Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد المتكفل إينتيرنيورون القشرية والسلائف الانقسامية بعد إينتيرنيورون من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس استخدام أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد معدلة. سلائف موروث يمكن أن تستخدم في المختبر أو فلوريسسينتلي فرز وزرعها في اللحاء الوليد الجديد لدراسة تحديد مصير، أو المستخدمة في التطبيقات العلاجية.

Abstract

إينتيرنيورونس القشرية جابايرجيك هي عدد سكان غير متجانسة من الخلايا التي تلعب أدواراً حاسمة في تنظيم إنتاج الخلايا العصبية الهرمية ضادات، فضلا عن تزامن نواتج الفرق العصبية الهرمية. العجز في الدالة إينتيرنيورون قد تورطت في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، بما في ذلك مرض الفصام والتوحد، والصرع. اشتقاق إينتيرنيورونس القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية لا يسمح للدراسة لتنميتها ووظيفة فحسب، بل يوفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآلية المرضية للاضطرابات المتصلة إينتيرنيورون القشرية. وقد إينتيرنيورونس أيضا قدرة رائعة على البقاء على قيد الحياة والهجرة والاندماج في المضيف الدوائر القشرية بعد انتهاء الزرع، جعلها مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاجات المستندة إلى الخلية. نقدم هنا، قابلة للتحجيم، ذات كفاءة عالية، وتعديل أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). استخدام خط ©جميع مراسل مزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP، Nkx2.1 موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 يمكن معزولة عن طريق تنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. كما نقوم بتوفير أساليب لإثراء بارفالبومين (PV) أو سوماتوستاتين (SST) إينتيرنيورون الفرعية، التي قد تكون مفيدة لدراسة الجوانب لتحديد مصير أو للاستخدام في التطبيقات العلاجية التي ستستفيد من إينتيرنيورون إثراء الفريق الفرعي عمليات الزرع.

Introduction

في كل من الفئران والبشر، تقريبا نصف عدد جميع القشرية إينتيرنيورونس المثبطة (قطرية) تنشأ داخل بنية subcortical عابر المعروف نيافة ganglionic الآنسي (MGE)، حيث المتكفل نيوروبيثيليال من قطرية وغيرها من الخلايا العصبية الدبقية مجموعات فرعية تعبر عن عامل النسخ Nkx2.11،2. يتم تعريف مجموعات فرعية CIn أو الأنواع الفرعية المتقاطعة المورفولوجية، الكيميائية العصبية، والكهربية، وربط الخصائص3،4. قطرية المستمدة من MGE يمكن تجميعها في فئات فرعية معظمها غير متداخلة استناداً إلى التعبير عنها أما PV أو درجة حرارة سطح البحر، التعبير عن الذي يرتبط مع النزعات الكهربية واتصال خاص5. خلل إينتيرنيورونس، لا سيما تلك الموجودة في الفريق الفرعي الكهروضوئية، كان متورطا في عدة العصبية اضطرابات وأمراض6،7. والهدف العام لهذا الأسلوب إنتاج المستمدة من الخلايا الجذعية المتكفل الانقسامية والسلائف المهاجرة إثراء لمصير الكهروضوئية أو SST CIn لدراسة البيولوجيا إينتيرنيورون القشرية ولاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلية.

قمنا بتطوير أسلوب للتحجيم، ذات كفاءة عالية للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من ميسكس. استخدام Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP مراسل المزدوج مسك خط8، Nkx2.1 موروث أو يمكن معزولة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. عن طريق التلاعب في عدد من مسارات الإشارات، والمدة للثقافة، ووضع للخلايا، يمكننا الحصول على ملايين سلائف إينتيرنيورون المسمى فلوريسسينتلي مناسبة لمجموعة كبيرة من التطبيقات المتلقين للمعلومات.

وبالرغم من وجود عدة طرق أخرى لتوليد مثل MGE موروث من ميسكس9،10،11،12،،من1314، لدينا أسلوب، والذي يعتمد على Wnt خصم XAV-939، كفاءة خاصة في توليد Foxg1/Nkx2.1 المشترك معربا عن موروث تيلينسيفاليك. وباﻹضافة إلى ذلك، القدرة على تحديد إينتيرنيورون موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 عن طريق نظامنا مراسل المزدوج، يعزز بشكل كبير قدرة على توليد فروعه المتميزة وذرياتهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: السطر ©جميع مراسل المزدوج الموصوفة في هذا البروتوكول متاح عند الطلب (sande@mail.med.upenn.edu).

1-إعداد وسائط الإعلام

ملاحظة: الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها في خلية ثقافة.

  1. وسائط تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 50 مل مصل البقر الجنين (FBS) لمل 449 دولبيكو للمتوسطة (دميم تعديل النسر)، وعامل التصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو قاسمة ومخزن في ≤-20 درجة مئوية.
  2. وسائط N2 (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 5 مل L-ألانين-L-الجلوتامين (100 x) و 500 ميليلتر 2-Mercaptoethanol (55 مم) لمل 489.5 دميم: "مزيج المغذيات" F-12 (دميم/و-12)، وعامل التصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) و 5 مل N2 الملحق باء بعد الترشيح. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. المتوسطة النمو خالية من المصل (قصر) (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 75 مل خالية من المصل المتوسط الملحق، مل 5 لتر-الجلوتامين (100 x)، 5 مل MEM "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم (MEM-نيا) (100 x)، و 500 ميليلتر 2-Mercaptoethanol (55 مم) إلى غير مل 413.5 الجلوتامين التي تحتوي على دميم، وتصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  4. وسائط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 75 مل الخلايا الجذعية الصف FBS، 5 مل MEM-نيا (100 x)، 5 مل لام الجلوتامين (100 x)، و 500 ميليلتر 2-Mercaptoethanol (55 مم) إلى غير مل 413.5 الجلوتامين التي تحتوي على دميم، وتصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد أو قاسمة ومخزن في ≤-20 درجة مئوية.

2-استزراع ميسكس

  1. لوحة ميتوتيكالي الخاملة MEF تغذية الخلايا في وسائل الإعلام MEF على لوحات زراعة الأنسجة المعالجة 3-4 × 104 خلايا/سم2. السماح على الأقل 12 ح لهم لتسوية في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية و 5% CO2 قبل الطلاء في ميسكس. إذا لم تستخدم فورا، استبدال الوسائط MEF كل 3 أيام. التخلص من ميفس إذا لم تستخدم في غضون 7 أيام طلاء.
  2. إضافة ميسكس (كثافة تتراوح بين 1-4 × 104 خلايا/سم2) إلى لوحات MEF في مسك الوسائط التي تحتوي على "الماوس اللوكيميا العوامل المثبطة" (مليف) (1,000 U/mL). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية و 5% CO2.
  3. ممر ميسكس التربسين-يدتا (0.05% التربسين) باستخدام (1:5-1:10) عندما يصبح الطبق ~ روافد 70-80%، أو إذا بدأت المستعمرات للمس. وهذا عادة يحدث كل يومين، ولكن يمكن أن إلى 4 أو 5 أيام اعتماداً على كثافة الطلاء الأولى.
  4. الحفاظ على ميسكس على طبقة وحدة تغذية MEF في مسك المتوسطة للحفاظ على بلوريبوتينسي.
  5. قبل البدء في المفاضلة، مرور الخلايا مرة واحدة على الأقل على لوحات الجيلاتين مغلفة دون ميفس تمييع بها ميفس.
    1. إعداد لوحات الجيلاتين المغلفة بإضافة 0.1% الجيلاتين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع Ca2 +/Mg2 + إلى طبق استنبات الأنسجة تعامل وترك في 37 درجة مئوية على الأقل 1 حاء لوحة 1.5-2 × 106 خلايا/10 سم لوحة (2.7-3.6 × 104 خلايا/سم2) والسماح بتوسيع لمدة يومين قبل بداية تمايز الخلايا.

