ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法
Summary
アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) 表面の局所密度のナノスケール制御を許可、デンドリマーを用いた不均一な nanopatterns を取得するメソッドの記述方法や細胞接着と軟骨分化の研究に適用されます。
Abstract
細胞接着・分化は、大きな影響を持つローカルの濃度と細胞外マトリックス (ECM) コンポーネントのナノスケール処分によって調節されます。アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) の大規模な不均一な nanopatterns を取得する方法の紹介-ローカル RGD のナノスケール制御を許可するデンドリマー表面密度。Nanopatterns、初期濃度の異なる溶液からデンドリマーの表面吸着によって形成される水接触角 (CA)、x 線光電子分光 (XPS)、によって特徴付けられるし、走査プローブ顕微鏡技術など走査型トンネル顕微鏡 (STM)、原子間力顕微鏡 (AFM)。粒子間距離を最小の確率等高線図を用いた原子間力顕微鏡画像を用いた、細胞接着性応答と分化相関、RGD のローカル表面密度を測定します。ここで紹介したナノパターニング方法は大きな表面積を単純な方法でスケール アップすることができます簡単な手順です。それは細胞培養のプロトコルに完全に準拠ではこうして、細胞濃度依存性効果を発揮する他の配位子に適用することができます。
Introduction
ここで我々 はナノスケールで地元密着の制御を許可する細胞培養表面を取得するシンプルで汎用のデンドリマーを用いたナノパターニング手順をについて説明します。1,2,3と細胞接着のナノパターニング接着4に関連する細胞の要件への深い洞察を提供している ECM 組織のナノスケール詳細が報告されています。 5。ミセル リソグラフィ ベース nanopatterns を用いた実験は約 70 のしきい値を明らかに RGD ペプチド nanospacing、この値6,7,8 上が大幅に遅れている細胞接着の nm、9。これらの研究はまた、細胞接着9,10,11グローバル リガンド密度よりも地元の大きな影響を強調しました。
形態形成、時に、細胞周囲の環境との相互作用は、最初の分化のイベントは、最終的な複雑な組織構造が形成されている続行をトリガーします。この枠組みの中でナノパターン表面は形態形成に関する初期の細胞表面の相互作用の影響に取り組むために使用されています。68 の横方向の間隔とリソグラフィ ベース RGD nanopatterns β 型 Ti 40Nb nm 合金 95 150 nm 間の RGD nanospacings 強化の分化中12非コミット幹細胞の未分化の表現型を維持するためにヘルプ間葉系幹細胞の脂肪細胞/骨13,14,15と軟骨の運命16(MSCs)。また、ナノスケール信号合図17の建築規制を提供することによって細胞の接着および分化を指示する信号コンポーネントで変更された自己組織化高分子を示されています。この点で、外側の球18,19,代20の表面に細胞と相互作用する部分を備えたデンドリマーの沈着は細胞接着21,22, の研究に使用されています形態23,24、および移行イベント25,26。それにもかかわらず、これらの研究における表面キャラクタリゼーションの欠如の場合、デンドリマー表面形状と細胞応答間の相関関係を確立することは困難になります。
デンドリマーは、低イオン強度のソリューションから低料金面に吸着するとき、液体のような順序と定義された間隔デンドリマー nanopatterns を取得できます。27このプロパティに基づいてご紹介ローカル RGD 表面密度のナノスケール制御を許可する低料金の表面上の RGD 修飾デンドリマーの大規模な不均一な nanopatterns を取得するメソッド。水接触角 (CA)、x 線光電子分光法 (XPS) と走査型プローブ顕微鏡 (STM および原子間力顕微鏡 nanopatterns) の技術ショー ソリューションの初期デンドリマー濃度の変更をローカルのリガンド密度を調整できます。ローカル RGD 表面密度は粒子間距離を最小の確率コンター マップによる AFM 像から定量化し、細胞実験との相関します。他のナノパターニング技術4と比べると、デンドリマーを用いたナノパターニングは簡単で、大きな表面積、したがって細胞文化アプリケーションと完全に互換性がするスケール アップ。Nanopatterns は、大人の人間の MSCs の29の軟骨誘導細胞接着28ローカル RGD 表面密度の影響を評価する生理活性基板として使用されます。RGD デンドリマーを用いた nanopatterns が細胞の成長を維持し、高いローカル RGD 表面密度によって細胞の接着を補強するが分かった。分化実験では、基板に細胞の中間の接着性は、MSC 凝縮と初期軟骨分化を支持しました。使いやすさ、デンドリマーと周辺グループを変更できます、ためここで説明した方法は、他の ECM リガンド濃度依存性細胞に効果を発揮できるさらに拡張できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
記述されていたプロトコルの開発、中にいくつかの重要な手順を検討してください。最初は、走査プローブ顕微鏡技術によるナノパターン特性を指します。28awd-4 を視覚化するパターンが生成される表面は、周辺にあるデンドリマーの直径以下の粗さの値を持つ必要があります 4-5 nm STM (図 1 b) によって測定されます。また、それは高分解能 STM イメージングの導電性基板、この場…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、 d分定量化にオリオール フォント-バッハ、アルバート G. Castaño を認めます。彼らはまた生物医学著者が社内で映像を記録させる (IRB バルセロナ) で研究所の高度なデジタル顕微鏡ユニットを認めます。この作業によって、ネットワーク医学研究センター CIBER ()、スペインに対応しました。CIBER はイニシアチブによって資金を供給 VI 国家 R & D & 私プラン 2008年-2011 Iniciativa Ingenio 2010 Consolider プログラム、CIBER アクション、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III、欧州地域開発基金の支援です。この仕事は、大学や研究部門の革新、大学、ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャの企業のための委員会によってサポートされている (2014 SGR 1442)。それはまたプロジェクト OLIGOCODES (号によって資金を供給されました。MAT2012-38573-C02) と CTQ2013-41339-P、INTERREG V-A スペイン ポルトガル 2014 年 2020 年 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) にスペイン経済省、競争力、さらに授与します。C.R.P. は、スペイン経済省と競争力のグラント号からの財政支援を認めています。IFI15/00151)。
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
