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Neuroscience

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Abstract

Corticali GABAergici sono una popolazione eterogenea di cellule che giocano un ruolo critico in che regolano l'uscita dei neuroni piramidali eccitatori, nonché la sincronizzazione le uscite dell'ensemble neurone piramidale. I deficit nella funzione Interneurone sono stati implicati in una varietà di disordini neuropsichiatrici, compreso la schizofrenia, autismo ed epilessia. La derivazione di interneuroni corticali da cellule staminali embrionali non solo consente lo studio del loro sviluppo e la funzione, ma fornisce la comprensione nei meccanismi molecolari alla base della patogenesi dei disordini corticali da Interneurone. Interneuroni hanno anche la notevole capacità di sopravvivere, migrare e integrare in host circuiti corticali post-trapianto, che li rende i candidati ideali per l'utilizzo nelle terapie basate sulle cellule. Qui, presentiamo un metodo corpo-a-monostrato embryoid scalabile, altamente efficiente, modificato per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Utilizzando una linea di mESC reporter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Forniamo anche metodi per arricchire per parvalbumina (PV) o somatostatina sottogruppi di Interneurone (SST), che può essere utile per lo studio di aspetti della determinazione di destino o per l'uso in applicazioni terapeutiche che beneficerebbero Interneurone arricchita di sottogruppo trapianti.

Introduction

In entrambi i topi e gli esseri umani, circa la metà di tutto corticale interneuroni inibitori (CIns) hanno origine all'interno di una struttura subcortical transitoria, conosciuta come l'eminenza gangliare mediale (MGE), dove i progenitori di neuroepithelial CIns e altri un neurone e glial sottogruppi esprimono il fattore di trascrizione NKX 2.11,2. Sottogruppi di CIn o sottotipi sono definiti da intersecanti morfologiche, neurochimici, elettrofisiologici e connettività caratteristiche3,4. Il CIns MGE-derivati possono essere raggruppati in sottogruppi per lo più non sovrapposte basati sulla loro espressione di PV o SST, l'espressione di cui correla con particolare elettrofisiologici e connettività di tendenze5. Disfunzione di interneuroni, specialmente quelli nel sottogruppo PV, è stata implicata in più neuropsichiatrici disturbi e malattie6,7. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di produrre cellule staminali derivate mitotici progenitori e precursori migratori arricchiti per destino o PV o CIn SST per studiare biologia Interneurone corticale e per uso in terapie basate sulle cellule.

Abbiamo sviluppato un metodo scalabile, altamente efficiente per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da mESCs. Utilizzando un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linea8, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite FACS e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Manipolando un numero di vie di segnalazione, durata della cultura e la modalità della neurogenesi, possiamo ottenere milioni di precursori fluorescente contrassegnati Interneurone adatti per una miriade di applicazioni a valle.

Anche se esistono diversi altri metodi per la generazione di MGE-come progenitori da mESCs9,10,11,12,13,14, il nostro metodo, che si basa su Wnt antagonista XAV-939, è particolarmente efficiente nella generazione Foxg1/NKX 2.1 cheesprimono telencefalici progenitori. Inoltre, la possibilità di selezionare per progenitori Interneurone o loro progenie che esprimono Lhx6 post-mitotici tramite il nostro sistema di dual reporter, migliora notevolmente la capacità di generare distinte dei progenitori e la loro progenie.

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Protocol

Nota: La linea di mESC dual reporter descritta in questo protocollo è disponibile su richiesta (sande@mail.med.upenn.edu).

1. Media preparazione

Nota: Caldo tutti i media a 37 ° C prima dell'uso nella coltura delle cellule.

  1. Media dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF) (per la preparazione di 500 mL)
    1. Aggiungere 50 mL di siero fetale bovino (FBS) 449 mL di Medium (DMEM dell'Aquila per volta) di Dulbecco e filtro attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
    2. Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C per fino a 1 mese o aliquotare e conservare a ≤-20 ° C.
  2. Media di N2 (per la preparazione di 500 mL)
    1. Aggiungere 5 mL L-alanina-L-Glutammina (100x) e 500 µ l 2-mercaptoetanolo (55 mM) a 489,5 mL DMEM: miscela nutriente F-12 (DMEM/F-12) e filtrare attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
    2. Aggiungere 1 mL agente antimicrobico (50 mg/mL) e 5 mL N2 supplemento-B dopo filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C al buio per 1 mese.
  3. Terreno di coltura privo di siero (KSR) (per la preparazione di 500 mL)
    1. Aggiungere 75 mL integratore privo di siero medio, 5 mL L-Glutammina (100x), 5 mL MEM aminoacidi Non essenziali (MEM-NEAA) (100 x), e 500 µ l 2-mercaptoetanolo (55 mM) per mL 413,5 non-glutammina contenente DMEM e filtrare attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
    2. Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C per 1 mese.
  4. Mouse sulle cellule staminali embrionali multimediale (per la preparazione di 500 mL)
    1. Aggiungere 75 mL cellule staminali FBS, 5 mL grado MEM-NEAA (100x), 5 mL L-Glutammina (100x), e 500 µ l 2-mercaptoetanolo (55 mM) per mL 413,5 non-glutammina contenente DMEM e filtrare attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
    2. Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C al buio per fino a 1 mese o aliquotare e conservare a ≤-20 ° C.

2. coltura mESCs

  1. Piastra di cellule di alimentatore MEF mitotically inattive nei media MEF sulle piastre di coltura del tessuto trattato a 3-4 x 104 cellule/cm2. Consentire almeno 12 h per loro di stabilirsi in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO2 prima il mESCs di placcatura. Se non utilizzato immediatamente, sostituire il supporto MEF ogni 3 giorni. Smaltire MEFs se non utilizzato entro 7 giorni di placcatura.
  2. Aggiungere mESCs (gamma di densità da 1 a 4 x 104 cellule/cm2) piastre MEF in mESC supporti contenenti il fattore inibitorio di leucemia del Mouse (mLIF) (1.000 U/mL). Incubare le cellule a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO2.
  3. Passaggio mESCs con tripsina-EDTA (0.05% tripsina) (1:5-1:10) una volta che il piatto diventa ~ 70-80% confluenti o se le colonie stanno cominciando a toccare. Questo in genere si verifica ogni 2 giorni, ma può richiedere fino a 4 o 5 giorni a seconda della densità di placcatura iniziale.
  4. Mantenere il mESCs su uno strato dell'alimentatore MEF in mezzo mESC per mantenere la pluripotenza.
  5. Prima di iniziare la differenziazione, passaggio delle cellule almeno una volta su piastre di gelatina rivestito senza MEFs di diluire fuori il MEFs.
    1. Preparare piastre rivestita di gelatina aggiungendo 0,1% gelatina in tampone fosfato salino (PBS) con Ca2 +/Mg2 + per un piatto di coltura di tessuti trattato e lasciando a 37 ° C per almeno 1 h. piastra 1,5-2 x piastra di 106 cellule/10 cm (2.7-3.6 x 104 cellule/cm2) e permettono alle cellule di espandere per 2 giorni prima dell'inizio di differenziazione.