3-التفريق بين ميسكس تجاه "موروث تيلينسيفاليك" مثل MGE

  1. يوم التمايز (دد) 0 = "تعويم الخلايا"
    1. بعد أن نمت ميسكس لوحات الجيلاتين المغلفة لمدة يومين، نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني دون Ca2 +/Mg2 +. إضافة ما يكفي يدتا التربسين (0.05% التربسين) لتغطية سطح اللوحة (عادة 4 مل التربسين-يدتا لطبق استنبات الأنسجة 10 سم واحد)، ووضع الخلايا مرة أخرى في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع إيه ناين فايف % رطوبة نسبية و 5% CO2 لدقيقة 4.
    2. وبعد 4 دقائق، إخماد التربسين-يدتا باستخدام 2 إضعاف حجم مع وسائط الإعلام ©جميع. نقل الخلايا إلى أنبوب حجم مناسب للطرد مركزي والطرد المركزي الخلايا في ز 200 x لمدة 5 دقائق. وبعد 5 دقائق، إزالة الأنبوب ونضح وسائل الإعلام دون إزعاج بيليه. ريسوسبيند بيليه في 1 مل KSR:N2 وسائل الإعلام (1:1) التي تحتوي على مثبطات BMP LDN-193189 (250 نيوتن متر) ومثبطات Wnt XAV-939 (10 ميكرون).
    3. قياس تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية. بدء زراعة الخلايا كهيئات امبريويد (EBs) عن طريق إضافة خلايا/مل 75,000 في KSR:N2 وسائل الإعلام (1:1) التي تحتوي على LDN-193189 (250 nM) و XAV-939 (10 ميكرون) في أطباق زراعة الأنسجة غير ملتصقة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية و 5% CO2.
  2. في DD1، التحضير للخلية "الهبوط" بطلاء أطباق زراعة الأنسجة تعامل مع بولي-L-يسين (10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني مع Ca2 +/Mg2 +) بين عشية وضحاها (O/N) عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية أو على الأقل 1 ح.
  3. في DD2، نضح بولي-L-يسين ومعطف اللوحات مع laminin (10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني مع Ca2 +/Mg2 +) س/ن في 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية.
    ملاحظة: بينما O/N الأمثل، وأقل من 2 ح قد تكون كافية. إذا لم يتم استخدام لوحات في اليوم التالي، نضح laminin واستبدال مع برنامج تلفزيوني دون Ca2 +/Mg2 +وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  4. Dd3 سعة ("الأراضي خلايا")
    1. قبل بداية تفكك المجلس التنفيذي، نضح في laminin والسماح باللوحات ليجف تماما في غطاء زراعة الأنسجة. لا تستخدم اللوحات التي تظهر لامعة أو الرطب واضح. نقل الحديدية مع وسائط الإعلام إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 3-4 دقيقة في 15 × ز أو حتى يكون القريبون الحديدية.
  5. نضح وسائط الإعلام وأضف 3 مل من محلول مفرزة الخلية التي تحتوي على الدناز (يو 2/mL)، واحتضان في 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 95% ≥ ونفض الغبار أنبوب كل 3 دقائق المعونة في الانفصال من المجلس التنفيذي بلطف من 5% CO2 ل 15 دقيقة.
  6. بمجرد الحديدية لم تعد مرئية أو انقضت مدة 15 دقيقة، إضافة 6 مل KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على الدناز (1 يو/mL) وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ز.
  7. لوحة الخلايا في KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على LDN-193189 (250 نيوتن متر)، XAV-939 (10 ميكرون)، ومثبط روك Y-27632 (10 ميكرون) 4.5-5 × 104 خلايا/سم2.

4-إثراء SST "البروتوكول": "DD12 بروتينات فلورية خضراء عالية سونيك القنفذ (SHH)" (استمرارا من الخطوة 3، 7)

  1. في DD5، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل)، و SSH (50 نانوغرام/مل).
  2. إعداد لوحات زراعة الأنسجة لإعادة الطلاء في يوم 8 (الخطوة 4، 4) باستخدام الإرشادات الموضحة في الخطوات 3.2-3.3.
  3. في DD7، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل)، و SHH (50 نانوغرام/مل).
  4. في DD8، إعادة لوحة الخلايا.
    ملاحظة: في حين أن هذه الخطوة غير ضرورية، إعادة طلاء الخلايا يمكن أن تقلل أنواع الخلايا المبكر متباينة، وغير المرغوب فيها. إعادة طلاء أيضا يكسر كرات خلايا التي تجعل من الصعب تحليلات المناعي المصب، ويزيد من كفاءة نظام مراقبة الأصول الميدانية في نقاط زمنية لاحقة.
    1. إعادة لوحة الخلايا، وفصل الخلايا من اللوحة مع التربسين-يدتا (0.05% التربسين) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية مع إيه ناين فايف % رطوبة نسبية و 5% CO2. آرو التربسين-يدتا باستخدام 2 إضعاف حجم مع KSR:N2، وأجهزة الطرد المركزي في ز 200 x 5 كحد أدنى لتصفية الخلايا عن طريق أنبوب تصفية 40 ميكرون لإزالة أي كتل. إعادة لوحة الخلايا 250,000 الخلايا/سم2 في N2/قصر (1:1) تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل)، و Y-27632 (10 ميكرون) مع SHH (50 نانوغرام/مل).
      ملاحظة: إذا كان بدلاً من ذلك، هو اتخاذ القرار لا بإعادة لوحة خلايا DD8، تغيير الوسائط مع KSR:N2 التي تحتوي على SHH (50 نانوغرام/مليلتر) كل يومين من DD7 إلى DD12 والاستمرار في إضافة منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل) وصندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل) حتى DD9.
  5. في DD10، تغيير الوسائط مع KSR:N2 التي تحتوي على SHH (50 نانوغرام/مل).
  6. في DD12، للحصول على الخلايا التي يتم إثراء للأنواع الفرعية التليسكوب، استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل Lhx6::GFP-فقط الإعراب عن الخلايا.
    1. لفصل الخلايا، استخدم كاشف الانفصال من الخلية التي تحتوي على غير التربسين بدلاً من يدتا التربسين. يغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني دون Ca2 +/Mg2 +. إضافة المعالجون مسبقاً غير التربسين التي تحتوي على الانفصال من الخلية كاشف المحتوية على الدناز (يو 2/mL) للخلايا. مكان لهم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع إيه ناين فايف % رطوبة نسبية و 5% CO2 على 10-30 دقيقة أو حتى قد فصل الخلايا. اضغط بلطف لوحات كل 5 دقائق للمساعدة الانفصال.
      ملاحظة: للثقافات DD11-12، قد يكون فقط 10-15 دقيقة ضرورية. للثقافات DD15-16، 30 دقيقة أو أكثر قد تكون مطلوبة من أجل الانفصال الكامل.
    2. مرة واحدة قد انطلق الخلايا تماما في اللوحة، تمضي إلى عزل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام البروتوكولات القياسية أو استخدام الخلايا في تحليلات أخرى للمتلقين للمعلومات.

5-إثراء PV "البروتوكول": "مشري DD11/DD17 + أبكسي" (استمرارا من الخطوة 3، 7)

  1. في DD5، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر).
  2. إعداد لوحات زراعة الأنسجة لإعادة طلاء على DD8 (الخطوة 4، 4) باستخدام الإرشادات المذكورة في الخطوات 3.2-3.3.
  3. في DD7، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر).
  4. في DD8، إعادة لوحة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4، 4 مع الاستثناءات التالية: عند إعادة طلاء الخلايا، استبدال SHH بطرية مؤثر (تبلد؛ 30 نانومتر) وإضافة مثبطات PKC شاذة (أبكسي؛ 2 ميكرومتر). مجتمعة، وسائل الإعلام إعادة الطلاء هو الآن N2/قصر (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر)، Y-27632 (10 ميكرومتر)، تبلد (30 نانومتر)، وأبكسي (2 ميكرومتر).
  5. في DD10، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر).
  6. DD11
    ملاحظة: عند هذه النقطة، أثري Nkx2.1::mCherry+ الخلايا لتصبح قطرية الكهروضوئية.
    1. فصل الخلايا من اللوحة لنظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام نفس البروتوكول المذكورة في الخطوة 4، 6. إذا اتخذ القرار بجمع الخلايا Nkx2.1::mCherry+ في يوم لاحق من تمايز، تجاهل هذه الخطوة.
  7. في DD12، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر). في DD14، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر). في DD16، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر). في DD17، جمع الخلايا Nkx2.1::mCherry+ باستخدام نفس البروتوكول المذكورة في الخطوة 4، 6.

