन्दर्भ में एंटी-मेटास्टेटिक गतिविधि है; 3) प्यूमा मॉडल कई प्रकार के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों (चित्रा 2 बी) जैसे widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ लचीला है, प्रत्येक के उदाहरण चित्रा 2c और डीमें दिखाए जाते हैं, क्रमशः. इस लेख पर चर्चा करेंगे कैसे प्यूमा मॉडल का उपयोग करने के लिए बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मेटास्टेटिक वृद्धि पर अनुदैर्ध्य इमेजिंग डेटा प्राप्त (eGFP)-व्यक्त, मानव उच्च और निंन मेटास्टेटिक ऑस्टियो कोशिकाओं (MNNG और HOS कोशिकाओं, क्रमशः) का उपयोग कम आवर्धन widefield प्रतिदीप्ति । इमेजिंग के उदाहरण एक फ्लोरोसेंट डाई जो फेफड़ों पैरेन्काइमा लेबल, और एक लाल-फ्लोरोसेंट प्रोटीन आनुवंशिक रिपोर्टर जो ओएस सेल में प्यूमा मॉडल में फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर mitochondria लेबल भी चर्चा कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
निम्नलिखित तकनीकी लेख OS में फेफड़े के औपनिवेशीकरण का अध्ययन करने में प्यूमा मॉडल के कुछ व्यावहारिक पहलुओं का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम जहां शोधकर्ताओं अतिरिक्त ध्यान रखना चाह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ॰ Arnulfo मेंडोज़ा को धन्यवाद देना चाहेंगे जिन्होंने प्यूमा तकनीक में प्रशिक्षण प्रदान किया । इसके अतिरिक्त, हम डीआरएस को स्वीकार करना चाहेंगे । चांद खन्ना, Susan गारफील्ड (NCI/NIH), और सैम अपारिसियो (बीसी कैंसर एजेंसी) इस अध्ययन के दौरान उनके सूक्ष्मदर्शी का उपयोग प्रदान करने के लिए । इस शोध का समर्थन किया गया (भाग में) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, कैंसर अनुसंधान, बाल चिकित्सा कैंसर विज्ञान शाखा के लिए केंद्र के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा । M.M.L. स्वास्थ्य अंदर के राष्ट्रीय संस्थानों के साथी कार्यक्रम का दौरा (पुरस्कार १५३३५) द्वारा समर्थित था, और वर्तमान में मेटास्टेसिस अनुसंधान में एक Joan पार्कर फैलोशिप द्वारा समर्थित है । P.H.S. ब्रिटिश कोलंबिया कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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