3. differenziazione mESCs verso progenitori telencefalico MGE-come

  1. Giorno di differenziazione (DD) 0 = "galleggiare le cellule"
    1. Dopo il mESCs sono cresciute piastre di gelatina rivestito per 2 giorni, i media di aspirare e lavare le cellule una volta con PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Aggiungere sufficiente tripsina-EDTA (0.05% tripsina) per coprire la superficie della piastra (in genere 4 mL tripsina-EDTA per un piatto di coltura del tessuto di 10 cm) e inserire le celle in incubatore a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO2 per 4 min.
    2. Dopo 4 min, placare la tripsina-EDTA utilizzando 2 volte il volume con mESC media. Trasferire le cellule in una provetta per centrifuga dimensioni appropriate e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min. Dopo 5 min, rimuovere il tubo ed aspirare i media senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 1 mL di KSR:N2 media (1:1) contenente l'inibitore BMP LDN-193189 (250 nM) e l'inibitore di Wnt XAV-939 (10 µM).
    3. Misurare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato. Iniziano a crescere le cellule come corpi embryoid (EBs) con l'aggiunta di 75.000 cellule/mL in KSR:N2 media (1:1) che contengono LDN-193189 (250 nM) e XAV-939 (10 µM) in piastre di coltura del tessuto non aderente. Incubare le cellule a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO2.
  2. Il DD1, preparare per cella "sbarco" di rivestimento piatti di coltura di tessuti trattato con poli-L-lisina (10 µ g/mL in PBS con Ca2 +/Mg2 +) durante la notte (O/N) a 37 ° C con umidità relativa ≥ 95% o per almeno 1 h.
  3. Il DD2, aspirare il poli-L-lisina e rivestire le piastre con laminina (10 µ g/mL in PBS con Ca2 +/Mg2 +) O/N a 37 ° C con umidità relativa ≥ 95%.
    Nota: Mentre O/N è ottimale, il poco quanto 2 h può essere sufficiente. Se le piastre non sono utilizzati dal giorno successivo, aspirare laminin, sostituire con PBS senza Ca2 +/Mg2 +e conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.
  4. DD3 ("cellule della terra")
    1. Prima di iniziare la dissociazione di EB, aspirare la laminina e lasciate le piastre completamente asciutto in un cappuccio di coltura del tessuto. Non utilizzare le piastre che appaiono visibilmente bagnato o lucido. Trasferire l'EBs con media in una provetta da 15 mL e centrifugare per 3-4 min 15 x g o fino a quando l'EBs hanno pellettati.
  5. Aspirare i media e aggiungere 3 mL di soluzione di distacco delle cellule contenenti dnasi (2 U/mL) e incubare a 37 ° C con umidità relativa ≥ 95% e 5% CO2 per 15 min. flick delicatamente il tubo ogni 3 min per facilitare la dissociazione di EB.
  6. Una volta che l'EBs non sono visibili o sono trascorsi 15 minuti, aggiungere 6 mL KSR:N2 (1:1) contenente dnasi (1 U/mL) e centrifugare per 5 minuti a 200 x g.
  7. Le cellule in KSR:N2 (1:1) contenente LDN-193189 del piatto (250 nM), XAV-939 (10 µM) e l'inibitore di roccia Y-27632 (10 µM) a 4,5-5 x 104 cellule/cm2.

4. SST-arricchendo protocollo: "DD12 GFP alta Sonic Hedgehog (SHH)" (seguito dal punto 3.7)

  1. Il DD5, cambiare supporto con KSR:N2 (1:1) contenente FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e SSH (50 ng/mL).
  2. Preparare le piastre di coltura del tessuto per la ri-placcatura di il giorno 8 (punto 4.4) utilizzando le istruzioni descritte nei passaggi 3.2-3.3.
  3. Il DD7, cambiare supporto con KSR:N2 (1:1) contenente FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e SHH (50 ng/mL).
  4. Il DD8, ri-piastra le cellule.
    Nota: Mentre questo passaggio non è indispensabile, ri-placcatura le cellule possa ridurre tipi cellulari primi dissociati, indesiderati. Anche re-placcatura rompe le palle delle cellule che complicano l'analisi di immunohistochemical a valle e aumenta l'efficienza di FACS intervalli di tempo successivi.
    1. A piastra delle cellule, staccare le cellule dalla piastra con tripsina-EDTA (0.05% tripsina) per 5 min a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO2. Placare la tripsina-EDTA utilizzando 2 volte il volume con KSR:N2, e centrifugare a 200 x g per 5 min, filtrare le cellule attraverso un tubo filtro 40 µm per rimuovere eventuali grumi. Ri-piastra le celle alle 250.000 cellule/cm2 N2/KSR (1:1) contenenti FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e Y-27632 (10 µM) con SHH (50 ng/mL).
      Nota: Se invece, la decisione è presa non per ri-piastra le cellule su DD8, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti SHH (50 ng/mL) ogni 2 giorni da DD7 a DD12 e continuare ad aggiungere IGF-1 (20 ng/mL) e FGF-2 (10 ng/mL) fino al DD9.
  5. Il DD10, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti SHH (50 ng/mL).
  6. Il DD12, per ottenere cellule che sono arricchite per sottotipi di SST, utilizzare FACS per isolare Lhx6::GFP-solo che esprimono le cellule.
    1. Per staccare le cellule, utilizzare un reagente di cella-dissociazione contenente tripsina non anziché tripsina-EDTA. Lavare le cellule una volta con PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Aggiungere il pre-riscaldato non-tripsina contenente cellule-dissociazione reagente contenente dnasi (2 U/mL) per le cellule. Metterli in incubatore a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO2 per 10-30 minuti o fino a quando le cellule hanno staccato. Picchiettare delicatamente le piastre ogni 5 min per facilitare la dissociazione.
      Nota: Per culture DD11-12, può essere necessario solo 10-15 min. Per le culture di DD15-16, 30 min o più può essere richiesto per dissociazione completa.
    2. Una volta che le cellule hanno completamente tolto la piastra, procedere all'isolamento di FACS utilizzando protocolli standard o utilizzare le celle in altre analisi a valle.