6-إثراء PV "البروتوكول": "مشري DD17 منخفض SHH" (استمرارا من الخطوة 3، 7)

  1. في DD5، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر). في DD7، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر).
  2. في DD9، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 (1:1). من هذه النقطة فصاعدا، لا عوامل نمو إضافية ضرورية.
    1. الاستمرار في تغيير وسائل الإعلام كل يومين حتى حصاد الخلايا على DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة هي نسخة معدلة من أعمالنا البروتوكولات المنشورة15،،من1617 وقد الأمثل للاستخدام مع خطنا مسك المزدوج-مراسل Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. عن طريق إضافة مثبطات Wnt XAV 939 من DD0-5، جنبا إلى جنب مع إعادة الطلاء في DD8، يمكننا أن نحقق قوية Nkx2.1 التعريفي، وفيها ما يزيد عن 50% من جميع DAPI + نوى في الثقافة أيضا Nkx2.1 يعبرون عن (الشكل 1 أ، ب). ويبين Immunohistochemistry مشري والصحفيين بروتينات فلورية خضراء تعبيراً واضحا داخل مناطق إيجابية Nkx2.1 إيمونوريكتيفيتي (الشكل 1A). نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا الحية باستخدام المراسل الأصلي يظهر أن السكان أربعة خلايا يمكن أن تكون معزولة وضوح: (1) التجارة والنقل/متشيري خلايا النفي المزدوج، (2) متشيري فقط الإعراب عن الخلايا والخلايا (3) التجارة والنقل فقط وإذ تعرب عن الخلايا معربا عن الكيل (4) التجارة والنقل/متشيري ( الشكل 1). استخدام هذا الخط، يبدأ جزء صغير من المتكفل بدوره على مراسل مشري حول DD8-9. مستويات مشري ذروته بين DD12-13 وثم انخفاض مطرد المتكفل إنهاء دورة الخلية، وإنتاج ما بعد الانقسامية Lhx6::GFP + إينتيرنيورون السلائف (الشكل 1). وفي المقابل، يتحول المراسل Lhx6::GFP بين DD9-10 وقمم حول DD13-14 (الشكل 1). على الرغم من أن العدد الكلي للخلايا Lhx6::GFP تواصل زيادة في الثقافة، النسبة المئوية لا، ربما بسبب انتشار السلالات الأخرى. مرة Lhx6::GFP + وتعرب عن مراسل، تظل قابلة للاكتشاف إلى أجل غير مسمى منذ ستابلي يتم التعبير عن Lhx6 في18،إينتيرنيورونس القشرية ناضجة المستمدة من MGE19. على الرغم من أن التعبير Nkx2.1 و Lhx6 إلى حد كبير غير متداخلة داخل forebrain مورين، هناك عدد سكان عابر Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP المشترك معربا عن الخلايا في الثقافة. هذا على الأقل جزئيا بسبب بيردورانسي للمراسل مشري خارج الإطار الزمني العادي للتعبير Nkx2.1، كما أن معظم الخلايا المسماة مزدوجة لا تعبر عن مستويات ملحوظة من البروتين Nkx2.1 (تايسون وأندرسون، غير منشورة). قد تكون الخلايا المستمر للتعبير عن كل من مراسل Lhx6 والبروتين الكرز/Nkx2.1 سترياتال إينتيرنيورونس20. ومع ذلك، استناداً إلى دراساتنا التصوير الحي، هناك نافذة لحوالي 18 ح فيه السلائف متزامن، وحديثا الانقسامية بعد الإعراب عن Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP يمكن أن تكون معزولة (تيشفيلد وأندرسون، غير المنشورة، وانظر تيشفيلد et al. 17). وهكذا، عن طريق جمع Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP الخلايا إيجابية مزدوجة عند أي نقطة أثناء البروتوكول، فمن الممكن للحصول على عدد خلايا التي يغلب إنهاء دورة الخلية داخل حوالي 18 ح من بعضها البعض. وهذا على النقيض من Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP--فقط الإعراب عن الخلايا التي تمثل أنواع مختلفة من فروعه والسلائف، على التوالي، من بيرثداتيس متفاوتة.

يمكن استخدام الخط المزدوج-مراسل مسك Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP لإثراء التليسكوب الطالع إينتيرنيورونس. بشكل عام، إضافة SHH إلى الثقافات وجمع بروتينات فلورية خضراء + يثري الخلايا في نقاط زمنية سابقة في التفريق بين (مثلاً، DD12) للأنواع الفرعية طائرة أسرع من الصوت. استناداً إلى ملاحظاتنا، لكننا لم نر فرقا كبيرا في نسبة SST:PV اعتماداً على ما إذا كان يتم إضافة SHH في DD5 أو DD8 (البيانات لا تظهر). عن طريق إضافة SHH (50 نانوغرام/ملليلتر) من DD8-12 ومن ثم زرع الخلايا وإذ تعرب عن التجارة والنقل فقط، نحصل على متوسط نسبة 7:1 من15،SST:PV قطرية (الشكل 2A)17. لمزيد من التفاصيل حول آثار SHH والوقت في الثقافة على مصير إينتيرنيورون استخدام خطنا مسك المزدوج-مراسل، راجع تايسون et al. 15

لإثراء لقطرية PV الطالع، يجب حذف SHH من وسائط الثقافة. من المذكرة، متسقة مع اشتراط SHH إشارات إلى الحفاظ على التعبير Nkx2.1 في21من فروعه الانقسامية، إشارات SHH موجود في هذه الثقافات دون SHH خارجية يتم إضافتها منذ SHH إشارات يلغي سيكلوباميني خصم Nkx2.1 التعبير15. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا إعادة مطلي في DD8، SHH الذاتية هذا إزالتها، مثل هذا الترهل (30 نانومتر) ينبغي أن تضاف إلى وسائل الإعلام من DD8-10 للحفاظ على التعبير Nkx2.1 وإنتاج قطرية. لدينا دراسة سابقة أظهرت أن بحجب SHH من ظروف الثقافة والفرز للخلايا Nkx2.1::mCherry+ في DD17، أي بنسبة ~2.6:1 الخلايا PV:SST يمكن الحصول عليها (الشكل 2)15. خلافا لدرجة حرارة سطح البحر الأنواع الفرعية، التي هي أثري في المراحل المبكرة وحضور SHH الخارجية، زادت المدة في الثقافة وانعدام SHH خارجية يثري PV الأنواع الفرعية15. وفي دراسة أكثر حداثة، وجدنا أبكسي التي تنطبق على البروتوكول "MGE" لدينا إلى حد كبير يزيد من جزء صغير أجداد Nkx2.1::mCherry التي تعبر عن cyclin D217، علامة على الخلايا السلف المتوسطة22. استند هذا الاختلاف البروتوكول لدينا وجدت أن قطرية الكهروضوئية-الإعراب عن تنبع أساسا من فروعه الوسيطة، حين المتكفل SST تنبع أساسا من فروعه شعاعي في سطح البطين23. وقد وجدنا أن عند فرز وزرعها في اللحاء الجديد الماوس الولدان، هناك تحيز موروث هذه إلى حد كبير لإنتاج الأنواع الفرعية الكهروضوئية. بإضافة أبكسي من DD8-11 وثم فرز الخلايا Nkx2.1::mCherry، كنا قادرين على الحصول على نسبة 5.8:1 من PV:SST أنواع فرعية (الشكل 2)17. لزيادة إثراء للأنواع الفرعية الكهروضوئية، قد نحن أيضا عزل الخلايا Nkx2.1::mCherry نمت حضور أبكي من DD8-17. بيد أننا لم نحقق زيادة في نسبة PV:SST بعد ما كنا قادرين على الحصول على DD11، وعلى الرغم من زيادة هامشية في النسبة المئوية لإنشاء المخططات PV (الشكل 2D). وترد في الشكل 3مخططات انسيابية لكل من هذه البروتوكولات. إيمونوستاينينج الماوس العقول زرع بعد 30 يوما مع مكافحة--PV ومكافحة-SST المضادة-التجارة والنقل (لتعزيز تحديد الخلايا Lhx6::GFP +) يظهر الأجسام المضادة أن Lhx6::GFP + الخلايا يحمل الخصائص المورفولوجية ناضجة مع أنماط التعبير الكهروضوئية، ودرجة حرارة سطح البحر شبيهة في فيفو نظرائهم (الشكل 4 و الشكل 5).

