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Cancer Research

ऑस्टियो में फेफड़े के मेटास्टेसिस परख का उपयोग मेटास्टेटिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण अध्ययन में व्यावहारिक विचार

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56332
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2BC Cancer Agency, Provincial Health Services Authority, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

Summary

इस अनुच्छेद के लक्ष्य को फेफड़े के मेटास्टेसिस परख (प्यूमा) के लिए प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करना है । यह मॉडल एक widefield प्रतिदीप्ति या फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फेफड़ों के ऊतकों में मेटास्टेटिक ऑस्टियो (OS) कोशिका वृद्धि का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं को अनुमति देता है ।

Abstract

फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस परख (प्यूमा) एक पूर्व vivo फेफड़ों explant और बंद सेल संस्कृति प्रणाली है कि शोधकर्ताओं ऑस्टियो में फेफड़ों औपनिवेशीकरण के जीवविज्ञान (ओएस) का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा । इस लेख प्रोटोकॉल का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है, और widefield या फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों का उपयोग मेटास्टेटिक विकास पर छवि डेटा प्राप्त करने के उदाहरण पर चर्चा । प्यूमा मॉडल का लचीलापन शोधकर्ताओं को न केवल फेफड़ों microenvironment में ओएस कोशिकाओं के विकास का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी समय के साथ विरोधी मेटास्टेटिक चिकित्सकीय के प्रभाव का आकलन करने के लिए. फोकल माइक्रोस्कोपी फेफड़ों पैरेन्काइमा के साथ अभूतपूर्व, ओएस सेल बातचीत के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, जब प्यूमा मॉडल फ्लोरोसेंट रंजक या फ्लोरोसेंट प्रोटीन आनुवंशिक पत्रकारों के साथ संयुक्त है, शोधकर्ताओं फेफड़े microenvironment, सेलुलर और सेलुलर संरचनाओं, जीन समारोह, और मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं में प्रमोटर गतिविधि का अध्ययन कर सकते हैं । प्यूमा मॉडल ऑस्टियो शोधकर्ताओं के लिए नए मेटास्टेसिस जीव विज्ञान की खोज और उपंयास विरोधी मेटास्टेटिक, लक्षित चिकित्सा की गतिविधि का आकलन करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है ।

Introduction

मेटास्टेटिक ऑस्टियो (ओएस) के साथ बाल चिकित्सा रोगियों के लिए बेहतर परिणाम अभी भी एक महत्वपूर्ण unmet नैदानिक आवश्यकता है 1। यह नई आणविक लक्षित चिकित्सा के विकास के महत्व को रेखांकित करता है । पारंपरिक chemotherapeutics है कि लक्ष्य ट्यूमर कोशिका प्रसार साबित नहीं किया है मेटास्टेटिक रोग के इलाज में कारगर है, और इस तरह उपंयास रणनीतियों मेटास्टेटिक प्रक्रिया ही 2लक्ष्य होना चाहिए । वर्तमान लेख पूर्व vivo फेफड़ों मेटास्टेसिस मॉडल के एक अपेक्षाकृत नए प्रकार के व्यावहारिक पहलुओं की चर्चा, फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस परख (प्यूमा) मेंडोज़ा और सहयोगियों द्वारा विकसित3, जो नए की खोज में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है ओएस 4में फेफड़ों मेटास्टेसिस प्रगति में आणविक ड्राइवरों,5. आगे बढ़ने से पहले, तथापि, यह समझदारी के लिए मेटास्टेसिस के कई मौजूदा मॉडलों पर संक्षेप में संपर्क होगा, और कैसे प्यूमा मॉडल पारंपरिक इन विट्रो परख पर कई लाभ प्रदान करता है ।

सबसे प्रयोगात्मक मॉडलों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया मेटास्टेसिस शामिल इन विट्रो और vivo में सिस्टम दोहराऊंगा या तो एक विशिष्ट कदम या मेटास्टेटिक झरना के कई कदम. इन चरणों में शामिल हैं: 1) ट्यूमर कोशिकाओं को प्राथमिक ट्यूमर से दूर पलायन, 2) पास के जहाजों में intravasation (रक्त या लसीका) और संचलन के भीतर पारगमन, 3) माध्यमिक साइट पर गिरफ्तारी, 4) extravasation और अस्तित्व में माध्यमिक साइट, 5) गठन micrometastases के, और 6) संवहनी मेटास्टेसिस (चित्रा 1) में वृद्धि. इन विट्रो में मेटास्टेसिस के मॉडल 2 आयामी (2d) प्रवास और 3 आयामी (3 डी) Matrigel आक्रमण परख जो विस्तार से समीक्षा कर रहे है कहीं 6में शामिल कर सकते हैं । vivo में मॉडल के लिए, दो आमतौर पर इस्तेमाल किया मॉडल सिस्टम में शामिल हैं: 1) सहज मेटास्टेसिस मॉडल है जहां एक ट्यूमर कोशिकाओं orthotopically एक विशिष्ट ऊतक प्रकार में इंजेक्शन के लिए एक स्थानीय ट्यूमर है जो सहज मेटास्टेटिक कोशिकाओं शेड फार्म कर रहे है दूर साइटों के लिए; 2) प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल है, जहां ट्यूमर कोशिकाओं को लक्ष्य अंग के रक्त वाहिका नदी के ऊपर में इंजेक्ट कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं के एक पूंछ नस इंजेक्शन के विकास फेफड़ों मेटास्टेसिस में परिणाम5,7,8। अंय प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल तिल्ली या mesenteric नस जो जिगर मेटास्टेसिस9,10के विकास में परिणाम में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन शामिल हैं । वीवो मॉडल में इन के व्यावहारिक विचार 11वेल्च द्वारा विस्तार से चर्चा कर रहे हैं । vivo में एक और मॉडल बाल चिकित्सा sarcomas में मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गुर्दे गुर्दे subcapsular ट्यूमर आरोपण मॉडल जो स्थानीय ट्यूमर गठन और फेफड़ों के लिए सहज मेटास्टेसिस में परिणाम 12,13है । ऐसे intravital videomicroscopy के रूप में एक और तकनीकी रूप से मांग तकनीक सीधे वास्तविक समय में, कल्पना कर सकते हैं, मेटास्टेटिक कैंसर की कोशिकाओं और एक मेटास्टेटिक साइट के microvasculature के बीच बातचीत (ie. फेफड़ों या जिगर) के रूप में मैकडोनाल्ड द्वारा वर्णित14 और Entenberg15, या कैंसर सेल extravasation chorioallantoic झिल्ली में 16किम द्वारा वर्णित के रूप में ।

प्यूमा मॉडल एक पूर्व vivo, फेफड़ों के ऊतक explant, बंद संस्कृति प्रणाली है जहां फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं के विकास longitudinally एक महीने की अवधि में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मनाया जा सकता है ( चित्रा 2aदेखें) । इस मॉडल मेटास्टेटिक झरना में फेफड़ों औपनिवेशीकरण (कदम 3 से 5) के प्रारंभिक चरणों recapitulates । इन विट्रो मॉडल में पारंपरिक से अधिक प्यूमा मॉडल के कुछ प्रमुख लाभ हैं: 1) यह longitudinally उपाय मेटास्टेटिक कैंसर कोशिका वृद्धि में एक 3d microenvironment है कि फेफड़ों के microenvironment के कई सुविधाओं को बरकरार रखती है के लिए एक अवसर प्रदान करता है वीवो 3; 2) प्यूमा अनुसंधानकर्ता को यह आंकलन करने की अनुमति देता है कि क्या किसी परीक्षार्थी के जीन या औषध उपचार के पछाड़ना में 3d लंग microenvironment के सन्दर्भ में एंटी-मेटास्टेटिक गतिविधि है; 3) प्यूमा मॉडल कई प्रकार के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों (चित्रा 2 बी) जैसे widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ लचीला है, प्रत्येक के उदाहरण चित्रा 2c और डीमें दिखाए जाते हैं, क्रमशः. इस लेख पर चर्चा करेंगे कैसे प्यूमा मॉडल का उपयोग करने के लिए बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मेटास्टेटिक वृद्धि पर अनुदैर्ध्य इमेजिंग डेटा प्राप्त (eGFP)-व्यक्त, मानव उच्च और निंन मेटास्टेटिक ऑस्टियो कोशिकाओं (MNNG और HOS कोशिकाओं, क्रमशः) का उपयोग कम आवर्धन widefield प्रतिदीप्ति । इमेजिंग के उदाहरण एक फ्लोरोसेंट डाई जो फेफड़ों पैरेन्काइमा लेबल, और एक लाल-फ्लोरोसेंट प्रोटीन आनुवंशिक रिपोर्टर जो ओएस सेल में प्यूमा मॉडल में फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर mitochondria लेबल भी चर्चा कर रहे हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल जिसमें से इमेजिंग डेटा प्राप्त किया गया था पशु देखभाल और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन कर रहे थे । सभी पशु प्रोटोकॉल पर चर्चा की और लेख वीडियो में चित्रित ब्रिटिश कोलंबिया पशु देखभाल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. इंजेक्शन और प्यूमा मॉडल के लिए सामग्री के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी

नोट: 1 माउस के लिए समाधान और कक्षों की मात्रा पर्याप्त होगी । अध्ययन में अधिक चूहों का उपयोग किया जाता है, तो आवश्यक के रूप में स्केल । मीडिया व्यंजनों के लिए, तालिका 1 और तालिका 2देखें ।

  1. एक-मीडिया के पूर्व गर्म 5 मिलीलीटर में एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में एक 37 ओसी पानी स्नान ।
  2. पिघल 1.2% कम पिघलने agarose समाधान (बाँझ पानी में) प्रयोगशाला माइक्रोवेव का उपयोग कर ।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पिघला हुआ agarose के 5 मिलीलीटर स्थानांतरण, और एक 37 ओसी पानी स्नान में गर्म रखना । सुनिश्चित करें कि पिघला agarose 37 ओसी और तरल फेफड़ों सांस कदम से पहले पर है ।
  4. सेल के पूर्व चिल 30 मिलीलीटर-संस्कृति ग्रेड पंजाबियों एक बर्फ बाल्टी में 1x कलम/strep के साथ पूरक ।
  5. एक अच्छी तरह से एक 6 की थाली में, पूर्व बी के 1.5 मिलीलीटर मीडिया में एक जिलेटिन स्पंज सोख । स्पंज फेफड़ों के स्लाइस के लिए समर्थन लंगर होगा ।
  6. सुनिश्चित करें कि OS कोशिकाओं के बारे में 70-90% प्रक्रिया के दिन पर धाराप्रवाह हैं । कोशिकाओं है कि अधिक धाराप्रवाह या यदि मीडिया पीले रंग के बाद से कोशिकाओं को आमतौर पर जोर दिया और इस बिंदु पर व्यवहार्यता कम हो रहे है का उपयोग न करें । ऑस्टियो सेल लाइंस, MNNG और HOS के लिए, 100 μL की मात्रा में 5 x 105 को 1 चूहे की पूंछ की नस में इंजेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । ऊपर तदनुसार अगर अधिक चूहों अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है ।
  7. फसल 0.25% trypsin-EDTA (एक T75 कुप्पी या एक 10 सेमी संस्कृति डिश में 2 मिलीलीटर के लिए 3 मिलीलीटर) का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं । जब कोशिकाओं को बंद प्लेट लिफ्ट करने के लिए शुरू कर रहे हैं, पूरी मीडिया के साथ trypsin-EDTA बेअसर । कोशिकाओं नीचे स्पिन और सेल संस्कृति ग्रेड पंजाबियों के साथ एक बार कुल्ला । पंजाब के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  8. मानक विधियों द्वारा कोई कक्ष गणना निष्पादित करें । यह क्या वास्तव में सेल निलंबन के नुकसान के बाद से अक्सर सुई ड्रा अप और विफल इंजेक्शन के प्रयास के दौरान होता है की जरूरत से अधिक सेल निलंबन बनाने के लिए सबसे अच्छा है ।
  9. कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए सेल निलंबन के एक नमूने पर एक Trypan-नीले अपवर्जन परख करते हैं । तभी आगे बढ़ें जब सेल 90% व्यवहार्यता या उच्चतर दिखाएं ।
  10. 100 μL की मात्रा में 5 x 105 कोशिकाओं सुई । इस राशि के 2x के एक अतिरिक्त तैयार करने के लिए, 1 x 106 कोशिकाओं नीचे घूमती है और HBSS के 0.2 मिलीलीटर में reसस्पैंड किया जाना चाहिए ।
  11. इंजेक्शन के लिए चूहों की तैयारी करते समय एक आइस बकेट में सेल सस्पेंशन लगाएं ।

2. पूंछ नस इंजेक्शन और फेफड़ों सांस

नोट: इस अनुभाग में समाधान और कक्षों की मात्रा 1 माउस के लिए पर्याप्त होगी । अध्ययन में अधिक चूहों का उपयोग किया जाता है, तो आवश्यक के रूप में स्केल । उपकरण, सामग्री और शल्य चिकित्सा उपकरणों की एक सूची के लिए निंनलिखित चरणों में इस्तेमाल किया, तालिका 3 और तालिका 4का संदर्भ लें ।

  1. एक महिला माउस (आयु 6-8 सप्ताह) 5 मिनट के लिए एक हीटिंग लैंप के तहत गर्म करने के लिए उनकी पूंछ नस अधिक स्पष्ट रूप से जाहिर करने के लिए । murine K7M2 या K12 कोशिकाओं के लिए, बालब/ मानव मिलीग्राम 63.3, MG63, MNNG, और HOS कोशिकाओं के लिए, गंभीर संयुक्त इम्यूनो चूहों का उपयोग करें ।
  2. सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन धीरे ट्यूब मिलाते हुए वर्दी है । ध्यान से सुई के बिना 1 मिलीलीटर सिरिंज में सेल निलंबन आकर्षित । एक 27 गेज सुई के साथ सिरिंज कैप. सुई बेवल सुई पर मात्रा चिह्नों के रूप में एक ही पक्ष पर है सुनिश्चित करें.
  3. छलनी में माउस रखें, और एक शराब पोंछ के साथ झाड़ू पूंछ ।
  4. एक पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन और सेल निलंबन के 100 μL इंजेक्षन करने के लिए आगे बढ़ें । इंजेक्शन के बाद 5 मिनट, एक सह2 चैंबर में माउस प्लेस और इच्छामृत्यु मानक संचालन प्रक्रिया शुरू (के रूप में अपने संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा रूपरेखा) । ग्रीवा विस्थापन इच्छामृत्यु का एक साधन के रूप में नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि प्रक्रिया श्वासनली नुकसान होगा ।
  5. एक बार माउस euthanized है, agarose के साथ माउस फेफड़े के सांस के लिए लामिना प्रवाह हुड की तैयारी शुरू/ लामिना प्रवाह हुड के भीतर, अपने बाँझ पैड के साथ एक कार्य क्षेत्र की स्थापना की । इस पैड पर आप अपने निष्फल उपकरणों, चतुर्थ कैथेटर, चतुर्थ विस्तार सेट, और गुरुत्वाकर्षण छिड़काव तंत्र जगह होगी ( पूरक चित्रा 1देखें) ।
  6. माउस पृष्ठीय recumbancy में रखें । बाँझ छोटे कैंची के साथ, ध्यान से बाहर काटना उरोस्थि छाती गुहा बेनकाब करने के लिए । एक agarose/एक मीडिया समाधान फेफड़ों insufflate करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के बाद से फेफड़ों पंचर नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
  7. जब उरोस्थि बाहर विदारक, काटना दोनों पक्षों श्वासनली पर वक्ष प्रवेश पिछले । दूर आसपास के कोमल ऊतक विदारक द्वारा श्वासनली बेनकाब ।
  8. एक 20 गेज चतुर्थ कैथेटर के साथ श्वासनली Cannulate । ढीला एक शल्य cannulated श्वासनली के आसपास बाँझ catgut सीवन का उपयोग कर गांठ टाई ।
  9. गुरुत्वाकर्षण छिड़काव तंत्र के 10 मिलीलीटर सिरिंज के लिए कैथेटर श्वासनली से सेट एक चतुर्थ विस्तार संलग्न करें ।
  10. पूर्व-गर्म 37 ओसी agarose (5 मिलीलीटर) और एक-एक 1:1 के मिश्रण में मीडिया (5 मिलीलीटर) का मिश्रण । गुरुत्वाकर्षण छिड़काव डिवाइस के 10 मिलीलीटर सिरिंज में तरल agarose/A-मीडिया समाधान डालना. agarose/एक मीडिया समाधान के साथ फेफड़ों के सांस करने से पहले, सुनिश्चित करें कि विस्तार सेट की पूरी लंबाई agarose के साथ प्राइम किया गया है/एक मीडिया, जिससे हवा के साथ फेफड़ों के नमूनों की अनजाने सांस को नकारने ।
  11. फेफड़ों को agarose/एक मीडिया समाधान जब तक फेफड़ों पूरी तरह से insufflated है भरें ।
  12. एक बार फेफड़ों पूरी तरह से insufflated है, प्रवेशनी को दूर करने और मजबूती से agarase के रिसाव को रोकने के लिए सर्जिकल गांठ टाई/श्वासनली के माध्यम से मीडिया समाधान ।
  13. छाती गुहा से बांधना (श्वासनली, दिल, और फेफड़ों) बाहर काटना करने के लिए आगे बढ़ें । पंचर या फेफड़ों की सतह को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
  14. जगह बांधना (कोई विशेष अभिविंयास में) पूर्व में-पंजाब की 30 मिलीलीटर ठंडा 1x कलम के साथ पूरक/strep, और agarose/एक मीडिया 20 मिनट के लिए जमना के लिए अनुमति देते हैं ।
  15. ठीक कैंची और चिमटी का प्रयोग, फेफड़ों के छोटे टुकड़े में कटौती (3 मिमी x 1.5 मिमी) के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया है । छोटे फेफड़ों के स्लाइस आसानी से एक 2.5 x उद्देश्य का उपयोग कर imaged किया जा सकता है । एक से अधिक स्लाइसें प्रति प्रयोगात्मक शर्त, आमतौर पर प्रति समूह 4-10 स्लाइस काटा जा सकता है ।
    नोट: प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए, एक अलग अच्छी तरह से (6-अच्छी तरह से प्लेट) एक 2 एक्स 2 सेमी जिलेटिन स्पंज पूर्व बी मीडिया में लथपथ युक्त में फेफड़ों के स्लाइस रखें । मीडिया की मात्रा प्रति कुआं 1.5 मिलीलीटर होनी चाहिए । मीडिया को हर 2-3 दिन में बदल दीजिये । दवा अध्ययन के लिए, मीडिया/दवा बदलने की आवृत्ति उपयोगकर्ता निर्धारित है ।

3. Widefield प्रतिदीप्ति फेफड़ों के स्लाइस और विश्लेषण की इमेजिंग

नोट: widefield प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, छोटे स्लाइस में काट रहे हैं (3 मिमी x 1.5 मिमी x 1 मिमी) एक 2.5 x उद्देश्य का उपयोग कर 1 छवि में फेफड़ों अनुभाग फिट करने के लिए.

एक widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर छवि अधिग्रहण:

  1. फेफड़े के स्लाइस आमतौर पर 0, 3, 7, और 14 दिनों के बाद इंजेक्शन में imaged रहे हैं । जैविक कैबिनेट के बाँझ वातावरण में, ध्यान से एक बाँझ 35 मिमी गिलास नीचे दौर पकवान के लिए जिलेटिन स्पंज से फेफड़ों के स्लाइस हस्तांतरण । अतिरिक्त तरल पदार्थ एक दर्पण के रूप में कार्य करेगा और फ्लोरोसेंट प्रकाश ट्यूमर कोशिकाओं से आने को प्रतिबिंबित के रूप में फेफड़ों के स्लाइस से अतिरिक्त तरल पदार्थ बंद ढाब करने के लिए ध्यान रखना ।
  2. चित्र 1aमें चित्रित एक समान तरीके से फेफड़ों के स्लाइस को व्यवस्थित करें । प्रत्येक स्तंभ एक अलग प्रायोगिक शर्त का प्रतिनिधित्व करेगा । फेफड़ों को चिमटी से पार न करने के लिए ध्यान रखें । एक और प्रयोगात्मक समूह से फेफड़ों के स्लाइस से निपटने से पहले 70% इथेनॉल और सूखी के साथ कुल्ला ।
  3. अनुकूलन इमेजिंग पैरामीटर (ie. लाभ, ऑफसेट, जोखिम समय, बिन्नी) कि फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं और नियंत्रण (वाहन अनुपचारित) समूह में पृष्ठभूमि फेफड़ों के ऊतकों के बीच सबसे अच्छा विपरीत प्रदान करता है । प्रायोगिक समूहों की छवि के लिए नियंत्रण समूह से एक ही पैरामीटर का उपयोग करें । tiff छवि स्वरूप के रूप में सहेजें ।
  4. एक स्केल संदर्भ के लिए, एक ही उद्देश्य में एक माइक्रोमीटर का एक डिजिटल चित्र ले लो ।
  5. समय के साथ फेफड़ों ऑटो प्रतिदीप्ति परिवर्तन के बाद से, इमेजिंग पैरामीटर नियंत्रण फेफड़ों प्रत्येक इमेजिंग सत्र के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । एक सत्र के लिए इमेजिंग पैरामीटर अनिवार्यतः क्रमिक इमेजिंग सत्रों के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है ।

छवि विश्लेषण:
नोट: निंनलिखित छवि प्रसंस्करण कदम ImageJ 1.51 एच सॉफ्टवेयर पैकेज 17के साथ किया जाता है ।

  1. ImageJ (चित्र 3ए) में एक छवि फ़ाइल खोलें ।
  2. पृष्ठभूमि घटाना: प्रक्रिया > पृष्ठभूमि घटाना > रोलिंग गेंद त्रिज्या (50 पिक्सल के साथ शुरू), अचयनित "प्रकाश पृष्ठभूमि" (चित्र बी) ।
  3. छवि को 8-बिट फ़ॉर्मेट में कनवर्ट करें: छवि > प्रकार > 8-बिट (चित्र 3 c) ।
  4. इकाइयों को पिक्सेल सेट करें: छवि > लंबाई की इकाई में "पिक्सेल" दर्ज करें, "पिक्सेल चौड़ाई", "पिक्सेल ऊंचाई", "Voxel गहराई" में 1 दर्ज करें । बाद की छवियों के लिए लागू करने के लिए "वैश्विक" बॉक्स की जाँच करें ।
  5. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके, पूरे फेफड़ों के स्लाइस के आकार को बाह्यरेखांकित करें और कुल फेफड़ों के स्लाइस का क्षेत्र (पिक्सेल2) निर्धारित करें । यह मान फेफड़ों के प्रतिशत ट्यूमर बोझ की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  6. सीमा छवि: छवि > समायोजित > दहलीज > हाइलाइट "डिफ़ॉल्ट" और "B & W" > स्लाइडर को थ्रेशोल्ड करने के लिए छवि इस तरह का उपयोग करें कि ट्यूमर कोशिकाओं के बहुमत सही प्रकाश डाला है. दबाने "लागू करें" एक काले और सफेद छवि जहां फेफड़ों सभी काले है में परिणाम होगा, और फ्लोरोसेंट घावों सफेद (चित्रा 3 डी) हैं । दबाने "लागू करें" एक दूसरी बार छवि जहां सभी फ्लोरोसेंट संरचनाओं अब काले आकार (चित्रा 3E) है पलटना होगा ।
  7. घावों की संख्या और आकार की ठहराव:
    विश्लेषण > सेट माप > चेक "क्षेत्र". अंय सभी बक्सों को अनचेक करें ।
    कणों का विश्लेषण करें > आकार (पिक्सेल2): 0-इन्फिनिटी उन आकृतियों की श्रेणी का प्रतिनिधित्व करता है जो ImageJ की गणना करेंगे । Empirically 0 वाहन छवियों दिन में एक एकल ट्यूमर सेल माना जाता है कि सबसे छोटा घाव निर्धारित करते हैं । डेटा सेट में शेष छवियों के लिए निचली सीमा के रूप में इस एकल ट्यूमर कक्ष के क्षेत्र का उपयोग करें । इस पेपर में प्रस्तुत किए गए कार्य के लिए 11 पिक्सेल2 निचली सीमा के रूप में सेट किया गया है । वीडियो उदाहरण में प्रस्तुत कार्य के लिए, 24 पिक्सेल2 निचली सीमा के रूप में सेट किया गया है । 0-1 के रूप में "परिपत्र" श्रेणी छोड़ दें । "शो" के लिए "कुछ नहीं" सेट किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, यदि "दिखाएं" और "रूपरेखा" चयनित है, तो सभी बाह्यरेखांकित आकृतियों का आरेखण जनरेट किया गया है । जांच "प्रदर्शन परिणाम" माप की एक अलग खिड़की के लिए पॉप अप करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, होने "प्रबंधक में जोड़ें" बॉक्स की जांच की सभी आकृतियों एक रॉय प्रबंधक है, जो भविष्य के संदर्भ के लिए बचाया जा सकता है quantified को बचाने के लिए होगा । ठीक दबाने के बाद, एक "परिणाम" खिड़की सभी गणना की आकृतियों और क्षेत्र माप (चित्रा 3F) युक्त पॉप जाएगा.
  8. कॉपी और एक स्प्रेडशीट में "परिणाम" खिड़की से डेटा पेस्ट करें । उस विशेष फेफड़े के स्लाइस के लिए मेटास्टेटिक घावों के सभी क्षेत्रों का योग करने के लिए एक्सेल में योग गणितीय समारोह का उपयोग करें । फेफड़ों के स्लाइस का प्रतिशत फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का आकलन करने के लिए, फेफड़ों के स्लाइस के कुल क्षेत्र द्वारा मेटास्टेटिक घावों के क्षेत्रों के योग को विभाजित करें । यह पैरामीटर क्षेत्र भिंन (aa) के रूप में भी जाना जाता है जिसे अंडरवुड 18द्वारा आगे बताया गया है ।
    फेफड़ों के ट्यूमर का बोझ = फेफड़ों के स्लाइस के कुल क्षेत्र/मेटास्टेटिक घावों क्षेत्रों का योग
  9. नियंत्रण समूह और शेष समूहों में फेफड़ों के वर्गों के आराम के लिए फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ की गणना । 0, 3, 7 और 14 दिनों में समूह प्रति औसत फेफड़ों के ट्यूमर बोझ प्लाट । प्रतिनिधि उच्च और कम मेटास्टेटिक मानव ओएस widefield के फ्लोरोसेंट चित्र प्रगतिशील समय अंक में प्यूमा मॉडल में बढ़ रही (चित्र 4a) दिखाया जाता है । एक पंक्ति गुना दिखा ग्राफ (0 दिन के लिए सामान्यीकृत) प्रतिशत मेटास्टेटिक ट्यूमर बोझ में समय के साथ दिखाया गया है (चित्रा 4B) ।

4. द प्यूमा मॉडल का फोकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग

नोट: फोकल इमेजिंग के लिए, ऊतक प्रसंस्करण कि बड़े फेफड़े के स्लाइस (पूरा अनुप्रस्थ वर्गों, 1-2 मिमी मोटी) अधिक ROIs के लिए अनुमति देने के लिए काट रहे है सिवाय इसके कि पिछले अनुभाग में करने के लिए समान है imaged ।

DAR4M के साथ लंग पैरेन्काइमा का ्र:

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए DAR4M के 10 μμM (HBSS में) में फेफड़ों के स्लाइस विसर्जित कर दिया । DAR4M लेबल प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों के भीतर फेफड़ों की कोशिकाओं ।
  2. मशीन के 45 मिनट के बाद, ताजा HBSS के साथ फेफड़ों के स्लाइस कुल्ला ।
  3. एक 35 मिमी गिलास नीचे दौर पकवान में फेफड़ों टुकड़ा प्लेस, और फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि ।
  4. चित्र 5 में दिखाए गए उदाहरण छवियों के लिए इमेजिंग पैरामीटर्स तालिका 5में सूचीबद्ध हैं ।
  5. ब्याज के क्षेत्र के लिए एक जेड-स्टैक प्राप्त करना । Nyquist नमूना के लिए सुझाए गए Z स्लाइस मोटाई का उपयोग करें । एक 3 डी DAR4M में हरी फ्लोरोसेंट ओएस कोशिकाओं दिखा ढेर के एक प्रतिनिधि फिल्म-लेबल फेफड़ों के ऊतकों फिल्म 1 और पूरक फिल्म 1में प्रदान की जाती है ।

उदाहरण के लिए, चित्रा 5में दिखाया गया फोकल चित्र, इमेजिंग सत्र टर्मिनल था । यदि अनुदैर्ध्य इमेजिंग की आवश्यकता है, इमेजिंग के लिए एक 2-फोटॉन या बहु-फोटॉन सुसज्जित फोकल LSM माइक्रोस्कोप के उपयोग के बाद से वहां के ऊतकों को कम धूप है19,20के रहने की सलाह दी है ।
इमेजिंग मिळो-प्यूमा मॉडल में MG63 कोशिकाओं आरएफपी व्यक्त:

  1. प्यूमा प्रोटोकॉल के रूप में बाह्यरेखा चरण 1 और 2 में MG63 कोशिकाओं का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन मिळो-आरएफपी का निर्माण ।
  2. एक 35 मिमी गिलास नीचे दौर पकवान में फेफड़ों टुकड़ा प्लेस, और फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि ।
  3. आरेख 6 में दिखाए गए उदाहरण छवियों के लिए इमेजिंग पैरामीटर्स तालिका 6में सूचीबद्ध हैं । एक 3 डी लाल फ्लोरोसेंट mitochondria के साथ हरी फ्लोरोसेंट ओएस कोशिकाओं दिखा ढेर के एक प्रतिनिधि फिल्म फिल्म 2 और पूरक फिल्म 2में प्रदान की जाती है ।

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Representative Results

कम आवर्धन widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

प्यूमा फेफड़े के स्लाइस के widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, प्रतिनिधि छवियों और ठहराव डेटा चित्रा 2cऔर चित्रा 4a और बीमें दिखाए जाते हैं । उच्च और कम मेटास्टेटिक सेल लाइनों के लिए मेटास्टेटिक प्रवृत्तियां प्रगतिशील समय अंक पर नेत्रहीन स्पष्ट कर रहे हैं । MNNG कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक फेफड़ों के ऊतकों उपनिवेश कर सकते हैं, जबकि HOS कोशिकाओं को विकसित नहीं कर सकता । छवि विश्लेषण से, मात्रात्मक डेटा को समय के साथ वृद्धि का आकलन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है जैसा कि चित्र 4Bके ग्राफ़ में दिखाया गया है । कम आवर्धन पर अधिग्रहण (2.5 x) एक छवि में पूरे फेफड़ों टुकड़ा पर कब्जा करने के क्रम में पसंद है । इस विधि एक बड़ी संख्या प्यूमा स्लाइस के बैच इमेजिंग परमिट ।