5. PV-arricchendo protocollo: "mCherry DD11/DD17 + aPKCi" (seguito dal punto 3.7)

  1. Il DD5, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Preparare le piastre di coltura del tessuto per ri-placcatura su DD8 (punto 4.4) utilizzando le istruzioni descritte in precedenti 3.2-3.3.
  3. Il DD7, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Il DD8, ri-piastra le celle come descritto al punto 4.4 con le seguenti eccezioni: quando ri-placcatura le cellule, sostituire SHH con agonista levigato (SAG; 30 nM) e aggiungere atipica inibitore PKC (aPKCi; 2 µM). Presi insieme, i ri-doratura media è ora N2/KSR (1:1) contenente FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) e aPKCi (2 µM).
  5. Il DD10, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Nota: A questo punto, le cellule Nkx2.1::mCherry+ sono arricchite per diventare CIns PV.
    1. Staccare le cellule dal piatto per FACS usando lo stesso protocollo descritto al punto 4.6. Se la decisione è presa per raccogliere le cellule Nkx2.1::mCherry+ in un giorno più tardi di differenziazione, ignorare questo passaggio.
  7. Il DD12, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM). Il DD14, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM). Il DD16, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM). Il DD17, raccogliere le cellule di Nkx2.1::mCherry+ usando lo stesso protocollo descritto al punto 4.6.

6. PV-arricchendo protocollo: "DD17 mCherry basso SHH" (seguito dal punto 3.7)

  1. Il DD5, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL). Il DD7, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Il DD9, cambiare il supporto con KSR:N2 (1:1). Da questo punto in poi, ulteriori fattori di crescita non sono necessari.
    1. Continuare a modificare i media ogni 2 giorni fino a raccolta le cellule su DD17.

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Representative Results

Il protocollo descritto in questo documento è una versione modificata di nostri protocolli pubblicati15,16,17 ed è stato ottimizzato per l'uso con la nostra linea di dual-reporter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Aggiungendo l'inibitore di Wnt XAV-939 da DD0-5, combinato con ri-placcatura a DD8, raggiungiamo robusto NKX 2.1 induzione, in cui verso l'alto di 50% di tutti i nuclei DAPI + nella cultura sono anche NKX 2.1 esprimendo (Figura 1A, B). Immunohistochemistry per i mCherry ed i reporter GFP Mostra chiara espressione all'interno di regioni di immunoreactivity NKX 2.1-positivi (Figura 1A). FACS delle celle in tensione utilizzando il nativo reporter Mostra che quattro popolazioni delle cellule possono essere chiaramente isolati: cellule di doppia negazione (1) GFP/mCherry, (2) mCherry solo esprimendo le cellule, cellule esprimenti (3) solo GFP e (4) GFP/mCherry doppio-esprimendo le cellule ( Figura 1). Utilizzando questa linea, una piccola frazione dei progenitori inizia a accendere il reporter mCherry intorno DD8-9. I livelli di mCherry picco tra DD12-13 e poi il costante declino come progenitori uscire il ciclo cellulare e producono precursori post-mitotici Lhx6::GFP + Interneurone (Figura 1). Corrispondentemente, il reporter di Lhx6::GFP si accende tra DD9-10 e cime intorno DD13-14 (Figura 1). Anche se il numero totale di cellule Lhx6::GFP continua ad aumentare nella cultura, la percentuale non, probabilmente a causa della proliferazione di altri lignaggi. Una volta il Lhx6::GFP + reporter esprime, rimane rilevabile indefinitamente poiché Lhx6 è stabilmente espressa in interneuroni corticali MGE-derivato matura18,19. Anche se l'espressione NKX 2.1 e Lhx6 sono in gran parte non sovrapposte all'interno del forebrain murino, c'è una popolazione transitoria di Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP co-che esprimono le cellule in coltura. Questo è almeno parzialmente dovuto perdurance del reporter mCherry oltre l'arco di tempo normale di espressione NKX 2.1, come la maggior parte delle cellule doppio-etichettato non esprimono livelli rilevabili di proteina NKX 2.1 (Tyson e Anderson, non pubblicato). Cellule continuando a esprimere la Lhx6 reporter e il Cherry/NKX 2.1 proteine possono essere di interneuroni striatali20. Tuttavia, basata sui nostri studi di formazione immagine dal vivo, c'è una finestra di circa 18h in cui precursori sincroni, appena post-mitotici esprimendo Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP possono essere isolati (Tischfield e Anderson, inediti e vedere Tischfield et al. 17). così, attraverso la raccolta di Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP doppie cellule positive in qualsiasi punto durante il protocollo, è possibile ottenere una popolazione di cellule che principalmente hanno terminato il ciclo cellulare nel raggio di circa 18 ore uno da altro. Questo è in contrasto con Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP-solo che esprimono le cellule, che rappresentano vari tipi di progenitori e precursori, rispettivamente, di diverse date di nascita.

La linea di dual-reporter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP può essere utilizzata per arricchire per SST-fated interneuroni. In generale, aggiungendo SHH alle culture e raccogliendo GFP + cellule in momenti precedenti nella differenziazione (ad es., DD12) arricchisce per sottotipi di SST. In base alle nostre osservazioni, non abbiamo visto una differenza significativa nel rapporto di SST:PV a seconda che SHH è aggiunta alle DD5 o DD8 (dati non mostrati). Con l'aggiunta di SHH (50 ng/mL) da DD8-12 e poi trapiantare le cellule esprimenti sola GFP, otteniamo in media un rapporto 7:1 di15,SST:PV CIns (Figura 2A)17. Per ulteriori dettagli sugli effetti di SHH e tempo nella cultura sul destino di Interneurone utilizzando la nostra linea di dual-reporter mESC, vedere Tyson et al. 15