للمساعدة في تحديد ما إذا كان تفريق CIn يظهر نجاح، قمنا بإعداد سلسلة من الصور في كل مرحلة من البروتوكول لإثبات التغير الطبيعي (الشكل 6، 7 الرقم، الشكل 8). نحن تشمل أيضا رقماً تبين كيف يظهر تمايز غير ناجحة في DD4 (الشكل 9). وبوجه عام، سوف تسفر عن الاختلاف غير ناجحة مستويات منخفضة (أقل من 10 في المائة) من التعبير Nkx2.1 والنسب المئوية لتحريض Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP لما يقرب من 1 ٪ أو أقل.

Figure 1
رقم 1: جيل سلائف إينتيرنيورون Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP- (أ) الموضح هنا صور الممثل من إيمونوستينينج Nkx2.1 و Nkx2.1::mCherry (RFP) Lhx6::GFP (التجارة والنقل) من ثقافة قائمة على تمايز يوم 12 (DD12). علما أن هذه الصور هي تداخل القنوات من نفس الحقل للعرض. (ب) التحديد الكمي لمتوسط النسبة المئوية ل DAPI + نوى التي تعبر عن Nkx2.1 في DD12 في الثقافة (n = 3 الاختلاف المستقلة). (ج) نظام مراقبة الأصول الميدانية الممثل الأرض مما يدل على السكان خلية مختلفة الأربعة التي يمكن أن تكون معزولة استخدام خطنا ©جميع مراسل المزدوج. ملاحظة أن مشري على المحور السيني والتجارة والنقل على المحور ص. وهكذا، يمثل المربع الأيمن العلوي الخلايا التي إيجابية مزدوجة-مشري/التجارة والنقل. (د) دورة الوقت الاستقراء Nkx2.1::mCherry و Lhx6::GFP من DD6-16 معبراً عنه بالنسبة المئوية للخلايا في الثقافة أما مشري فقط التعبير عن، معربا عن التجارة والنقل فقط، أو مشري/التجارة والنقل المشترك معربا عن. تم الحصول عليها من الخلايا نمت حضور SHH خلال بروتوكولا SST إثراء هذه النسب المئوية وتمثل المتوسطات من الاختلاف المستقلة 3. أشرطة الخطأ في (ب) و (د) تمثل مقياس sem. بار = 150 ميكرومتر (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التلاعب بشروط ثقافة يثري خلطات الكهروضوئية--مقابل SST الطالع المستمدة مسك إينتيرنيورونس القشرية. (أ) النسبة المئوية ل PV + ودرجة حرارة سطح البحر + والكهروضوئية-/الحصول على طائرة أسرع من الصوت--إينتيرنيورونس عند DD12، الخلايا وإذ تعرب عن التجارة والنقل فقط ازداد حضور SHH (50 نانوغرام/ملليلتر) من DD5-12 يتم زرعها في اللحاء الجديد الوليد وحلل الزرع بعد 30 يوما. (ب) النسبة المئوية من PV + ودرجة حرارة سطح البحر + والكهروضوئية-/طائرة أسرع من الصوت--إينتيرنيورونس التي تم الحصول عليها عند مشري فقط الإعراب عن الخلايا DD17، نمت دون SHH تكميلية يتم زرعها في اللحاء الجديد الوليد وحلل 30 يوما ما بعد زرع الأعضاء. (ج) النسبة المئوية من PV + ودرجة حرارة سطح البحر + والكهروضوئية-/الحصول على طائرة أسرع من الصوت--إينتيرنيورونس عند DD11، مشري فقط الخلايا وإذ تعرب عن تزايد حضور تبلد (30 نانومتر؛ DD8-10) وأبكسي (2 ميكرومتر؛ DD8-11) يتم زرعها في اللحاء الجديد الوليد وحلل الزرع بعد 30 يوما. (د) النسبة المئوية من PV + ودرجة حرارة سطح البحر + والكهروضوئية-/الحصول على طائرة أسرع من الصوت--إينتيرنيورونس عند DD17، متشيري فقط من الخلايا إذ تعرب عن تزايد حضور تبلد (30 نانومتر) من DD8-10 وأبكسي (2 ميكرومتر) من DD8 17 يتم زرعها في اللحاء الجديد الوليد وحلل 30 يوما ما بعد زرع الأعضاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مخططات تفصيلية توضح البروتوكولات المختلفة إثراء الكهروضوئية، ودرجة حرارة سطح البحر الموصوفة في هذه الدراسة- (أ) لكل من البروتوكولات، الخطوات المؤدية إلى بدء المفاضلة بما في ذلك DD0-5 متطابقة. وتزرع في كافة الخلايا كهيئات امبريويد من DD0-3 في N2:KSR (1:1) تستكمل مع مثبط BMP LDN-193189 ومثبطات Wnt XAV-939. الخلايا في dd3 سعة، هي "سقطت" في N2:KSR (1:1) التي تحتوي على LDN-193189، XAV-939 ومثبط روك Y-27632. ويضاف إلى إثراء لطائرة أسرع من الصوت--أنواع فرعية، SHH DD5-12. وبدلاً من ذلك، يتم إضافة SHH DD8-12 منذ ذلك الحين، في تجربتنا، إضافة SHH من DD5 مقابل DD8 فصاعدا لا يؤثر بشكل ملحوظ نسبة PV:SST الأنواع الفرعية التي تم إنشاؤها. الإصدارات السابقة من البروتوكول (انظر تايسون et al. 15) لا تتضمن خطوة إعادة الطلاء على DD8 وتستكمل وسائل الإعلام مع SHH خارجية على DD5 بدلاً من ذلك. تم تغيير هذا البروتوكول لاحقاً إدماج خطوة إعادة الطلاء على DD8 جنبا إلى جنب مع إدخال SHH، لم يغير كثيرا من نسبة PV:SST. في هذا البروتوكول "عالية-SHH"، Lhx6::GFP + الخلايا نمت حضور SHH خارجية هي نظام مراقبة الأصول الميدانية معزولة عن DD12 للاستخدام في تطبيقات المتلقين للمعلومات. (ب) حذف PV "منخفضة-SHH"--بروتوكول، SHH الخارجية، فضلا عن أن الخطوة إعادة الطلاء على DD8. بدلاً من ذلك، تكون الخلايا Nkx2.1::mCherry+ نظام مراقبة الأصول الميدانية معزولة عن DD17 للاستخدام في تطبيقات المتلقين للمعلومات. (ج) "+ أبكسي" بروتوكول الكهروضوئية، تتم إضافة أبكسي جنبا إلى جنب مع تبلد DD8-10 وإضافة فقط أبكسي من DD10 فصاعدا. في DD11 أو DD17، هي خلايا Nkx2.1::mCherry نظام مراقبة الأصول الميدانية معزولة للاستخدام في تطبيقات المتلقين للمعلومات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: immunostaining الكهروضوئية، ودرجة حرارة سطح البحر في Lhx6::GFP + الخلايا 30 يوما بعد انتهاء عملية زرع في اللحاء الجديد الوليد. (أ) صورة عالية الطاقة طائرة أسرع من الصوت--الإعراب عن، Lhx6::GFP + 30 يوما بعد زرع الخلايا في اللحاء الجديد الوليد. داخل كل عمود من أربع صور صور قناة وحيدة للتعبير Lhx6::GFP والكهروضوئية، ودرجة حرارة سطح البحر مع صورة 3-القناة مدمجة في الجزء السفلي. كما هو موضح في أعلى اللوحة، هذه الخلايا العصبية Lhx6::GFP + بالتفصيل عمليات متعددة توحي مورفولوجيا ناضجة. (ب) صورة عالية الطاقة الكهروضوئية اثنين-الإعراب عن, Lhx6::GFP + الخلايا 30 يوما ما بعد زرع الأعضاء. (ج) صورة عالية الطاقة لطائرة أسرع من الصوت--/PV مزدوجة سلبية، Lhx6::GFP + الخلية. لا يعبر بوضوح على الرغم من أن هذه الخلية بالتفصيل عمليات متعددة تتفق مع كاملة التمايز والتكامل القشرية، عن هذه الخلية الكهروضوئية أو طائرة أسرع من الصوت. علما أن هناك نواة PV + Lhx6::GFP + الخلية المجاورة ولكن أن لا يتراكب. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر (أ-ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: متوسطة ومنخفضة الطاقة صور التعبير البروتين الكهروضوئية، ودرجة حرارة سطح البحر، و Lhx6::GFP 30 يوما بعد انتهاء عملية زرع في اللحاء الجديد الوليد. (أ) الطاقة المتوسطة صورة منطقة اللحاء الماوس الجديد يحتوي على 30 Lhx6::GFP + الخلايا 30 يوما بعد انتهاء عملية زرع. وقد نمت هذه الخلايا استخدام بروتوكول PV (+ أبكسي من DD8-11؛ نظام مراقبة الأصول الميدانية عزل وزرع Nkx2.1::mCherry+ في DD11). الخلايا 30 ينظر هنا، 16 يعرب الكهروضوئية، 4 التعبير عن درجة حرارة سطح البحر واكسبريس 10 الكهروضوئية لا طائرة أسرع من الصوت. (ب) الطاقة المنخفضة الصورة من منطقة اللحاء الماوس الجديد يحتوي على العديد المتمايزة جيدا Lhx6::GFP + الخلايا 30 يوما بعد انتهاء عملية زرع. ملاحظة الوفرة من Lhx6::GFP + عمليات التعقيب في جميع أنحاء القشرة. كما تم العثور على خلايا عرضية في قرن آمون، حيث تظهر للاندماج ووضع العمليات تتفق مع النمط الظاهري ناضجة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (A)؛ 550 ميكرون (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: مظهر طبيعي الماوس تنتجها الخلايا الليفية الجنينية تغذية طبقة والخلايا الجذعية غير متمايز. (أ) الموضح هنا هي 4 X والتكبير X 10 برايتفيلد الصور مما يدل على مظهر نموذجي لتغذية جنينية تنتجها الخلايا الليفية (MEF) الماوس لدينا طبقات ح 24 بعد الطلاء. (ب) سيظهر هنا هو مظهر نموذجي لدينا الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ميسكس) بعد الطلاء على مغذيات MEF 2 يوما. علما أن المستعمرات محيط مشرق وقطع ناقص أو مغزليا في المظهر. إذا تفقد محيط مشرق هذه المستعمرات أو البدء في إرسال التوقعات إلى الخارج، هذه هي العلامات التي قد يكون التفريق بين الخلايا. (ج) المعروضة هنا بعد إعادة الطلاء على أطباق الجيلاتين المغلفة كي تخفف من مغذيات MEF قبل بداية تمايز أيام ميسكس 1 و 2. علما بأن الخلايا الجذعية التوسع إلى حد كبير بعد 48 ساعة على الجيلاتين والبدء في إعادة اكتساب مظهر مغزليا مع محيط مشرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في 4 س و 10 X صور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: مظهر الخلايا الجذعية الجنينية الماوس على تمايز الأيام 1 إلى 7- (أ) يوم واحد بعد العائمة، ويمكن أن ينظر إلى الخلايا الجذعية تشكل امبريويد الهيئات الصغيرة (EBs). باليوم الثاني قد نمت الحديدية إلى حد كبير. علما بأن بعض الحديدية قد تمسك معا وتشكيل مجموعات أكبر من الخلايا. لا نجد أن هذا يؤثر سلبا على التفرقة. بعد 3 أيام، نمت الحديدية أكبر وبعض تحيل لم يعد الضوء من خلالهم. ومن الطبيعي أن نرى الحطام خلية في الخلفية. (ب) الموضح هنا هي الخلايا الجذعية 24 ساعة بعد هبوطها في تمايز يوم 4 (DD4). ملاحظة كثافة الخلايا. وبدأ العديد توسيع العمليات الصغيرة، والتي ستزداد مع استمرار التفرقة. نلاحظ هنا أن الخلايا الملونة حتى مع نقاط سوداء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء. إذا كانت الخلايا التي تظهر لامعة أو متجانسة، وهذا علامة على التمايز الشاذة. (ج) قبل DD5، ظلت الخلايا تتكاثر وتشكل مأخذ العصبية. وسعت العديد من الخلايا عمليات طويلة ورقيقة. (د) من DD7، يجب أن تكون الخلايا المتلاقية. ومن الطبيعي أن نرى نمطاً "جبن سويسري"، حيث إنشاء خلايا كبيرة، شقة، مولتينوكليتيد (ربما ابينديمال أو الخلايا الدبقية) جزر دائرية داخل طبقة من فروعه العصبية. أحياناً عندما تكون كثافة الخلية أعلى من المعتاد، لا هذا النمط "الجبن السويسري" ليس من التنمية، كما هو مبين في الصورة الوسطى. اعتماداً التمايز، قد يؤثر هذا على الاستقراء العصبية. 4 x و 10 x تشير إلى نسبة التكبير. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في 4 س و 10 X صور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: ظهور التمايز في 9 من خلال 14 يوما- يمكن تصور الخلايا المفردة (أ) يوم واحد بعد إعادة الطلاء. ملاحظة مظهرها ثنائي القطب، الذي نموذجي من فروعه العصبية. الثقافة متجانسة مع عدد قليل من أنواع الخلايا الأخرى المتسللة. الكثافة المناسب لهذه المرحلة. (ب) من DD11، قد نمت الخلايا أحادي الطبقة. مشابهة لمراحل سابقة في التفريق بين، كبير "مثل البيض" متعدد الأنوية الخلايا يمكن رؤية اينتيرسبيرسيد في جميع أنحاء. (ج) قبل DD13 تواصل الخلايا تتكاثر. يمكن مشاهدته الآن تشكيل التلال الصغيرة. العديد من الخلايا "مثل البيض" لا تزال موجودة في جميع أنحاء. من هذه النقطة فصاعدا، سوف تظهر الثقافة تغييرات قليلة فقط، باستثناء أكوام تنمو أكبر. 4 X، 10Xx، و 20 X تشير إلى نسبة التكبير. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في 4 X و 10 X الصور وشريط مقياس = 50 ميكرومتر في 20 X صور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: المظهر التمايز غير ناجحة في يوم 4- DD4 مهم من حيث تقييم نجاح التفريق لأنه يتبع إحدى الخطوات الأكثر صعوبة من البروتوكول: الهبوط على dd3 سعة. من DD4، كان الخلايا ح 24 لاسترداد بعد يجري فصلها عن الهيئات امبريويد. كما يمكن أن نرى هنا، معظم الخلايا تظهر لامعة ومتجانسة. تتخلل هي خلايا العرضية التي تبدو طبيعية، لها مظهر أكثر قتامة مع نقاط سوداء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء. وبالإضافة إلى ذلك، خلايا مسطحة كبيرة (كما يتبين في اللوحة اليسرى السفلي) يدل على التمايز الشاذة. في اللوحة اليسرى السفلي، تظهر ثلاثة على الأقل من مجموعات صغيرة من الخلايا (الأصفر الأسهم) كهيئات امبريويد الصغيرة، مما يشير إلى التفريق الخاطئ، والانفصال غير مكتملة من المجلس التنفيذي، أو ضعف التمسك بسطح لوحة الثقافة الخلية. هذه الصور تظهر خلافا لما هو مبين في الشكل 7 باء، التي تصور صحية وطبيعية الخلايا في DD4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بينما يكون هذا الأسلوب فعالة للغاية في الزخرفة المستمدة من J1 ميسكس (سكرك-1010)، شهدنا نجاح متغير مع خطوط مسك ويعزل الاستنساخ الأخرى. على سبيل المثال، Foxg1::venus ميسكس (EB3 المشتقة؛ دانجو et al. 13) الاستجابة ضعيفة لهذا البروتوكول وتحريض Foxg1 من DD12 عادة ما يقارب 1-2%. للأسباب التي لا نفهم تماما، استنساخ مراسل المزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP آخر (يسمى JQ59) التي كانت معزولة في وقت واحد كخط الموصوفة في هذا البروتوكول (يسمى JQ27)، تنتج أقل من 1% Nkx2.1-الإعراب عن خلايا عندما نما في ظروف مماثلة. سطر الأصل (J1؛ ATCC SCRC-1010)، ومع ذلك، يستجيب جيدا لهذا البروتوكول وتنتج النسب المئوية للإعراب عن Nkx2.1 الخلايا على DD12 مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 1B. إذا لزم الأمر، يمكن ضبط تركيزات XAV-939 و SHH/تبلد لتحسين شروط التفريق على أساس سطر بسطر. لدينا خبرة في استخدام هذا البروتوكول للتفريق بين خطوط ©جميع الأخرى إلى فروعه مثل MGE غير محدودة.