उच्च आवर्धन फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

प्यूमा फेफड़े के स्लाइस के फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, प्रतिनिधि छवियों चित्रा 5में दिखाया गया है । व्यक्तिगत eGFP-एक्सप्रेस MG63 कोशिकाओं को फेफड़े के पैरेन्काइमा, जो चित्रा 5Bमें DAR4M फ्लोरोसेंट डाई द्वारा लेबल है के संबंध में चित्रा 5 में देखा जा सकता है । मर्ज की गई छवि चित्रा 5Cमें दिखाई गई है, और एक पोत में एक फ्लोरोसेंट ट्यूमर सेल की एक ज़ूम की गई छवि चित्रा 5dमें दिखाई गई है । चित्रा 5C और 5d की 3 डी फिल्में फिल्म 1 और पूरक फिल्म 1, क्रमशः में दिखाए जाते हैं । mitochondria जैसे उपसेलुलर संरचनाओं का फोकल इमेजिंग चित्रा 6 में दिखाया गया है । Cytosolic eGFP-व्यंजक आरेख 6Aमें बाह्यरेखा ट्यूमर कक्षों को अनुमति देता है, और आरएफपी के साथ लेबल किए गए mitochondria चित्र घमण्डमें दिखाए जाते हैं. कोई मर्ज की गई छवि आरेख 6Cमें देखी जाती है । चित्रा 6C की 3d फिल्में फिल्म 2 और पूरक फिल्म 2में दिखाए जाते हैं. इमेजिंग mitochondria के रूप में सेलुलर संरचनाओं अंय फ्लोरोसेंट लेबल के साथ संयुक्त किया जा सकता है मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं में organelle जीवविज्ञान का अध्ययन । जब अधिक लेबल जोड़ने, सुनिश्चित करें कि लेजर लाइनों और उत्सर्जन फिल्टर विशेष fluorophore के साथ संगत कर रहे है/ इमेजिंग fluorophores/फ्लोरोसेंट प्रोटीन जिसका उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा बारीकी से ओवरलैप से बचें ।

Figure 1
चित्र 1 : मेटास्टेटिक झरना चित्रण आरेख । मेटास्टेटिक झरना कई, दर सीमित कदम में नीचे टूट सकता है । (1) मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं प्राथमिक ट्यूमर साइट छोड़ने और स्थानीय पैरेन्काइमा में आक्रमण; (2) ट्यूमर कोशिकाओं रक्त/लसीका वाहिकाओं और संचलन के भीतर पारगमन में intravasating; (3) माध्यमिक साइट पर ट्यूमर सेल गिरफ्तारी; (4) ट्यूमर सेल माध्यमिक साइट में microvasculature और अस्तित्व से बाहर extravasation; (५) micrometastases में वृद्धि; (6) संवहनीय प्रकट मेटास्टेटिक ट्यूमर में वृद्धि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : इमेजिंग प्यूमा फेफड़ों widefield प्रतिदीप्ति और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों का उपयोग कर स्लाइसें । (क) उदाहरण प्यूमा स्लाइस एक गिलास नीचे 35 मिमी डिश में दिखाए जाते हैं । (ख) फोकल माइक्रोस्कोप उपकरण । (ग) eGFP-अभिव्यक्ति OS कोशिकाओं के साथ एक प्यूमा स्लाइस के उदाहरण कम-आवर्धन छवि । Scalebar = 0.5 mm. (D) एक प्यूमा स्लाइस के एक उपक्षेत्र के उदाहरण के फोकल छवि । Scalebar = 100 माइक्रोन । (*) लंग पैरेन्काइमा को DAR4M (see इनसेट) और (∇) पॉइंट बाय eGFP-expressिंग MG63 कोशिकाओं से लाल रंग का लेबल है । Scalebar = 30 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . ImageJ का उपयोग कर एक प्यूमा स्लाइस के एक कम आवर्धन छवि प्रसंस्करण । (क) मूल प्यूमा छवि । (ख) पृष्ठभूमि का घटाव । (C) एक 8-bit छवि में रूपांतरण । (घ) फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं को उजागर करने के लिए छवि थ्रेसहोल्ड । (ङ) छवि का उलटा । (च) आकार क्षेत्रों के असतत आकृतियों और ठहराव के गणन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . कम आवर्धन धारावाहिक समय के साथ प्यूमा मॉडल में अत्यधिक और कम मेटास्टेटिक मानव ओएस कोशिकाओं की वृद्धि दिखा छवियां । (क) अत्यधिक मेटास्टेटिक MNNG कोशिकाओं और कम मेटास्टेटिक HOS कोशिकाओं के धारावाहिक छवियों 0, 3, 7, और 14 दिनों के बाद इंजेक्शन में दिखाया जाता है । MNNG कोशिकाओं HOS कोशिकाओं के विपरीत फेफड़ों microenvironment में बेहतर विकसित करने में सक्षम हैं । Scalebar = 1 मिमी. (ख) समय के साथ MNNG और HOS कोशिकाओं के लिए प्रतिशत मेटास्टेटिक ट्यूमर के बोझ में गुना-परिवर्तन लाइन रेखांकन के रूप में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : एक DAR4M की फोकल माइक्रोस्कोपी-लेबलेड प्यूमा फेफड़े स्लाइस । DAR4M के साथ लेबल प्यूमा फेफड़े के ऊतकों में eGFP-व्यक्त MG63 कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि फोकल छवि । (क) eGFP-व्यक्त MG63 कोशिकाओं (∇) दिखा ग्रीन चैनल. (ख) फेफड़ों पैरेन्काइमा कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों के लिए DAR4M डाई बाइंडिंग दिखा लाल चैनल. डाई फेफड़ों पैरेन्काइमा (#) पर प्रकाश डाला गया, और संरचनाओं एक रक्त वाहिका जैसी (*) । प्यूमा फेफड़ों के खंड के किनारे चिह्नित (↓) है. (ग) हरे और लाल छवि विलय कर । Scalebar = 100 माइक्रोन । (घ) धराशायी सफेद बॉक्स (सी से) की एक छवि ज़ूम एक पोत में एक ट्यूमर सेल से पता चलता है । Scalebar = 50 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : प्यूमा मॉडल में ऑस्टियो कोशिकाओं में mitochondria की फोकल माइक्रोस्कोप । eGFP-व्यक्त MG63 कोशिकाओं में mitochondria की एक प्रतिनिधि फोकल छवि । (क) eGFP-व्यक्त MG63 कोशिकाओं (∇) दिखा ग्रीन चैनल. (ख) आरएफपी mitochondria (*) के लिए स्थानीयकृत दिखा लाल चैनल । (ग) हरे और लाल छवि विलय कर । Scalebar = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संस्कृति मीडिया रेसिपी
पूरा मीडिया (500mL) • 440 मिलीलीटर DMEM
• 50 मिलीलीटर FBS
• 5 मिलीलीटर 10x कलम/strep समाधान (10000U/
• 5 मिलि L-Glutamine (200 मि. ग्रा.)
A-मीडिया (250mL) • १७७.५८ मिलीलीटर बाँझ पानी
• 50 मिलीलीटर 10x M-199 मीडिया
• 15 मिलीलीटर 7.5% सोडियम बिकारबोनिट समाधान
• 2.25 एमएल का 50 एमएम hydrocortizone
• 125 मिलीलीटर 0.4 मिलीग्राम/एमएल retinol एसीटेट (बाँझ पानी में)
• 10x कलम के 5 मिलीलीटर/strep समाधान (10000U/
• 10mg/एमएल गोजातीय इंसुलिन के 50 मिलीलीटर
बी मीडिया (500ml) • ४२७.६ मिलीलीटर बाँझ पानी
• 50 मिलीलीटर 10x M-199 मीडिया
• 15 मिलीलीटर 7.5% सोडियम बिकारबोनिट समाधान
• 2.25 एमएल का 50 एमएम hydrocortizone
• 125 मिलीलीटर 0.4 मिलीग्राम/एमएल retinol एसीटेट (बाँझ पानी में)
• 10x कलम के 5 मिलीलीटर/strep समाधान (10000U/
• 10mg/एमएल गोजातीय इंसुलिन के 50 मिलीलीटर

तालिका 1. पूरा मीडिया, एक मीडिया, बी मीडिया के लिए व्यंजनों । सेल संस्कृति और प्यूमा परख के लिए मीडिया के लिए व्यंजनों सूचीबद्ध हैं ।

सेल कल्चर रिएजेंट विवरण सूचीपत्र सं । कंपनी
MNNG-HOS अत्यधिक मेटास्टेटिक OS सेल लाइन CRL-१५४७ ATCC
hos खराब मेटास्टेटिक OS सेल लाइन CRL-१५४३ ATCC
एमजी 63.3 अत्यधिक मेटास्टेटिक OS सेल लाइन N/A एमी LeBlanc प्रयोगशाला (NCI)
MG63 खराब मेटास्टेटिक OS सेल लाइन CRL-१४२७ ATCC
10x M199 मीडिया मीडिया और B-मीडिया के लिए आधार मीडिया ११८२५०१५ Thermofisher
आसुत जल (निष्फल) एक के घटक-मीडिया और 15230-147 Thermofisher
B-मीडिया
7.5% सोडियम बिकारबोनिट समाधान एक के घटक-मीडिया और २५०८००९४ Thermofisher
B-मीडिया
Hydrocortizone एक के घटक-मीडिया और H6909 सिग्मा-Alrich
B-मीडिया
Retinol एसीटेट-पाणी soluable A-मीडिया और B-मीडिया का घटक R0635-5दिन सिग्मा-Alrich
पेनिसिलिन/Streptomycin 10x केंद्रित (10000 U/एमएल) समाधान एक के घटक-मीडिया और १५१४०१२२ Thermofisher
B-मीडिया, पूर्ण मीडिया
गोजातीय इंसुलिन समाधान (10mg/ एक के घटक-मीडिया और I0516-5ML सिग्मा-Alrich
B-मीडिया
DMEM, उच्च ग्लूकोज पूरा मीडिया का आधार मीडिया ११९६५०९२ Thermofisher
L-Glutamine (200 मि. ग्रा.) पूर्ण मीडिया का घटक २५०३००८१ Thermofisher
भ्रूण गोजातीय सीरम पूर्ण मीडिया का घटक १६००००४४ Thermofisher
Dulbecco की फास्फेट का बफर खारा सेल संस्कृति में प्रयुक्त १४१९०१४४ Thermofisher
है हांक बफर लवण समाधान, कोई कैल्शियम, नहीं मैग्नीशियम, नहीं phenol लाल इंजेक्शन से पहले सेल गोली को फिर से किया गया सस्पेंड १४१७५०९५ Thermofisher
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol लाल सेल संस्कृति में प्रयुक्त २५२००११४ Thermofisher
DAR4M फेफड़ों पैरेन्काइमा लेबल करने के लिए प्रयुक्त ALX-620-069-M001 एंजो

तालिका 2. मीडिया, B-मीडिया, और पूर्ण मीडिया के लिए सेल कल्चर रिएजेंट । मीडिया व्यंजनों, रिएजेंट और बफ़र्स के लिए घटक कैटलॉग संख्या और कंपनी नाम के साथ सूचीबद्ध होते हैं ।

सामग्री विवरण सूचीपत्र सं । कंपनी
जीस 710 फोकल LSM ईमानदार LSM फोकल माइक्रोस्कोप N/A जीस
जीस 780 फोकल LSM उल्टे LSM फोकल माइक्रोस्कोप N/A जीस
SCID चूहों मंजूरी. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, महिला, आयु 6-8 सप्ताह N/A चार्ल्स नदी
GelFoam फेफड़े के ऊतकों वर्गों के लिए एक समर्थन के रूप में प्रयुक्त 59-9863 हार्वर्ड उपकरण
SeaPlaque Agarose फेफड़े के सांस के दौरान प्रयुक्त ५०१०० Lonza
1 एमएल सिरिंज के साथ 27 गेज सुई टेल नस इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया Fisherscientific
14-826-87
10 मिलीलीटर सिरिंज फेफड़ों के सांस के लिए इस्तेमाल किया ३०९६०४ bd
20 गेज कैथेटर फेफड़े के सांस के दौरान प्रयुक्त SR-OX2032CA Terumo
एबॉट आईवी एक्सटेंशन सेट (30 ", बाँझ) फेफड़े के सांस के दौरान प्रयुक्त ८३४२ Medisca
शराब झाड़ू इंजेक्शन से पहले पूंछ नस पोंछते के लिए ३२६८९५ bd
बाँझ सर्जिकल दस्ताने माउस फेफड़ों के Asceptic सौंपने आकार के साथ बदलता है Fisherscientific
30 cm शासक फेफड़ों के सांस के लिए इस्तेमाल किया प्रधानों
शासक के लिए समर्थन स्टैंड फेफड़ों के सांस के लिए इस्तेमाल किया HS29022A Pipette.com
35 मिमी ग्लास तली हुई संस्कृति पकवान फेफड़ों के स्लाइस के इमेजिंग के दौरान प्रयुक्त ८११५८ Ibidi
निविड़ अंधकार नमी बाधा के साथ शोषक पैड जैविक डाकू में बाँझ कार्य क्षेत्र लाइन के लिए इस्तेमाल किया 56617-014 vwr
Catgut सादा अवशोषित टांका इस्तेमाल के लिए बंद टाई cannulated श्वासनली N/A रचाई

तालिका 3. प्यूमा के लिए सामग्री । प्यूमा प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सामग्री सूची संख्या और कंपनी के नाम के साथ सूचीबद्ध हैं ।

सामग्री विवरण सूचीपत्र सं । कंपनी
सूक्ष्म विदारक कैंची 3.5 "सीधे तेज/ फेफड़ों के अनुभागों को काटने के लिए रुपये-५९१० Roboz
4 "(10 सेमी) लंबे दांतेदार सीधे अतिरिक्त नाजुक 0.5 mm टिप फेफड़ों के वर्गों के हेर-फेर के लिए रुपये-५१३२ Roboz
4 "(10 सेमी) लंबे दांतेदार मामूली वक्र 0.8 mm टिप फेफड़ों के वर्गों के हेर-फेर के लिए RS5135 Roboz
अंगूठे ड्रेसिंग संदंश; दांतेदार; नाजुक; 4.5 "लंबाई; 1.3 mm टिप चौड़ाई सामांय विच्छेदन के लिए रुपये-८१२० Roboz
अंगूठे संदंश 4.5 ड्रेसिंग "दांतेदार 2.2 mm टिप चौड़ाई सामांय विच्छेदन के लिए रू-8100 Roboz
अतिरिक्त ठीक सूक्ष्म विदारक कैंची 3.5 "सीधे तेज/तेज, 20 मिमी ब्लेड सामांय विच्छेदन के लिए रुपये-५८८० Roboz
Knapp कैंची; सीधे; तीखी-कुंद; 27mm ब्लेड की लंबाई; 4 "कुल लंबाई सामांय विच्छेदन के लिए रुपये-५९६० Roboz

तालिका 4. प्यूमा के लिए सर्जिकल उपकरण । प्रोटोकॉल में इस्तेमाल विभिंन स्टेनलेस स्टील उपकरणों सूची संख्या और कंपनी के नाम के साथ सूचीबद्ध हैं ।

पैरामीटर 488 लेजर 561 लेजर
उद्देश्य जीस w N-Achroplan 10x/0.3 w (उद्योग) M27
बिजली 2% 2%
पिक्सेल निवास १.६१ १.६१
औसत 0 0
ज़ूम 1 1
मास्टर लाभ 820 814
डिजिटल लाभ 1 ०.५१
डिजिटल ऑफ़सेट -4.5 -९.२४
pinhole 51 57
स्वरित्र फ़िल्टर 496-553 570-618

तालिका 5. DAR4M-लेबल प्यूमा वर्गों की फोकल इमेजिंग के लिए पैरामीटर । विशिष्ट छवि वर्तमान पत्र में फोकल छवियों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों तालिका में प्रदान की जाती हैं ।

पैरामीटर 488 लेजर 561 लेजर
उद्देश्य योजना-Apochromat 63x/1.40 तेल उद्योग M27
बिजली 2% 2%
पिक्सेल निवास 0.6 0.6
औसत 2 (रेखा) 2 (रेखा)
ज़ूम 2.3 2.3
मास्टर लाभ 449 390
डिजिटल लाभ 1 1.23
डिजिटल ऑफ़सेट 0 0
pinhole 136 136
स्वरित्र फ़िल्टर 493-550 566-703

तालिका 6. प्यूमा अनुभागों में mitochondria MG63 कोशिकाओं की फोकल इमेजिंग के लिए पैरामीटर. विशिष्ट छवि वर्तमान पत्र में फोकल छवियों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों तालिका में प्रदान की जाती हैं ।

पूरक चित्रा 1: गुरुत्वाकर्षण छिड़काव तंत्र. गुरुत्वाकर्षण छिड़काव तंत्र एक तरल agarose के साथ फेफड़ों insufflate करने के लिए प्रयोग किया जाता है/a-मीडिया समाधान के 20 सेमी पर एच20 हीड्रास्टाटिक दबाव । agarose/A-मीडिया समाधान 10 मिलीलीटर सिरिंज, जो एक चतुर्थ cannulated श्वासनली करने के लिए सेट विस्तार (नहीं दिखाया गया है) द्वारा संलग्न है में डाला जाता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: एक DAR4M-लेबल प्यूमा फेफड़े टुकड़ा में eGFP-व्यक्त ओएस कोशिकाओं की एक 3d फोकल जेड-ढेर छवि के रोटेशन । DAR4M (रेड चैनल) लंग पैरेन्काइमा को हाइलाइट करने के लिए प्रयोग किया जाता है और eGFP-एक्सप्रेस MG63 कोशिकाओं को भी (ग्रीन चैनल) देखा जा सकता है. Scalebar = 100 माइक्रोन । इस कदम को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Movie 2
मूवी 2: आरएफपी के एक 3d फोकल जेड-स्टैक छवि की रोटेशन-eGFP-एक्सप्रेस OS कोशिकाओं में प्यूमा मॉडल में लेबल किए गए mitochondria. mitochondria जैसे सेलुलर organelles को प्यूमा मॉडल में eGFP-एक्सप्रेस MG63 सेल (ग्रीन चैनल) में आरएफपी (रेड चैनल) के साथ लेबल दिखाया गया है । Scalebar = 10 माइक्रोन । इस कदम को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Movie 1
पूरक मूवी 1: एक मेटास्टेटिक OS सेल की 3 डी मूवी फेफड़ों में एक पोत में ज़ूम की गई. एक eGFP व्यक्त MG63 कोशिका पोत में फेफड़ों microenvironment के भीतर दिखाया गया है । Scalebar = 30 माइक्रोन । इस कदम को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Movie 2
पूरक फिल्म 2: mitochondria के एक मेटास्टेटिक ओएस सेल में ज़ूम 3 डी फिल्म फेफड़ों में. आरएफपी के साथ लेबल Mitochondria फेफड़ों microenvironment में MG63 कोशिकाओं में दिखाए जाते हैं । Scalebar = 5 माइक्रोन । इस कदम को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

निम्नलिखित तकनीकी लेख OS में फेफड़े के औपनिवेशीकरण का अध्ययन करने में प्यूमा मॉडल के कुछ व्यावहारिक पहलुओं का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम जहां शोधकर्ताओं अतिरिक्त ध्यान रखना चाहिए में निंनलिखित शामिल हैं:

क) Cannulation का श्वासनली । श्वासनली आसपास की मांसपेशी और संयोजी ऊतक विदारक है, जबकि आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । इसके अलावा, कैथेटर की सुई आसानी से श्वासनली के माध्यम से धकेल दिया जा सकता है । भुगतान करीब ध्यान कैसे सुई के बेवल में प्रवेश करती है जब प्रवेशनी डालने श्वासनली ।

ख) Puncturing या फेफड़ों की सतह को नुकसान पहुँचाए । फेफड़े आसानी से पंचर या उरोस्थि को हटाने और छाती गुहा को उजागर करने के दौरान कैंची विदारक के साथ क्षतिग्रस्त हो सकता है । छाती गुहा से बांधना बाहर विदारक जब सावधान रहना । Puncturing या फेफड़ों की सतह को नुकसान पहुंचाने तरल agarose/एक मीडिया के कारण होगा बाहर रिसाव और फेफड़ों फुलाया जाएगा ।

c) इमेजिंग करते समय फेफड़ों के अनुभागों से अतिरिक्त मीडिया निकालें. अतिरिक्त तरल मीडिया फेफड़ों अनुभाग आसपास के एक "दर्पण" प्रभाव जब माइक्रोस्कोप के तहत देखा पैदा कर सकता है । अतिरिक्त तरल ट्यूमर कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट रोशनी जिससे छवि में प्रतिदीप्ति क्षेत्र अतिशयोक्ति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । अतिरिक्त मीडिया द्रव को हटाने की छवि में इस विरूपण साक्ष्य को रोकने जाएगा । वैकल्पिक रूप से, छवि विरूपण साक्ष्य छवियों के बाद प्रसंस्करण के दौरान हटाया जा सकता है ।

घ) जीवित ऊतकों की धूप । जब एक पारा बल्ब या एक 1-फोटॉन माइक्रोस्कोप के पराबैंगनीकिरण का उपयोग कर, प्रकाश करने के लिए उजागर समय सीमा सुनिश्चित करें । प्रकाश स्रोत की तीव्रता/बिजली का प्रतिशत भी कम किया जा सकता है । प्रकाश स्रोत के लिए जोखिम फेफड़ों के ऊतकों को धूप पैदा कर सकता है । प्रकाश उत्सर्जक डायोड के साथ सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी (एलईडी) या 2-फोटॉन/बहु-फोटॉन सूक्ष्मदर्शी आदर्श होगा क्योंकि वे अनुदैर्ध्य इमेजिंग अध्ययन के दौरान कम धूप का उत्पादन ।

प्यूमा मॉडल अनुकूलित और फेफड़ों औपनिवेशीकरण प्रक्रिया के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस पूर्व vivo दृष्टिकोण का एक अंय संस्करण वान मांद Bijgaart और 21सहयोगियों द्वारा वर्णित है । जीन दस्तक के प्रभाव की जांच के लिए नीचे या फेफड़ों में ट्यूमर कोशिका वृद्धि पर विरोधी मेटास्टेटिक दवा गतिविधि, वापस स्केलिंग कोशिकाओं की संख्या 5 x 105 से इंजेक्शन के लिए 3 x 105 के बाद से सलाह दी जाती है हस्तक्षेप के प्रभाव नकाबपोश किया जा सकता है एक बड़ा सेल innoculum की घातीय वृद्धि के दौरान । कई अध्ययनों से फेफड़े मेटास्टेटिक प्रगति 4,5,8,22,23,24के ड्राइवरों का अध्ययन करने के लिए प्यूमा मॉडल का इस्तेमाल किया है । विभिंन फ्लोरोसेंट संकेतक रंजक या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को ट्यूमर कोशिकाओं लेबल के लिए कोशिका शरीर विज्ञान या जीन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 8 फेफड़ों microenvironment में अभिव्यक्ति ।

प्यूमा मॉडल की एक सीमा के संगत कक्ष लाइनों की एक सीमित संख्या में शामिल हैं । स्थापित सेल इस परख के साथ संगत लाइनों मेंडोज़ा और सहयोगियों द्वारा सूचीबद्ध है 3 । उच्च और निंन मेटास्टेटिक ऑस्टियो सेल लाइनों के लिए, क्लोनिंग से संबंधित सेल लाइनों का पालन जोड़े को विकसित और प्यूमा मॉडल में अपनी मेटास्टेटिक प्रवृत्ति बनाए रखने के पाया गया है: मानव एमजी 63.3 और MG63 कोशिकाओं, MNNG और 143B, और HOS कोशिकाओं, murine K7M2 और K12 कोशिकाओं. शोधकर्ताओं empirically निर्धारित करना होगा या नहीं, उनके सेल लाइनों बी मीडिया में व्यवहार्य रह सकते हैं । एक और सीमा पर विचार करने के लिए समय की सीमित लंबाई फेफड़ों के ऊतकों को इन विट्रो मेंबनाए रखा जा सकता है । फेफड़ों के ऊतकों को 30 दिनों के लिए अपने सेलुलर घटकों को बनाए रखने कर सकते हैं, उस समय और फेफड़ों के सेलुलर घटकों से मरने के लिए शुरू करते हैं । इसलिए ट्यूमर कोशिकाओं और फेफड़ों stromal कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन 30 दिनों से अधिक नहीं होना चाहिए ।

प्यूमा मॉडल कैसे मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं उपनिवेश फेफड़ों के ऊतकों का अध्ययन करने के लिए एक अभूतपूर्व विधि प्रदान करता है । प्यूमा मॉडल के सबसे हड़ताली पहलू तथ्य यह है कि कई कम मेटास्टेटिक ओएस सेल लाइनों (HOS, MG63, K12), जिसका vivo phenotypes में कहीं विशेषता है 25, प्यूमा मॉडल में वृद्धि नहीं कर सकते से आता है । इसके विपरीत, क्लोनल संबंधित अत्यधिक मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं (MNNG, एमजी 63.3, K7M2) vivo25 में और प्यूमा मॉडल में फेफड़ों के ऊतकों उपनिवेश करने के लिए एक अधिक से अधिक प्रवृत्ति है. इससे पता चलता है कि कम मेटास्टेटिक ओएस सेल लाइनों को वीवो मेंउगाने से रोकने वाले लंग microenvironment के सेलुलर और extracellular अवयव अभी भी रक्त प्रवाह की कमी के बावजूद प्यूमा मॉडल में बनाए रखे जाते हैं । दूसरे शब्दों में, प्यूमा मॉडल के फेफड़े microenvironment अभी भी एक "चयन दबाव" है कि फेफड़ों में बढ़ने से कम मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं को रोकता है डालती है । दरअसल, उच्च मेटास्टेटिक OS कोशिकाओं का अध्ययन प्यूमा में विकसित मेटास्टेटिक phenotype 4के नए आणविक ड्राइवरों की पहचान करने में उपयोगी हो गया है,5. इसके अलावा, आनुवंशिक नीचे का मॉडुलन अत्यधिक मेटास्टेटिक कोशिकाओं में कहा लक्ष्य दोनों प्यूमा मॉडल में और vivo में मेटास्टेटिक क्षमता कम करने के लिए दिखाया गया था 5. उम्मीदवार विरोधी मेटास्टेटिक दवा अध्ययन के लिए, प्यूमा मॉडल जो एकाग्रता सीमा फेफड़ों के ऊतकों में मेटास्टेटिक वृद्धि को कम कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, जो बारी में, फिर vivo मेंमान्य किया जा सकता है.

इस मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंजक और रिपोर्टर जीन की बहुतायत का दोहन करने के लिए ओएस मेटास्टेसिस प्रगति के बुनियादी जीवविज्ञान में गहरी तल्लीन करना चाहिए । उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रंजक जैसे 2 ', 7 '-dichlorofluorescin diacetate या dihydroethidium को प्यूमा मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं के redox राज्य का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता organelle जीव विज्ञान या प्रमोटर गतिविधि का आकलन करने के लिए निर्धारित जो संकेत रास्ते अत्यधिक मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं में औपनिवेशीकरण प्रक्रिया के दौरान सक्रिय कर रहे हैं । इस तरह के दृष्टिकोण एक दवा उपचार फेफड़ों में बढ़ रही ट्यूमर कोशिकाओं में गतिविधि है कि क्या कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट सूक्ष्म प्लेटफार्मों कि ऊतकों को कम धूप उत्पादन, जैसे एलईडी से सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी या 2-फोटॉन/multiphoton फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में, इस्तेमाल किया जा सकता है अध्ययन कैसे मेटास्टेटिक ओएस कोशिकाओं के प्रवास और फेफड़ों के ऊतकों भर में आक्रमण । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं और फेफड़ों stromal कोशिकाओं के बीच आसंजन बातचीत फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन के साथ नजर रखी जा सकती है ।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, वर्तमान कागज प्यूमा मॉडल के व्यावहारिक पहलुओं पर चर्चा, पहले मेंडोज़ा और सहयोगियों द्वारा विकसित 3. कम आवर्धन, widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी उच्च और कम मेटास्टेटिक मानव ओएस कोशिकाओं के विकास का आकलन करने के लिए का उपयोग कर का एक उदाहरण दिखाया गया है । प्रोटोकॉल के कई अहम कदम बताए गए हैं । इसके अलावा प्यूमा मॉडल के फायदों और सीमाओं की चर्चा की गई है । प्यूमा मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए फेफड़ों औपनिवेशीकरण प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आगे डाल दिया गया है, और यह आशा व्यक्त की है कि इस मॉडल ऑस्टियो अनुसंधान समुदाय में एक व्यापक उपयोग होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ॰ Arnulfo मेंडोज़ा को धन्यवाद देना चाहेंगे जिन्होंने प्यूमा तकनीक में प्रशिक्षण प्रदान किया । इसके अतिरिक्त, हम डीआरएस को स्वीकार करना चाहेंगे । चांद खन्ना, Susan गारफील्ड (NCI/NIH), और सैम अपारिसियो (बीसी कैंसर एजेंसी) इस अध्ययन के दौरान उनके सूक्ष्मदर्शी का उपयोग प्रदान करने के लिए । इस शोध का समर्थन किया गया (भाग में) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, कैंसर अनुसंधान, बाल चिकित्सा कैंसर विज्ञान शाखा के लिए केंद्र के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा । M.M.L. स्वास्थ्य अंदर के राष्ट्रीय संस्थानों के साथी कार्यक्रम का दौरा (पुरस्कार १५३३५) द्वारा समर्थित था, और वर्तमान में मेटास्टेसिस अनुसंधान में एक Joan पार्कर फैलोशिप द्वारा समर्थित है । P.H.S. ब्रिटिश कोलंबिया कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS ATCC CRL-1547 highly metastatic OS cell line
HOS ATCC CRL-1543 poorly metastatic OS cell line
MG63.3 Amy LeBlanc Laboratory (NCI) N/A highly metastatic OS cell line
MG63 ATCC CRL-1427 poorly metastatic OS cell line
10X M199 media Thermofisher 11825015 Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized) Thermofisher 15230-147 Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution Thermofisher 25080094 Component of A-media & B-media
Hydrocortizone Sigma-Alrich H6909 Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable Sigma-Alrich R0635-5MG Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution Thermofisher 15140122 Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml) Sigma-Alrich I0516-5ML Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose Thermofisher 11965092 Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM) Thermofisher 25030081 Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum Thermofisher 16000044 Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Thermofisher 14190144 Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermofisher 14175095 Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermofisher 25200114 Used in cell culture.
DAR4M Enzo ALX-620-069-M001 Used to label lung parenchyma.
Name Company Catalog Number Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM Zeiss N/A Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM Zeiss N/A Inverted LSM confocal microscope
SCID mice Charles River N/A NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam Harvard Apparatus 59-9863 Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose Lonza 50100 Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle Fisherscientific 14-826-87 Used for tail vein injection.
10 ml syringe BD 309604 Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter Terumo SR-OX2032CA Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile) Medisca 8342 Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs BD 326895 For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves Fisherscientific Varies with size Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler Staples Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler Pipette.com HS29022A Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish Ibidi 81158 Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier VWR 56617-014 Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture Braun N/A Used to tie off cannulated trachea.
Name Company Catalog Number Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp Roboz RS-5910 For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip Roboz RS-5132 For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip Roboz RS5135 For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width Roboz RS-8120 For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz RS-8100 For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade Roboz RS-5880 For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length Roboz RS-5960 For general dissection.

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 133 ऑस्टियो सार्कोमा मेटास्टेसिस फेफड़े माइक्रोस्कोपी
ऑस्टियो में फेफड़े के मेटास्टेसिस परख का उपयोग मेटास्टेटिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण अध्ययन में व्यावहारिक विचार
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Lizardo, M. M., Sorensen, P. H.… More

Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. J. Vis. Exp. (133), e56332, doi:10.3791/56332 (2018).

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