Per arricchire per PV-fated CIns, SHH deve essere omesso da terreni di coltura. Della nota, coerente con l'obbligo di segnalazione di mantenere NKX 2.1 espressione in progenitori mitotica21, SHH SHH segnalazione esiste in queste culture senza esogeno SHH viene aggiunto dal SHH segnalazione antagonista cyclopamine Elimina NKX 2.1 espressione15. Tuttavia, se le cellule sono ri-placcate su DD8, questo SHH endogeno viene rimosso, tale che SAG (30 nM) deve essere aggiunto ai media da DD8-10 a mantenere NKX 2.1 espressione e la produzione di CIns. Il nostro studio precedente ha dimostrato che di ritenuta SHH da condizioni di coltura e l'ordinamento per le cellule di Nkx2.1::mCherry+ il DD17, un rapporto di ~2.6:1 delle cellule di PV:SST poteva essere ottenuto (Figura 2B)15. In contrasto con SST sottotipi, che si arricchiscono alle fasi precedenti e in presenza di SHH esogeno, aumentato la durata nella cultura e mancanza di SHH esogeno arricchisce per PV sottotipi15. In uno studio più recente, abbiamo trovato che aPKCi applicato al nostro protocollo "MGE" significativamente aumenta la frazione dei progenitori Nkx2.1::mCherry che esprimono ciclina D217, un indicatore di di cellule progenitrici intermedio22. Questa variazione di protocollo si basava sulla nostra constatazione che esprimendo la PV CIns provengono principalmente da progenitori intermedi, mentre progenitori SST provengono principalmente da progenitori radiali al superficie ventricolare23. Abbiamo trovato che quando ordinate e trapiantate nel neocortex neonatale del mouse, questi progenitori sono influenzati notevolmente per la produzione di PV-sottotipi. Aggiungendo aPKCi da DD8-11 e quindi l'ordinamento Nkx2.1::mCherry cellule, siamo riusciti a ottenere un rapporto di 5.8: 1 di PV:SST sottotipi (Figura 2)17. Per arricchire ulteriormente per i sottotipi di PV, abbiamo isolato anche Nkx2.1::mCherry le cellule coltivate in presenza di aPCKi da DD8-17. Tuttavia, non abbiamo comunque ottenuto un aumento del rapporto di PV:SST di là di quello che siamo riusciti a ottenere presso DD11, nonostante un aumento marginale della percentuale dei sottotipi PV generati (Figura 2D). Diagrammi di flusso per ciascuno di questi protocolli sono contenuti nella Figura 3. Immunostaining del mouse cervelli 30 giorni post-trapianto con anti-PV, anti-SST e anti-GFP (per migliorare l'identificazione delle cellule di Lhx6::GFP +) anticorpi Mostra che Lhx6::GFP + cellule esibiscono caratteristiche morfologiche mature con pattern di espressione di PV e SST simile a loro in vivo controparti (Figura 4 e Figura 5).

Per aiutare a determinare se una differenziazione di CIn sembra avere successo, abbiamo preparato una serie di immagini in ogni fase del protocollo per illustrare la variabilità normale (Figura 6, Figura 7, Figura 8). Includiamo anche una figura che dimostra come una differenziazione riuscita apparirà il DD4 (Figura 9). In generale, differenziazioni infruttuosi produrrà (meno del 10%) i bassi livelli di espressione di NKX 2.1 e percentuali di induzione Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP di circa l'1% o meno.