فيما يتعلق بخطنا ©جميع مراسل المزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP، أعرب ليس كل Nkx2.1 + الخلايا مشري. على الرغم من أن ما يقرب من جميع الخلايا مشري + التعبير عن البروتين Nkx2.1، متخلفة مراسل التعبير التعبير البروتين Nkx2.1، ولا سيما خلال المراحل المبكرة للتفريق بين (DD7-9). جزء يسير من Nkx2.1 + الخلايا التي تعبر عن مشري اطراد زيادة طوال الدورة للتفريق بين. في مستويات الذروة (~ DD12-14) يعبر عن مشري بحوالي 30 في المائة من جميع Nkx2.1 الإعراب عن موروث17. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت نفس الصبغي الاصطناعي البكتيرية المستخدمة للتعبير مشري محرك الأقراص لمحرك الأقراص recombinase لجنة المساواة العرقية في مجالات التعبير Nkx2.1 من الفئران المحورة وراثيا24. في هذه الفئران، Cre-التعبير ضعيفة داخل الخلايا الإعراب عن Nkx2.1 من المنطقة الظهرية أكثر من MGE، ورسم الخرائط ذات الصلة-مصير مع هذا الماوس يبدو أن تسمية وكيل معربا عن SST قطرية أن من المعروف أن تنشأ إلى حد كبير من هذه المنطقة25، 26،،من2728. ومع ذلك، على الرغم من هذه الاختلافات، الملايين من التجارة والنقل أو الخلايا متشيري-الإعراب عن يمكن عزل بساعات قليلة فقط من نظام مراقبة الأصول الميدانية.

هناك نوعان من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب. أولاً، عندما تقترن بخطنا مسك المزدوج-مراسل Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP، من الممكن الحصول على إعداد كبيرة من السلائف إينتيرنيورون المخصب لتصبح المخططات إينتيرنيورون القشرية الكهروضوئية أو التليسكوب الطالع. والميزة الرئيسية الثانية هي السهولة النسبية التي أعدادا كبيرة من إينتيرنيورون الطالع يمكن الحصول على الخلايا. على الرغم من وجود عدة تقنيات EB معدلة أخرى للتمييز بين فروعه MGE والخلايا العصبية، تعتمد هذه البروتوكولات عادة على استخدام جزيئات Wnt المثبطة مثل Dkk113،،من1429. وقد وجدنا أن المانع Wnt XAV-939 يعزز إلى حد كبير جيل أجداد تيلينسيفاليك باليدال، كما يتضح من التعبير Foxg1 و Nkx2.115.

وكما ذكر آنفا، توجد عدة طرق أخرى لتوليد مثل MGE موروث من ميسكس. واتانابي وآخرون 14 رائدا في مجال التمايز تيلينسيفاليك من ميسكس بأن تكون أول من وضع أسلوب ثقافة خالية من المصل تعليق متبوعاً بإعادة طلاء على سطح ملتصقة. ووجدوا أن الخصوم Wnt ونضال، Dkk1 وليفتيا، على التوالي، وكفاءة قاد ميسكس في أوائل نيوروكتوديرمال الأنساب13. بتطبيق SHH على هذه الثقافات، أنها لاحظت أن ما بين 5-15% من كافة الخلايا في ثقافة المشترك أعرب Nkx2.1/Foxg1 ويمكن اعتبار فروعه مثل MGE13. بيد مع إرساء الأسس لدراسات كثيرة قادمة، هذه الدراسة لم يكن لدى وسيلة لعزل MGE موروث أو إثراء للأنواع الفرعية CIn خاصة.

بعد عدة سنوات، دانجو et al. 13 يستخدم نفس الأسلوب ثقافة خالية من المصل تعليق في تركيبة مع توقيت إقامة مختلف عوامل النمو، في SHH خاصة، تحقيقا لمواصفات دون الأنسجة تيلينسيفاليك البطني المستمدة من مسك. استخدام خط مراسل Foxg1::venus، وجدوا أن الإدارة SHH dd3 سعة 12 بعد العلاج Dkk1 أدى إلى ما بين 45-68 في المائة من كافة الخلايا في الثقافة معربا عن مراسل Foxg1::venus13. وأعرب نحو 32 في المائة خلايا داخل Foxg1::venus + السكان، Nkx2.113. باستبدال SHH الترهل وإضافة Fgf8، مواصلة تعزيز جزء صغير أجداد Nkx2.1 داخل Foxg1::venus + السكان إلى حوالي 41%13. عندما جزيئي لمصير، تنتج هذه الخلايا حوالي SST 17%، PV 21%، 18% نبي و 8% كالريتينين الأنواع الفرعية13. بيد بينما هذه الدراسة وصف أسلوب لتعيين فريق الخبراء الاستشاري مقابل مصائر المستمدة من MGE CIn، أنها لم تصف طريقة لإثراء بشكل انتقائي للأنواع الفرعية الكهروضوئية أو طائرة أسرع من الصوت.

في السنة التالية، كامبراي et al. 11 استخدمت طريقة خالية من المصل أحادي الطبقة مع إعادة الطلاء على DD5 لدراسة تأثير أضافت على التفرقة وهوية السلائف العصبية تيلينسيفاليك المستمدة من الماوس وبتوليدا البشرية. على الرغم من أن هذه الدراسة لم تبلغ النسبة المئوية للخلايا Nkx2.1 المتولدة عن البروتوكول، التقرير المشترك أعرب حوالي 54% خلايا في الثقافة نيستين/Foxg1 على DD2 (5 أيام نمو في مصل الدم وسائل الإعلام الحرة تليها إضافية 2 يوما من الثقافة وبعد إعادة الطلاء)11. أنها أيضا ذكر أن مع إضافة أضافت، ~ 55% خلايا المشترك أعربت عن نيستين وكوبتفي، مما يشير إلى أن هذه الخلايا قد تمثل ganglionic والذيلية نيافة مثل الخلايا التي تنتج أغلبية الإعراب عن كالريتينين إينتيرنيورونس القشرية 11-وفي الواقع، وجد 39% خلايا شارك إكسبريس كالريتينين/بيي-tubulin، بينما تم العثور على 59% خلايا للتعبير عن المشاركة GABA/بيي-tubulin11قبل 8 أيام في الثقافة (الإجمالي 13 يوما). لم تدرس هذه الدراسة إنتاج الأنواع الفرعية الكهروضوئية أو طائرة أسرع من الصوت.

مرة أخرى باستخدام أسلوب EB معدلة، تشن et al. 12 أثبت أن محسن MGE محددة عناصر يمكن استخدامها لتتبع وتنقية الخلايا الجذعية المشتقة مثل MGE الخلايا12. في هذه الدراسة، أنها مقارنة تأثير ظروف ثقافة مختلفة أثناء الاختلاف موجها من ميسكس إلى فروعه MGE مثل استخدام خط مراسل Lhx6::GFP؛ نفس الخط الذي يخدم كخط الأصل للخط المزدوج-مراسل Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP الموصوفة في هذه المخطوطة. أنها أظهرت أنه بإضافة Dkk1 إلى الثقافة الظروف من DD0-3، تليها إضافة تبلد، upwards من ~ 10% من كافة الخلايا في الثقافة وأعرب عن Lhx6::GFP12. كما وجدت أن البروتوكول نفسه، ينطبق على خط Foxg1::venus وصف دانجو et al. 12، أسفرت عن حوالي 37 في المائة من كافة الخلايا معربا عن مراسل Foxg1::venus. وعندما Lhx6::GFP الخلايا المزروعة في فيفو، لوحظ متوسط النسب المئوية التالية لعلامات النوع الفرعي CIn: PV 22% و SST 58 في المائة و 16 في المائة نبي12.

في الآونة الأخيرة، استخدمت جماعات أخرى التعبير القسري عن النسب وتحديد عوامل النسخ مباشرة تحديد قطرية. وربما كان أول مظاهرة هذا بتروس et al. 10 الذين اعتادوا على مروج الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي محرك التعبير Nkx2.1 في ميسكس Ainv15 التي تم تعديلها لتحتوي على كروموسوم Lhx6::GFP اصطناعي البكتيري. هذه الدراسة تستخدم الثقافة في ظروف مشابهة لتلك الموضحة في هذه المخطوطة الحالية ولكن دون إضافة XAV-93910. ومع ذلك، للأسباب التي هي غير مفهومة، لوحظت نسبة مئوية أقل من Lhx6::GFP + الخلايا تحت نفس الظروف التمايز مقارنة عند استخدام الخط الأصلي J1 Lhx6::GFP الموصوفة في هذه المخطوطة10. وعلى الرغم من تحقيق مستويات مماثلة من Foxg1 الخلايا التعبير (المجموع % غير معروف)، كان هناك انخفاض معتدل في إجمالي عدد Nkx2.1 مع عدم وجود أكثر من 2% من كافة الخلايا معربا عن مراسل Lhx6::GFP10. وتبرز هذه الدراسة الاختلافات المتأصلة التي توجد بين مختلف خطوط ESC والتحديات التي تواجه الباحثين عند محاولة تطبيق البروتوكولات التمايز على ESC خطوط مختلفة عن تلك التي استخدمت لوضع البروتوكولات أصلاً.

استخدام نهج أنيقة، الاتحاد الأفريقي et al. 9 يستخدم التعبير القسري متسلسلة من عوامل النسخ إلى توليد أنواع فرعية محددة من إينتيرنيورونس القشرية باستخدام نفس نموذج المفاضلة تيلينسيفاليك البطني وضعتها واتانابي وآخرون 14 وفي حين أنها لا تبلغ النسب الدقيقة ل Foxg1 + Nkx2.1 + و Olig2 + السلائف التي أنتجت في الثقافة، أنها الدولة أن حوالي 50% من كافة الخلايا في ثقافة متمايزة في الخلايا العصبية جابايرجيك9. في التفريق بين ما بعد 11 يوما، نات الحديدية وزرعها في أجنة المضيف MGE E13.59. نسبة مئوية صغيرة من هذه (أقل من 1 ٪) تم ترحيل من MGE القشرة، حيث أنها حددت بها مراسل Dlx5/6-اجفب وتحليل لمصير9. لاحظ المؤلفون مجموعة متنوعة من النسب المئوية الكهروضوئية، والتليسكوب ومصائر مثل فريق الخبراء الاستشاري استناداً إلى استراتيجية الاستقراء القسري الذي اخترته على9. من المثير للاهتمام، مع التعبير عن عامل النسخ Lmo3، ولاحظوا في المتوسط حوالي PV 57%، SST 21%، والأنواع الفرعية المشتقة من فريق الخبراء الاستشاري 15% (درجة حرارة سطح البحر-ريلين + أو كبار الشخصيات-فقط +)9. تم الحصول على نسبة أكبر من الأنواع الفرعية SST لاحظ استخدام خط Nkx2.1/Dlx2 "صندوق القناص"، والتي تنتج حوالي 32% درجة حرارة سطح البحر، PV 35% و 25% الأنواع الفرعية المشتقة من فريق الخبراء الاستشاري9.

في عام 2015، كولاسانتي et al. 30 أظهرت أن تحويل التعبير القسري عن خمسة عوامل النسخ (Foxg1، Sox2، Ascl1، Dlx5، و Lhx6) داخل الخلايا الليفية من الفئران مراسل GAD67-التجارة والنقل 15% من كافة الخلايا إلى قطرية مثل جابايرجيك. بشكل ملحوظ، ذهب حوالي 90% من هذه الخلايا الإعراب عن الكهروضوئية، مع خلايا نادرة فقط الإعراب عن التليسكوب30. على الرغم من أن هذا الأسلوب لم يطبق على ميسكس, أنه كان يستخدم مع إيبسكس البشرية، حيث يقدر بأن حوالي 30 في المائة من كافة الخلايا اعتمدت هوية جابايرجيك30.

كما هو مبين في الشكل 2، هناك عدة طرق لتوليد السكان المخصب الكهروضوئية أو قطرية طائرة أسرع من الصوت. المزايا الرئيسية أبكسي استخدام بروتوكول الكهروضوئية عبر بروتوكول DD17 هي عدد أكبر من الخلايا واحدة يمكن عزل، والخلية الجدوى والمدة للثقافة. على الرغم من أننا لا تظهر البيانات عن مستويات تعريفية DD17 في الشكل 1، هناك ما يقرب من ضعف عدد مشري + الخلايا في DD11 كما أن هناك في DD17 (البيانات لا تظهر). عند جمع الخلايا للزرع، نجد أن عددا أكبر من ابتداء من الخلايا (انظر أدناه) مفيد، منذ حوالي 30-50 ٪ خلايا يتم فقدان عملية التركيز عليها للحقن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على عدد أكبر من الخلايا بأوقات أقصر من نظام مراقبة الأصول الميدانية، مما يحد من مقدار الوقت التي تكون الخلايا على الجليد ويقلل من التكلفة الإجمالية. ربما لأن نسبة مئوية أعلى من الخلايا الكرز + موروث، يحمل الخلايا من المراحل السابقة للثقافة (مثلاً، DD11) بقاء أكبر بالمقارنة مع الخلايا DD17 بعد زرع في اللحاء الجديد الوليد. عند الحاجة إلى إعداد كبيرة من الخلايا قادرة على البقاء، على سبيل المثال في حالة زرع الخلايا لعلاج الصرع، بعد كل من السكان انطلاق أكبر وصلاحية أكبر ميزة كبيرة.