Figure 1
Figura 1: generazione dei precursori di Interneurone Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP. (A) mostrato qui sono immagini rappresentative di immunostaining per NKX 2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) e Lhx6::GFP (GFP) da una cultura di differenziazione giorno 12 (DD12). Si noti che queste immagini sono sovrapposti e dallo stesso campo di vista. (B) quantificazione della percentuale media di DAPI + nuclei che esprimono NKX 2.1 presso DD12 nella cultura (n = 3 differenziazioni indipendente). (C), FACS rappresentativi trama dimostrando le quattro popolazioni differenti delle cellule che possono essere isolate utilizzando la nostra linea di mESC dual reporter. Si noti che mCherry è sull'asse x e GFP è sull'asse y. Il bauletto di destro rappresenta quindi, cellule che sono mCherry/GFP-double positive. (D) corso di tempo di induzione di Nkx2.1::mCherry e Lhx6::GFP da DD6-16 espresso come la percentuale di cellule in coltura che sono sola mCherry esprimendo, esprimendo la sola GFP o cheesprimono mCherry/GFP. Queste percentuali sono state ottenute da cellule coltivate in presenza di SHH durante un protocollo SST-arricchimento e rappresentano medie da 3 differenziazioni indipendente. Barre di errore in (B) e (D) rappresentano SEM. scala bar = 150 µm (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: manipolazione delle condizioni di cultura arricchisce differenzialmente per PV-versus SST-fated mESC derivato interneuroni corticali. (A) percentuale di PV +, SST + e PV - SST-interneuroni ottenuta quando DD12, sola GFP che esprimono le cellule coltivate in presenza di SHH (50 ng/mL) da DD5-12 sono trapiantate in neocortex neonatale e analizzati post-trapianto di 30 giorni. (B) percentuale di PV +, SST + e PV - SST-interneuroni ottenuta quando DD17, sola mCherry esprimere cellule coltivate senza supplementare SHH vengono trapiantate in neocortex neonatale ed analizzati 30 giorni post-trapianto. (C) percentuale di PV +, SST + e PV - SST-interneuroni ottenuta quando DD11, sola mCherry esprimenti le cellule coltivate in presenza di SAG (30 nM; DD8-10) e aPKCi (2 µM; DD8-11) sono trapiantate in neocortex neonatale e analizzati post-trapianto di 30 giorni. (D) percentuale di PV +, SST + e PV - SST-interneuroni ottenuta quando DD17, sola mCherry esprimenti le cellule coltivate in presenza di SAG (30 nM) da DD8-10 e aPKCi (2 µM) da DD8-17 sono trapiantate in neocortex neonatale e analizzati 30 giorni post-trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: diagrammi di flusso che illustrano i protocolli diversi di PV e SST arricchente descritti in questo studio. (A) per tutti i protocolli, i gradini che conducono fino all'inizio della differenziazione tra cui DD0-5 sono identici. Tutte le cellule sono coltivate come corpi embryoid da DD0-3 in N2:KSR (1:1) completati con il BMP-inibitore LDN-193189 e l'inibitore di Wnt XAV-939. Il DD3, le cellule sono "sbarcate" in N2:KSR (1:1) contenente LDN-193189, XAV-939 e l'inibitore di roccia Y-27632. Per arricchire per SST-sottotipi, SHH è aggiunto da DD5-12. In alternativa, SHH è aggiunto da DD8-12 poiché, nella nostra esperienza, l'aggiunta di SHH da DD5 contro DD8 in poi non influisce in modo significativo il rapporto dei sottotipi di PV:SST generato. Versioni precedenti del protocollo (Vedi Tyson et al. 15) non ha incorporato un passo ri-placcatura su DD8 e invece completati i media con SHH esogeno su DD5. Questo protocollo è stato successivamente alterato per incorporare un passo ri-placcatura su DD8 insieme all'introduzione di SHH, nessuno dei quali ha alterato significativamente il rapporto di PV:SST. In questo protocollo di "alta-SHH", Lhx6::GFP + cellule coltivate in presenza di SHH esogeno sono FACS isolato su DD12 per uso nelle applicazioni a valle. (B) per il "basso-SHH" PV-protocollo, SHH esogeni, come pure il passaggio ri-placcatura su DD8 vengono omessi. Invece, le cellule Nkx2.1::mCherry+ sono FACS isolato su DD17 per l'uso in applicazioni a valle. (C) per la "+ aPKCi" protocollo PV, aPKCi viene aggiunto insieme a SAG da DD8-10 e solo aPKCi è aggiunto da DD10 in poi. Il DD11 o DD17, le cellule Nkx2.1::mCherry sono FACS isolato per uso nelle applicazioni a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: PV e SST immunostaining in Lhx6::GFP + cellule 30 giorni post-trapianto in neonatale neocorteccia. (A) immagine di alto potere di un SST-esprimere, Lhx6::GFP + 30 giorni post-trapianto di cellule nella neocorteccia neonatale. All'interno di ogni colonna di quattro immagini sono immagini di singolo canale di espressione Lhx6::GFP, PV e SST con un'immagine unita 3-canale nella parte inferiore. Come mostrato nel pannello superiore, questo neurone Lhx6::GFP + elabora più processi indicativi di una morfologia matura. (B) immagine di alto potere di PV-esprimere due, cellule Lhx6::GFP + 30 giorni post-trapianto. Immagine di alto potere (C) di una SST- / PV-double negative, Lhx6::GFP + cell. Anche se questa cella elabora più processi coerenti con completa differenziazione e integrazione corticale, questa cella non esprimono chiaramente PV o SST. Nota che c'è un nucleo PV + adiacente alla cella Lhx6::GFP + ma che non si sovrappongono. Scala bar = 50 µm (A-C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: immagini di PV, SST e Lhx6::GFP l'espressione della proteina di media e bassa potenza 30 giorni post-trapianto in neonatale neocorteccia. Immagine di media potenza (A) di una regione della neocorteccia del mouse contenente 30 Lhx6::GFP + cellule 30 giorni post-trapianto. Queste cellule sono state coltivate utilizzando il protocollo di PV (+ aPKCi da DD8-11; FACS isolare e Nkx2.1::mCherry+ su DD11 di trapianto). Di 30 cellule vista qui, 16 express PV, 4 express SST e 10 express PV né SST. Immagine di bassa potenza (B) di una regione della neocorteccia del mouse contenente numerose, bene-differenziato Lhx6::GFP + cellule 30 giorni post-trapianto. Nota l'abbondanza di Lhx6::GFP + processi che scorrono in tutta la corteccia. Le cellule occasionale si trovano anche nell'ippocampo, dove appaiono di integrare ed elaborare processi coerenti con un fenotipo maturo. Barra della scala = 50 µm (A); 550 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: aspetto normale di strato dell'alimentatore dei fibroblasti embrionali di topo e cellule staminali indifferenziate. (A) mostrato qui sono 4 X e 10 immagini di campo chiaro ingrandimento X dimostrando l'aspetto tipico del nostro alimentatore embrionali del fibroblasto (MEF) del mouse strati 24 h dopo il placcaggio. (B) mostrato qui è l'aspetto tipico del nostro mouse cellule staminali embrionali (mESCs) 2 giorni dopo il placcaggio su alimentatori MEF. Si noti che le colonie hanno un perimetro luminoso e sono ellittica o ovoidale in apparenza. Se le colonie perdono questo perimetro luminoso o iniziano a inviare le proiezioni verso l'esterno, questi sono segni che le cellule possono differenziare. (C) mostrato qui sono mESCs 1 e 2 giorni dopo la ri-placcatura su piatti di gelatina rivestito al fine di diluire fuori alimentatori MEF prima dell'inizio di differenziazione. Nota che le cellule staminali espandere considerevolmente dopo 48 h su gelatina e cominciano a riacquistare un aspetto ovoidale con un perimetro luminoso. Barra della scala = 100 µm a 4x e 10 X foto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: comparsa di cellule staminali embrionali di topo nei giorni di differenziazione 1 a 7. (A), un giorno dopo galleggianti, le staminali cellule possono essere visto corpi embryoid piccoli formatura (EBs). Da due giorni la EBs sono cresciute notevolmente. Nota che alcuni EBs hanno attaccato insieme e formano più grandi ammassi di cellule. Non troviamo che questo impatti negativamente la differenziazione. Dopo 3 giorni, l'EBs sono cresciuti ancora più grande e alcuni non più trasmettere la luce attraverso di loro. È normale vedere detriti cellulari in background. (B) mostrato qui sono cellule staminali 24 h dopo l'atterraggio il giorno 4 di differenziazione (DD4). Nota la densità delle cellule. Molti hanno cominciato a estendere i processi di piccole dimensioni, che aumenteranno come la differenziazione continua. Si noti qui che le cellule sono anche colorate con piccoli punti neri sparsi. Se le cellule sono lucido od omogenee che appaiono, che è un segno di differenziazione aberrante. (C) di DD5, le cellule hanno continuato a proliferare e formare rosette neurale. Molte cellule hanno esteso i processi lunghi e sottili. (D) di DD7, le cellule dovrebbero essere confluenti. È normale vedere un modello di "Formaggio svizzero", in cui grandi, piatte, multinucleated le cellule (possibilmente ependymal o cellule gliali) creano isole circolari all'interno uno strato di progenitori neurali. Occasionalmente quando la densità delle cellule è più alta del normale, questo modello di "Formaggio svizzero" non non di sviluppo, come mostrato nell'immagine centrale. A seconda della differenziazione, questo potrebbe influire sulla induzione neurale. x 4 e 10 x indicare l'ingrandimento. Barra della scala = 100 µm a 4x e 10 X foto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: aspetto di differenziazione nei giorni 9 e 14. (A) cellule singole possono essere visualizzate un giorno dopo ri-placcatura. Nota il loro aspetto bipolare, che è tipico dei progenitori neurali. La cultura è omogenea con pochi altri tipi di cellule infiltranti. La densità è adatta per questa fase. (B) di DD11, le cellule sono cresciute in un monostrato. Simile a fasi precedenti nella differenziazione, grande cellule multi-nucleate "uovo-like" possono essere visto sparpagliati in tutto. (C) By DD13 che le cellule hanno continuato a proliferare. Possono ora essere visti formando piccoli tumuli. Molti "uovo-come" le cellule sono ancora presenti in tutto. Da questo punto in poi, la cultura mostrerà solo poche modifiche, fatta eccezione per i tumuli sempre più grande. 4 X, 10Xx, e 20 X indicare l'ingrandimento. Barra della scala = 100 µm nella 4 X 10 X foto scala bar e = 50 µm a 20 X foto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: comparsa di una differenziazione infruttuosa il giorno 4. DD4 è importante in termini di valutazione del successo di una differenziazione perché segue uno dei passaggi più difficili del protocollo: l'atterraggio su DD3. Da DD4, le cellule hanno avuto 24 h per recuperare dopo essere dissociato da corpi embryoid. Come si può vedere qui, la maggior parte delle cellule sono lucido e omogeneo che appaiono. Disseminati in tutto sono occasionali cellule che appaiono normali, avendo un aspetto più scuro con piccoli punti neri sparsi. Inoltre, grandi cellule piatte (come possono essere visto nel pannello di sinistra inferiore) sono indicative di differenziazione aberrante. Nel pannello destro inferiore, almeno tre piccoli gruppi di cellule (frecce gialle) appaiono come piccoli corpi embryoid, che indica di differenziamento difettoso, incompleto dissociazione di EB o scarsa aderenza alla superficie della piastra di coltura delle cellule. Queste immagini appaiono in contrasto con quelli mostrati in figura 7B, che raffigurano in sani, normali cellule su DD4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Mentre questo metodo è altamente efficace a patterning mESCs J1-derivato (SCRC-1010), abbiamo sperimentato successo variabile con altre linee di mescita e isolati clonali. Per esempio, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivato; Dergano et al. 13) rispondono male a questo protocollo e Foxg1 induzione da DD12 è tipicamente dell'ordine di 1-2%. Per motivi che non comprendiamo pienamente, clone di Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP un altro reporter dual (chiamato JQ59) che è stato isolato simultaneamente come la linea descritta in questo protocollo (chiamato JQ27), produce meno dell'1% cellule che esprimono NKX 2.1 quando coltivate in condizioni identiche. La linea di padre (J1; ATCC SCRC-1010), tuttavia, risponde bene al presente protocollo e produce le percentuali di cellule che esprimono NKX 2.1 su DD12 simili a quelli mostrati in Figura 1B. Se necessario, le concentrazioni di XAV-939 e SHH/SAG possono essere regolate per ottimizzare le condizioni di differenziazione sulla base di una riga. Tuttavia, la nostra esperienza nell'utilizzo di questo protocollo per differenziare altre linee mESC nei progenitori MGE-come è limitato.

Per quanto riguarda la nostra linea di mESC reporter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, non tutte le cellule NKX 2.1 + rapidi mCherry. Anche se quasi tutti i mCherry + cellule esprimono proteine NKX 2.1, espressione di reporter in ritardo rispetto l'espressione della proteina NKX 2.1, soprattutto durante le prime fasi della differenziazione (DD7-9). La frazione di NKX 2.1 + cellule che esprimono mCherry costantemente aumenta durante tutto il corso della differenziazione. A livelli di picco (~ DD12-14) mCherry è espresso in circa il 30% di tutti i NKX 2.1 esprimendo progenitori17. Inoltre, stesso cromosoma artificiale batterico utilizzato per espressione mCherry unità è stato utilizzato per guidare la Cre ricombinasi in domini NKX 2.1-espressione di topi transgenici24. In questi topi, Cre-espressione era debole all'interno delle cellule che esprimono NKX 2.1 della regione dorsale-la maggior parte di MGE e destino-mapping con questo mouse è sembrato sotto-etichetta SST-esprimendo CIns che sono noti per essere in gran parte generati da questa regione25, 26,27,28. Tuttavia, nonostante queste discrepanze, milioni di GFP o cellule che esprimono mCherry può essere isolate con solo poche ore di FACS.

Ci sono due vantaggi principali di questa tecnica. In primo luogo, quando combinato con la nostra linea di dual-reporter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, è possibile ottenere un numero elevato di precursori Interneurone arricchiti per diventare PV o SST-fated sottotipi Interneurone corticale. Il secondo vantaggio principale è la relativa facilità con cui un numero elevato di Interneurone fated possono essere ottenute cellule. Anche se esistono diverse altre tecniche EB modificate per differenziare i neuroni e progenitori MGE, questi protocolli si basano in genere sull'uso di molecole Wnt-inibitorio come Dkk113,14,29. Abbiamo trovato che l'inibitore di Wnt XAV-939 migliora notevolmente la generazione dei progenitori telencefalici pallidal, come evidenziato da Foxg1 e NKX 2.1 espressione15.

Come accennato in precedenza, esistono diversi altri metodi per la generazione dei progenitori MGE-come da mESCs. Watanabe et al. 14 pioniere il campo di differenziazione telencefalico da mESCs per essere il primo a sviluppare un metodo di coltura di sospensione serum-free seguito da ri-placcatura su una superficie aderente. Hanno trovato che gli antagonisti di Wnt e Nodal, Dkk1 e LeftyA, rispettivamente, in modo efficiente guidato mESCs in inizio neuroectodermal lignaggi13. Applicando SHH a queste culture, hanno osservato che tra 5-15% di tutte le cellule in cultura co-espressi NKX 2.1/Foxg1 e potrebbe essere considerati come progenitori MGE-come13. Tuttavia, pur ponendo le fondamenta per molti studi a venire, questo studio non ha avuto un modo per isolare progenitori MGE o arricchire per particolari sottotipi di CIn.

Diversi anni dopo, Dergano et al. 13 usato lo stesso metodo di coltura di sospensione serum-free in combinazione con la somministrazione temporizzata di vari fattori di crescita, in particolare SHH, raggiungere subregionale specifica dei tessuti telencefalici ventrale mESC-derivati. Utilizzando una linea di reporter di Foxg1::venus, hanno trovato che l'amministrazione SHH da DD3-12 dopo trattamento Dkk1 ha 45-68% di tutte le celle della cultura esprimendo il reporter Foxg1::venus13. All'interno della Foxg1::venus + popolazione, circa il 32% delle cellule espresso NKX 2.113. Sostituendo SHH per SAG e aggiungendo Fgf8, hanno ulteriormente rafforzato la frazione dei progenitori NKX 2.1 all'interno della popolazione Foxg1::venus + a circa 41%13. Quando vengono analizzati per destino, queste cellule prodotte circa 17% SST, PV di 21%, 18% NPY e 8% calretinina sottotipi13. Tuttavia, mentre questo studio ha descritto un metodo per specificare CGE contro CIn MGE-derivato destini, non ha descritto un metodo per arricchire in modo selettivo per sottotipi PV o SST.

L'anno seguente, Cambray et al. 11 usato un metodo privo di siero monostrato con ri-placcatura su DD5 per studiare l'effetto di activina sulla differenziazione e identità dei precursori neurali telencefalici derivato dal mouse e CES umane. Anche se questo studio non ha segnalato la percentuale delle cellule NKX 2.1 generata in loro protocollo, essi riferiscono che circa il 54% delle cellule in cultura co-espressi Nestin/Foxg1 su DD2 (5 giorni di crescita nel siero supporti liberi seguiti da un ulteriore 2 giorni di cultura Dopo aver ri-placcatura)11. Essi hanno inoltre riferito che con l'aggiunta di activina, ~ 55% delle cellule co-espressi nestina e CouptfII, che indica che queste cellule possono rappresentare caudale gangliare Eminenza-come le cellule, che producono la maggior parte degli interneuroni corticali che esprimono calretinina 11. infatti, da 8 giorni nella cultura (13 giorni complessivi) 39% delle cellule sono stati trovati per co-esprimere calretinina/BIII-tubulina, mentre il 59% delle cellule sono stati trovati per co-esprimere GABA/BIII-tubulina11. Questo studio non ha esaminato la produzione dei sottotipi PV o SST.

Ancora una volta usando un metodo modificato di EB, Chen et al. 12 hanno dimostrato che enhancer MGE specifici elementi potrebbero essere utilizzati per seguire e purificare le cellule staminali derivate MGE-come le cellule12. In questo studio, hanno confrontato l'effetto di differenti condizioni di coltura durante differenziazioni diretti delle mESCs nei progenitori MGE-come utilizzo di una linea di reporter di Lhx6::GFP; la stessa linea che ha servito come la linea del padre per la linea di dual-reporter Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP descritta in questo manoscritto. Hanno mostrato che con l'aggiunta di Dkk1 alla cultura condizioni da DD0-3, seguita dalla aggiunta di SAG, flusso di ~ 10% di tutte le cellule in cultura espresso Lhx6::GFP12. Inoltre hanno trovato che lo stesso protocollo, applicato alla linea Foxg1::venus descritta da Dergano et al. 12, ha provocato circa il 37% di tutte le cellule che esprimono il reporter Foxg1::venus. Quando le cellule Lhx6::GFP sono stati trapiantati in vivo, le seguenti percentuali medie di marcatori di sottotipo di CIn è stata osservata: 22% PV, SST 58% e 16% NPY12.

Più recentemente, altri gruppi hanno utilizzato l'espressione forzata di fattori di trascrizione lineage-definizione di specificare direttamente CIns. Forse la prima dimostrazione di questo è stato di Petros et al. 10 , che ha usato un promotore inducibile doxiciclina per guidare NKX 2.1 espressione in mESCs Ainv15 che sono stati modificati per contenere un cromosoma artificiale batterico Lhx6::GFP. Questo studio ha usato condizioni di coltura simili a quelli descritti nel manoscritto corrente ma senza l'aggiunta di XAV-93910. Tuttavia, per ragioni che sono poco conosciute, una minore percentuale di cellule Lhx6::GFP + sono stati osservati sotto le stesse condizioni di differenziazione rispetto a quando si utilizza la riga di padre J1 Lhx6::GFP descritta in questo manoscritto10. Malgrado il raggiungimento di livelli simili di Foxg1 espressione (totale % sconosciuto), c'era una moderata riduzione del numero totale di NKX 2.1 cellule con n maggiore di 2% di tutte le cellule che esprimono il reporter Lhx6::GFP10. Questo studio evidenzia le differenze intrinseche che esiste tra varie linee di ESC e le sfide che devono affrontare i ricercatori quando si tenta di applicare protocolli di differenziazione a ESC linee diverse da quelle che sono state usate per sviluppare originariamente i protocolli.

Utilizzando un approccio elegante, Au et al. 9 utilizzata l'espressione forzata sequenza dei fattori di trascrizione per generare specifici sottotipi di interneuroni corticali utilizzando lo stesso paradigma di differenziazione telencefalico ventrale sviluppato da Watanabe et al. 14 mentre non riportano le percentuali esatte di Foxg1 +, NKX 2.1 + e Olig2 + precursori prodotti nella cultura, essi affermano che circa il 50% di tutte le cellule in coltura differenziate di neuroni GABAergici9. Alla post-differenziazione 11 giorni, EBs erano dissociate e trapiantato in host embrioni MGE di E13.59. Una piccola percentuale di questi (meno dell'1%) migrato da MGE nella corteccia, dove sono stati identificati da loro reporter Dlx5/6-eGFP e analizzati per destino9. Gli autori hanno osservato una varietà delle percentuali di PV, SST e CGE-come destini basati la loro strategia di induzione forzata selezionate9. È interessante notare che, con l'espressione del fattore di trascrizione Lmo3, essi hanno osservato in media circa 57% PV, SST 21% e 15% CGE-derivato sottotipi (SST- / reelin + o VIP-unica +)9. La più grande percentuale dei sottotipi di SST osservata è stata ottenuta utilizzando una linea di NKX 2.1/Dlx2 GOF, che ha prodotto circa 32% SST, PV 35% e 25% sottotipi CGE-derivato9.

Nel 2015, Colasante et al. 30 ha mostrato che l'espressione forzata di cinque fattori di trascrizione (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 e Lhx6) all'interno di fibroblasti da topi reporter GAD67-GFP convertito 15% di tutte le celle in simil-GABAergici CIns. Notevolmente, circa il 90% di queste cellule ha continuato a esprimere PV, con solo rare cellule esprimendo SST30. Anche se questo metodo non è stato applicato a mESCs, è stato usato con iPSCs umane, dove è stato stimato che circa il 30% di tutte le cellule adottato un' identità di GABAergic30.

Come illustrato nella Figura 2, ci sono diversi modi per generare arricchiti popolazioni di PV o SST CIns. I principali vantaggi del PV-protocollo che utilizza aPKCi tramite il protocollo di DD17 sono il maggior numero di cellule uno può isolare, vitalità e durata della coltura delle cellule. Anche se noi non mostrano dati per i livelli di induzione di DD17 nella Figura 1, ci sono circa due volte altretante cellule mCherry + presso DD11 come ci sono a DD17 (dati non mostrati). Quando si raccolgono le cellule per trapianto, troviamo che un numero maggiore di a partire di cellule (Vedi sotto) è vantaggioso, dal momento che circa il 30-50% delle cellule sono persa nel processo di concentrarle per iniezione. Inoltre, un numero maggiore di cellule possa essere ottenuto con tempi più brevi di FACS, che limita la quantità di tempo in cui le cellule sono sul ghiaccio e abbassa il costo complessivo. Probabilmente perché una percentuale maggiore di ciliegio + le cellule sono progenitori, cellule dalle precedenti fasi della cultura (per esempio, DD11) presentano una maggiore sopravvivenza rispetto a cellule DD17 dopo trapianto nella neocorteccia neonatale. Quando un numero elevato di cellule vitali è necessari, ad esempio nel caso di trapianto di cellule per trattare l'epilessia, avendo una più grande popolazione di partenza e la maggiore redditività è un grande vantaggio.

Come raffigurato in Figura 2, a seconda del protocollo, circa il 25-39% delle cellule di Lhx6::GFP + analizzati 30 giorni post-trapianto non esprimono livelli rilevabili di proteina PV o SST con immunohistochemistry sistematico. Generalmente, questi PV- / SST-cellule esprimono GABA come pure Sox6, un marker di interneuroni corticali MGE-derivati (Vedi Tyson et al. 15, Tischfield et al. 17). meno dell'1% di PV- / SST - Lhx6::GFP + cellule esprimere marcatori di altri sottogruppi Interneurone, quali calretinina, reelin o neuropeptide Y (dati non mostrati). Questo è simile agli studi di mappatura in vivo destino che hanno dimostrato che tra ~ 15-25% di interneuroni MGE-derivato non esprimono PV o SST23,25,31. Quando le cellule Nkx2.1::mCherry+ o Lhx6::GFP + sono isolate e piastrate su alimentatori corticali del ratto in vitro, abbiamo trovato che ~ 40-70% delle cellule Lhx6::GFP + analizzati dopo 28 giorni nella cultura sono PV-/ SST-, con una maggioranza di coloro che macchia positiva esprimendo la SST. Questo aumento di PV- / SST-cellule possono essere dovuto l'assenza di un segnale maturational estrinseco che è presente in vivo, come soprattutto può essere il caso per espressione matura di PV, o ingresso suboptimale elettrofisiologico da cellule di alimentatore. Qualunque sia il motivo, noi preferiamo di trapiantare cellule in neocortex neonatale per differenziazione di analisi anziché in vitro di destino.

Per la maggior parte degli esperimenti di trapianto, si consiglia di galleggiamento su DD0 un minimo di due piastre di coltura di tessuto di 10 cm non aderente ogni contenente 7,5 x 105 mESCs in 10 mL di N2/KSR (7,5 x 104 cellule/mL; volume totale di 20 mL). Insieme, entrambe le piastre produrrà in genere 8-12 x 106 cellule dopo dissociazione EB il DD3, di cui 5,4 x 106 cellule possono essere utilizzate per due piastre di coltura del tessuto 6 pozzetti trattato (50.000 cellule/cm2; circa 110 cm2 totale) del seme. Da DD8, ogni piastra a 6 pozzetti produce circa 5-7 x 107 cellule, che quindi possono essere utilizzate per inizializzare un ulteriore tre a cinque piastre 6 pozzetti ad una densità di 250.000 cellule/cm2 (che richiedono un totale di 4,05 x 107 cellule nel caso di tre 6-pozzetti lastre o 6.75 x 107 cellule nel caso di cinque piastre da 6 pozzetti). Da DD14, ogni piastra a 6 pozzetti in genere resa di 1-2,5 x 106 mCherry o cellule che esprimono GFP. A seconda delle esigenze dell'esperimento, abbiamo abbiamo sguazzato un minimo di 7,5 x 105 mESCs per analisi immunoistochimica su piccola scala per verso l'alto di 6 x 106 mESCs per progetti di grandi dimensioni trapianto.

Le fasi più critiche del protocollo sono mantenere il mESCs in uno stato di pluripotent prima differenziazione di inizio e il passo di atterraggio/dissociazione DD3. Se le cellule sono state mantenute correttamente e l'atterraggio/dissociazione il DD3 è fatto con cura, la differenziazione di solito avrà esito positivo. Solo cellule staminali che appaiono sani e deve essere utilizzate per la differenziazione. Se EBs non riescono a formare tra DD0-3 o formare multipli, corpi piccoli, asimmetrici, la differenziazione è probabile non riuscire. Inoltre, durante la dissociazione EB il DD3, l'EB deve essere attentamente monitorato fino a quando non è più visibile dall'occhio per evitare l'esposizione prolungata alla reggente non-tripsina contenente cellule-dissociazione.

I risultati presentati in questo documento sono stati ottenuti in condizioni ottimizzate utilizzando reagenti di qualità controllata. Questo è importante nota poiché abbiamo occasionalmente difficoltà a raggiungere robusto NKX 2.1 induzione e per estensione, mCherry ed espressione reporter GFP. Basandoci sulla nostra esperienza, riteniamo tale variabilità di lotto--lotto dei conti più probabile FBS per questi cambiamenti. Come tale, è saggio testare diversi lotti di FBS per determinare che funzionano meglio per mantenere mESCs. Anche se non abbiamo usato il sistema 2i/LIF (medium senza siero contenente l'inibitore PD03259010 e GSK-3 α/β inibitore di MEK CHIR99021), è possibile che condizioni mESC privo di siero possono produrre risultati più coerenti. Abbiamo non, provato tuttavia, questa ipotesi e non ha dati per quanto riguarda se l'uso dei media privo di siero mESC colpisce la differenziazione delle mESCs in MGE-come progenitori. Inoltre, assicurarsi di utilizzare fattori di crescita freschi quando possibile di aliquotare per uso singola. A seconda dell'utente, potrebbe essere necessario essere aumentato per ottenere la sopravvivenza delle cellule adeguate, soprattutto durante la fase di atterraggio il DD3 densità delle cellule.

Interneuroni hanno la notevole capacità di sopravvivere, migrare e integrare nel post-trapianto host-circuiti. Come tale, questo protocollo può essere usato per trapiantare precursori Interneurone in modelli murini epilettici e altri modelli di malattie neurologiche e neuropsichiatriche (Vedi Southwell et al. 32 e Tyson e Anderson33 valutazioni della cella Interneurone ha basato le terapie). Ad esempio, in un recente studio Donegan et al. 34 arricchito popolazioni di PV e SST CIns per trapianto in un modello murino di schizofrenia. Hanno trovato che PV e SST arricchito trapianti prodotti diversi effetti sul comportamento del mouse, con popolazioni di PV arricchita normalizzando l'endofenotipi di schizofrenia che studiavano.

Negli ultimi anni, è stato utilizzato il sistema del transposon PiggyBac raggiungere stabile espressione dei transgeni in un certo numero di sistemi. Abbiamo usato questo sistema per creare rapidamente e facilmente che esprimono stabilmente doxiciclina-inducible miRNA costrutti per studiare il ruolo di particolari geni durante lo sviluppo Interneurone. Siamo anche utilizzando questa tecnologia per creare dual reporter mESC linee che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) a optogenetically unità mESC derivato interneuroni o tecnologia del recettore DREADD per attivare o disattivare trapiantato cellule in massa.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati a Qing Xu per sviluppare il Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual reporter mESC linea così come Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros per i loro primi lavori su aiutando a sviluppare questo protocollo. Ringraziamo anche il nucleo di cytometry di flusso CHOP per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da un NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

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References

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Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

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