كما هو مبين في الشكل 2، اعتماداً على البروتوكول، وحلل حوالي 25-39% خلايا Lhx6::GFP + 30 يوما ما بعد زرع الأعضاء لا تعبر عن مستويات ملحوظة من البروتين الكهروضوئية أو درجة حرارة سطح البحر مع immunohistochemistry الروتينية. وبشكل عام، هذه PV-/خلايا SST إكسبريس غابا، فضلا عن Sox6، علامة على إينتيرنيورونس القشرية المستمدة من MGE (انظر تايسون et al. 15, تيشفيلد et al. 17)-أقل من 1 في المائة من PV-/طائرة أسرع من الصوت--Lhx6::GFP + الخلايا علامات صريحة للأفرقة الفرعية الأخرى إينتيرنيورون، مثل كالريتينين أو الريلين أو neuropeptide Y (البيانات لا تظهر). وهذا يماثل في فيفو مصير رسم خرائط الدراسات التي أظهرت أن ما بين ~ لا تعبر عن 15-25% إينتيرنيورونس المستمدة من MGE الكهروضوئية أو التليسكوب23،،من2531. عندما يتم عزل الخلايا Nkx2.1::mCherry+ أو Lhx6::GFP + ومطلي على الفئران مغذيات القشرية في المختبر، وقد وجدنا أن ~ 40-70% من Lhx6::GFP + خلايا تحليل بعد 28 يوما في الثقافة الكهروضوئية-/-درجة حرارة سطح البحر، مع أغلبية من تلك التي وصمة عار الإيجابية وإذ تعرب عن درجة حرارة سطح البحر. وهذه الزيادة في PV-قد تكون طائرة أسرع من الصوت--الخلايا نظراً لعدم وجود إشارة maturational الخارجية الحالية في فيفو، كما قد تكون خاصة حالة ناضجة PV التعبير، أو مدخلات الكهربية دون المستوى الأمثل من الخلايا المغذية. أيا كان السبب قد يكون، نحن نفضل أن زرع خلايا في اللحاء الجديد الوليد للتمايز مصير التحليل بدلاً من المختبر .

لمعظم تجارب الزرع، نوصي تطفو على DD0 على الأقل هما زراعة الأنسجة غير ملتصقة 10 سم الأطباق كل تحتوي على 7.5 × 105 ميسكس في 10 مل من N2/قصر (7.5 × 104 خلايا/مل؛ الحجم الإجمالي 20 مل). معا، على حد سواء لوحات تسفر عادة 8-12 × 106 خلايا بعد الانفصال EB على dd3 سعة، أي 5.4 × 106 خلايا يمكن استخدامها للبذور هما زراعة الأنسجة 6-جيدا التعامل مع لوحات (50,000 الخلايا/سم2؛ وحوالي 110 سم2 المجموع). قبل DD8، غلة كل لوحة 6-جيدا حوالي 5-7 × 107 الخلايا، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك البذور ثلاثة إضافية إلى خمس لوحات 6-جيدا في كثافة 250,000 الخلايا/سم2 (التي تتطلب مجموعة 4.05 × 107 الخلايا في حالة ثلاثة 6-جيدا لوحات أو 6.75 × 107 الخلايا في حالة خمسة آبار 6 لوحات). طريق DD14، سيحقق كل لوحة 6-جيدا عادة 1-2.5 × 106 مشري أو خلايا معربا عن التجارة والنقل. اعتماداً على احتياجات التجربة، طرحت علينا الحد ني 7.5 × 105 ميسكس immunohistochemistry الصغيرة بتحليل لما يزيد عن 6 × 106 ميسكس لمشاريع زراعة كبيرة.

يتم الحفاظ على الخطوات الأكثر أهمية البروتوكول ميسكس في دولة pluripotent قبل بداية التمايز والخطوة الهبوط/الانفصال عن dd3 سعة. إذا تمت المحافظة على الخلايا بشكل صحيح ويتم ذلك الهبوط/الانفصال عن dd3 سعة بعناية، سوف تكون المفاضلة عادة ناجحة. فقط الخلايا الجذعية التي تظهر صحية، وينبغي أن تستخدم للتفرقة. إذا فشل الحديدية تشكل بين DD0-3 أو تشكيل متعددة، فالهيئات الصغيرة، غير متناظرة، التفريق بين يحتمل أن تكون غير ناجحة. بالإضافة إلى ذلك، أثناء تفكك EB على dd3 سعة، في اجتماع المجلس التنفيذي بعناية رصداً حتى لم تعد مرئية بالعين لتجنب التعرض لفترة طويلة لغير التربسين ريجنت الانفصال من الخلية التي تحتوي على.

تم التوصل إلى النتائج المعروضة في هذه الورقة تحت ظروف محسنة باستخدام الكواشف مراقبة الجودة. هذا أمر مهم لملاحظة أن لدينا أحياناً صعوبة تحقيق قوية Nkx2.1 التعريفي، والتمديد ومشري والتعبير مراسل التجارة والنقل. استناداً إلى تجربتنا، نحن نعتقد أن تقلب الكثير للكثير من الحسابات FBS الأكثر احتمالاً لهذه التغييرات. على هذا النحو، فمن الحكمة لاختبار مختلف الكثير من FBS لتحديد التي تعمل بشكل أفضل للحفاظ على ميسكس. على الرغم من أننا لم تستخدم نظام 2i/ليف (متوسط خالية من المصل الذي يتضمن مجاهدي خلق مثبطات PD03259010 و GSK-3α/β مثبط CHIR99021)، فمن الممكن أن ظروف خالية من المصل مسك قد تسفر عن نتائج أكثر اتساقا. لا، ومع ذلك، اختبار هذه الفرضية لدينا بعد، ولا تحتوي على بيانات بشأن ما إذا كان استخدام وسائط الإعلام ©جميع خالية من المصل يؤثر على التفريق بين ميسكس في فروعه مثل MGE. وبالإضافة إلى ذلك، يجب التأكد من استخدام عوامل النمو جديدة عندما يكون ذلك ممكناً قبل اليقوتينج لهم للاستخدام مرة واحدة. تبعاً للمستخدم، قد تحتاج كثافة الخلية زيادة تحقيق بقاء الخلية الملائمة، لا سيما أثناء الخطوة المقصودة في dd3 سعة.

وقد إينتيرنيورونس قدرة رائعة على البقاء على قيد الحياة، وترحيل، ودمج الدوائر المضيف بعد زرع الأعضاء. على هذا النحو، يمكن استخدام هذا البروتوكول لزرع إينتيرنيورون السلائف إلى نماذج الماوس الصرع ونماذج أخرى من الأمراض العصبية والنفسية العصبية (انظر سوثويل وآخرون 32 و تايسون وأندرسون33 لملاحظات الخلية إينتيرنيورون على أساس العلاج). على سبيل المثال، في دراسة حديثة دونيجان et al. 34 أثري السكان الكهروضوئية وقطرية SST لزرع الأعضاء في نموذج ماوس لمرض الفصام. ووجدوا أن تثري الكهروضوئية، ودرجة حرارة سطح البحر زرع تنتج تأثيرات مختلفة على سلوك الماوس، مع السكان PV أثري تطبيع اندوفينوتيبيس الفصام بأنهم يدرسون.

في السنوات الأخيرة، استخدمت نظام ينقول بيجيباك لتحقيق التعبير مستقرة المتسلسلات في عدد من النظم. وقد استخدمنا هذا النظام بسرعة وسهولة إنشاء ستابلي الإعراب عن نيات ميرنا الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي دراسة دور الجينات خاصة أثناء تطوير إينتيرنيورون. ونحن أيضا استخدام هذه التكنولوجيا لإنشاء مراسل المزدوج مسك الخطوط التي تعبر عن تشانيلرهودوبسين-2 (ChR2) إلى أوبتوجينيتيكالي ©جميع محرك الأقراص المستمدة إينتيرنيورونس أو تكنولوجيا مستقبلات دريد تشغيل أو إيقاف تشغيله زرع الخلايا جماعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن ممتنون "شو تشينغ" على تطوير Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP مراسل المزدوج مسك خط فضلا عن تايسون جنيفر والتوقيع عاصف، وتروس تيم لعملهم في وقت مبكر في المساعدة على تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا ختم التدفق الخلوي الأساسية للمساعدة التقنية. أيد هذا العمل MH066912 R01 المعاهد الوطنية للصحة (SA) و F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

علم الأعصاب، 130 قضية، الدماغ، الماوس، إينتيرنيورون، التمايز، اللحاء، خلية ثقافة، والخلايا الجذعية، وزرع
تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter