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Neuroscience

小鼠胚胎干细胞向皮质 Interneuron 前体细胞的分化

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

本议定书描述了一种方法, 产生皮层 interneuron 祖细胞和后有丝分裂 interneuron 前体从小鼠胚胎干细胞使用改良的胚体-单层法。这些祖/前体可用于体外或荧光分类和移植到新生儿大脑皮层研究命运确定, 或用于治疗应用。

Abstract

gaba 皮质神经元是一种异构的细胞群体, 在调节兴奋性锥体神经元的输出以及同步锥体神经元集合的输出方面起着关键作用。interneuron 功能的缺陷已经牵连到各种神经精神疾病, 包括精神分裂症, 自闭症和癫痫。从胚胎干细胞衍生的皮质神经元不仅允许研究其发展和功能, 但提供了深入的分子机制的基础上, 皮层 interneuron 相关疾病的发病机理。神经元也有非凡的能力, 生存, 迁移, 并集成到宿主皮质电路后移植, 使他们成为理想的候选细胞的治疗方法。在这里, 我们提出了一个可伸缩, 高效, 改良的胚体的单层方法, 以 Nkx2.1 表达 interneuron 祖细胞和他们的后代从小鼠胚胎干细胞 (mESCs)。使用 Nkx2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP 双报告制线、Nkx2.1 祖细胞或其 Lhx6-expressing 后有丝分裂后代, 可通过荧光活化单元分类 (资产管制系统) 隔离, 随后用于许多下游应用。我们还为发育 (PV) 或生长抑素 (SST) interneuron 亚群提供了丰富的方法, 这可能有助于研究命运的确定, 或用于治疗应用, 将受益于 interneuron 亚组丰富移植.

Introduction

在两个小鼠和人类中, 大约一半的皮质抑制神经元 (CIns) 起源于一个短暂的皮层下结构, 称为内侧节隆起 (MGE), 上皮祖和其他神经元和神经胶质子组表示转录因子 Nkx2.11,2。通过相交形态学、神经、电生理学和连通性特征3,4来定义这些子类型。MGE 衍生的 CIns 可以分为大多数非重叠子群的基础上, 其表达的 PV 或 SST, 其表达与特定的电生理和连接倾向5。神经元, 特别是 PV 亚群的功能障碍, 已牵连多神经精神疾病和疾病6,7。该方法的总目标是产生干细胞衍生的有丝分裂祖细胞和迁移前体, 丰富的 PV 或 SST 的命运, 研究皮质 interneuron 生物学和用于细胞基础治疗。

我们已经开发了一个可伸缩的, 高效的方法来推导 Nkx2.1 表达 interneuron 祖及其后代从 mESCs。使用 Nkx2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP 双报告制线8, Nkx2.1 祖细胞或其 Lhx6-expressing 后有丝分裂后代可通过外地资产管制系统隔离, 随后用于若干下游应用。通过操纵一些信号通路、培养时间和神经再生模式, 我们可以获得数百万个荧光标记的 interneuron 前体, 适合于下游应用的宿主。

虽然存在一些其他方法来生成 MGE 样的祖 mESCs9,10,11,12,13,14, 我们的方法, 这依赖于 Wnt拮抗剂 XAV-939, 是特别有效的产生 Foxg1/Nkx2.1 co 表达 telencephalic 祖细胞。此外, 通过我们的双报告系统选择 interneuron 祖细胞或其后有丝分裂 Lhx6-expressing 后代的能力, 极大地提高了产生不同祖和后代的能力。

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Protocol

注: 本协议中描述的双记者制线可根据要求提供 (sande@mail.med.upenn.edu sande@mail 大学)。

1. 媒体准备

注意: 在细胞培养使用前, 请将所有介质预热到37° c。

  1. 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 培养基 (准备500毫升)
    1. 添加50毫升胎牛血清 (FBS) 到449毫升 Dulbecco 氏改良鹰的培养基 (DMEM), 并通过500毫升0.22 µm 孔过滤器过滤器。
    2. 在过滤后加入1毫升抗菌剂 (50 毫克/毫升)。存储在4° c 1 月或分的媒体和存储在≤-20 ° c。
  2. N2 介质 (用于准备500毫升)
    1. 添加5毫升 l-丙氨酸-l-谷氨酰胺 (100x) 和500µL 2-基 (55 mM) 至489.5 毫升 DMEM: 营养混合物 F-12 (DMEM/F-12), 并通过500毫升0.22 µm 孔过滤器过滤器。
    2. 在过滤后加入1毫升抗菌剂 (50 毫克/毫升) 和5毫升 N2 补充物。将介质存储在4° c 的黑暗中长达1月。
  3. 无血清生长培养基 (KSR) (用于制备500毫升)
    1. 添加75毫升无血清培养基补充剂, 5 毫升 l-谷氨酰胺 (100x), 5 毫升记忆非必需氨基酸 (NEAA) (100x), 和500µL 2-基 (55 毫米) 到413.5 毫升非谷氨酰胺含有 DMEM, 并通过500毫升0.22 µm 孔过滤器单位过滤。
    2. 在过滤后加入1毫升抗菌剂 (50 毫克/毫升)。将介质存储在4° c, 最多可达1月。
  4. 小鼠胚胎干细胞培养基 (用于制备500毫升)
    1. 添加75毫升干细胞级 FBS, 5 毫升记忆 NEAA (100x), 5 毫升 l-谷氨酰胺 (100x), 500 µL 2-基 (55 毫米) 至413.5 毫升非谷氨酰胺含有 DMEM, 并通过500毫升0.22 µm 孔过滤器单位过滤。
    2. 在过滤后加入1毫升抗菌剂 (50 毫克/毫升)。存储在4° c 在黑暗中的媒体长达1月或分和存储在≤-20 ° c。

2. 培养 mESCs

  1. 分裂将 mef 介质中的不活泼的 mef 馈电单元放到组织培养处理的板上 3-4 x 104单元格/cm2。允许至少12小时, 让他们在37° c 与≥95% 相对湿度和 5% CO2前的细胞培养孵化器中沉淀 mESCs。如果不立即使用, 请每3天更换一次 MEF 介质。在电镀后7天内不使用 MEFs 处理。
  2. 在含有小鼠白血病抑制因子 (mLIF) (1000 U/毫升) 的制介质中添加 mESCs (密度范围从 1-4 x 104单元格/cm2) 到 MEF 板。孵育的细胞在37° c 与≥95% 相对湿度和 5% CO2。
  3. mESCs 使用胰蛋白酶-EDTA (0.05% 胰蛋白酶) (1:5-1:10) 一旦菜变成 ~ 70-80% 汇合或如果殖民地开始接触。这通常发生每2天, 但可能需要多达4或5天取决于初始电镀密度。
  4. 保持 mESCs 在制介质中的 MEF 馈线层上保持多。
  5. 在开始分化前, 将细胞至少一次涂在明胶涂层板上, 而不 MEFs 稀释 MEFs。
    1. 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中加入0.1% 明胶, 用钙2 +/毫克2 +对组织培养处理皿, 在37° c 下至少1小时, 制备明胶涂层板. 板 1.5-2 x 106 cells/10 cm 板 (2.7-3.6 x 104单元格/cm2), 并允许单元格在开始分化前2天展开。

3. 区分 mESCs 向 MGE 样 Telencephalic 祖

  1. 分化日 (DD) 0 = "浮细胞"
    1. mESCs 在明胶涂层板上生长2天后, 在没有 Ca2 +/Mg2 +的情况下, 用 PBS 吸吸介质并冲洗一次细胞。添加足够的胰蛋白酶-edta (0.05% 胰蛋白酶) 覆盖板的表面 (通常4毫升胰蛋白酶-edta 为一个 10 cm 组织培养皿), 并把细胞回到孵化器在37° c 与≥相对湿度和 5% CO2 4 分钟。
    2. 4分钟后, 用2倍于制介质的体积来淬火胰蛋白酶-EDTA。将电池转移到适当大小的离心管上, 并将细胞在 200 x g 处离心5分钟。5分钟后, 取出导管, 吸出介质而不干扰颗粒。重1毫升 KSR:N2 介质 (1:1) 中含有 BMP 抑制剂 LDN-193189 (250 nM) 和 Wnt 抑制剂 XAV-939 (10 µM) 的颗粒。
    3. 使用例或自动电池计数器测量细胞浓度。在非附着的组织培养皿中, 在含有 LDN-193189 (250 nM) 和 XAV-939 (10 µM) 的 KSR:N2 培养基 (1:1) 中加入7.5万细胞/毫升, 以作为胚状体 (EBs) 开始生长细胞。孵育的细胞在37° c 与≥95% 相对湿度和 5% CO2。
  2. 在 DD1, 用多聚 l-赖氨酸 (10 µg/毫升) 在 PBS 中处理的细胞 "着陆", 在37° c (2 +/毫克2 +) 上过夜 (O/N), 以≥95% 相对湿度或至少 1 h。
  3. 在 DD2 上, 吸出多聚 l-赖氨酸, 并在 PBS 中涂上层粘连蛋白 (10 µg/毫升, Ca2 +/毫克2 +) O/N 在37° c 时具有≥95% 相对湿度。
    注意: 虽然 O/N 是最优的, 但仅有2小时就足够了。如果第二天没有使用板, 抽吸层粘连蛋白, 在没有 Ca2 +/Mg2 +的情况下更换 PBS, 并在4° c 存储2周。
  4. DD3 ("土地细胞")
    1. 在开始 EB 离解之前, 吸取层粘连蛋白, 并让板块完全干燥在一个组织培养罩。不要使用看起来有光泽或明显潮湿的盘子。将 ebs 与介质传输到15毫升的管中, 并将其离心3-4 分钟, 在 15 x g 或 ebs 有颗粒状。
  5. 吸气培养基, 并加入3毫升的细胞剥离液含有 dnasei (2 U/毫升) 和孵化在37° c 与≥95% 相对湿度和 5% CO2为15分钟. 轻轻地弹管每3分钟, 以协助 EB 离解。
  6. 一旦 EBs 不再可见或15分钟已经过去了, 添加6毫升 KSR:N2 (1:1) 包含 dnasei (1 U/毫升) 和离心机为5分钟 200 x g。
  7. 将 KSR:N2 (1:1) 中含有 LDN-193189 (250 nM)、XAV-939 (10 µM) 和岩石抑制剂 Y-27632 (10 µM) 的细胞在 4.5-5 x 104单元格/cm2中板化。

4. SST 丰富的议定书: "DD12 GFP 高声波刺猬 (嘘)" (继续从步骤 3.7)

  1. 在 DD5 上, 改变媒体与 KSR:N2 (1:1) 包含 FGF-2 (10 ng/毫升), IGF-1 (20 ng/毫升), 和 SSH (50 ng/毫升)。
  2. 使用步骤 3.2-3.3 中概述的说明, 准备8天 (步骤 4.4) 重新电镀组织培养皿。
  3. 在 DD7 上, 改变媒体与 KSR:N2 (1:1) 含有 FGF-2 (10 ng/毫升), IGF-1 (20 ng/毫升), 和嘘 (50 ng/毫升)。
  4. 在 DD8 上, 重新板细胞。
    注意: 虽然这一步是不必要的, 重新电镀的细胞可以减少早期区分, 不需要的细胞类型。再电镀也会分解细胞的球, 使得下游的免疫组化分析变得困难, 并在以后的时间点提高了外地资产管制中心的效率。
    1. 重新板细胞, 分离细胞从板与胰蛋白酶-EDTA (0.05% 胰蛋白酶) 为 5 min 在37° c 以≥相对湿度和 5% CO2。用2倍于 KSR:N2 的体积将胰蛋白酶-EDTA 淬火, 并在 200 x g 上离心5分钟. 通过40µm 滤筒过滤细胞, 去除任何块状。在含有 FGF-2 (10 ng/毫升)、IGF-1 (20 ng/毫升) 和 Y-27632 (10 µM) 和嘘 (50 ng/毫升) 的 N2/KSR (1:1) 中重新将细胞在25万细胞/cm2 。
      注意: 如果相反, 决定不重新板块的细胞在 DD8, 改变媒体与 KSR:N2 包含嘘 (50 ng/毫升) 每2天从 DD7 到 DD12, 并继续添加 IGF-1 (20 ng/毫升) 和 FGF-2 (10 ng/毫升), 直到 DD9。
  5. 在 DD10 上, 改变媒体与 KSR:N2 包含嘘 (50 ng/毫升)。
  6. 在 DD12 上, 要获得富含 SST 亚型的细胞, 请使用外地资产管制室来隔离 Lhx6::GFP-only 表达细胞。
    1. 要分离细胞, 使用非胰蛋白酶含有细胞离解试剂, 而不是胰蛋白酶-EDTA。使用 PBS 清洗细胞一次, 不需要 Ca2 +/Mg2 +。在细胞中加入含有 dnasei (2 U/毫升) 的前温热的非胰蛋白酶含有细胞离解试剂。将它们放在37° c 的恒温箱中, ≥相对湿度和 5% CO2用于10-30 分钟或直到细胞分离。每隔5分钟轻轻拍打盘子, 以助解离。
      注: 对于 DD11-12 文化, 只有10-15 分钟可能是必要的。对于 DD15-16 文化, 30 分钟或以上可能需要完全离解。
    2. 一旦细胞完全解除了板块, 继续使用标准的协议或使用其他下游分析中的单元格隔离。

5. 光伏富集协议: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (从步骤3.7 延续)

  1. 在 DD5 上, 改变 KSR:N2 (1:1) 含有 FGF-2 (10 ng/毫升) 和 IGF-1 (20 ng/毫升) 的介质。
  2. 使用步骤 3.2-3.3 中概述的说明, 准备 DD8 (步骤 4.4) 的组织培养板进行重新电镀。
  3. 在 DD7 上, 改变 KSR:N2 (1:1) 含有 FGF-2 (10 ng/毫升) 和 IGF-1 (20 ng/毫升) 的介质。
  4. 在 DD8 上, 将步骤4.4 中所述的单元格重新装入, 但有以下例外情况: 当重新电镀细胞时, 用快速激动剂 (凹陷; 30 nM) 和添加不典型 PKC 抑制剂 (aPKCi; 2 µM) 来代替嘘。两者合计, 再电镀介质现在 N2/KSR (1:1) 含有 FGF-2 (10 ng/毫升), IGF-1 (20 ng/毫升), Y-27632 (10 µM), 凹陷 (30 nM), 和 aPKCi (2 µM)。
  5. 在 DD10 上, 用含有 aPKCi (2 µM) 的 KSR:N2 改变介质。
  6. DD11
    注: 在这一点上, Nkx2.1:: mCherry + 细胞富集成为光伏 CIns。
    1. 使用步骤4.6 中概述的相同协议将单元格从盘中分离出来。如果作出决定收集 Nkx2.1:: mCherry + 细胞在以后的分化日, 无视这一步。
  7. 在 DD12 上, 用含有 aPKCi (2 µM) 的 KSR:N2 改变介质。在 DD14 上, 用含有 aPKCi (2 µM) 的 KSR:N2 改变介质。在 DD16 上, 用含有 aPKCi (2 µM) 的 KSR:N2 改变介质。在 DD17 上, 收集 Nkx2.1:: mCherry + 使用步骤4.6 中概述的相同协议的单元格。

6. 光伏富集协议: "DD17 mCherry 低嘘" (从步骤3.7 延续)

  1. 在 DD5 上, 改变 KSR:N2 (1:1) 含有 FGF-2 (10 ng/毫升) 和 IGF-1 (20 ng/毫升) 的介质。在 DD7 上, 改变 KSR:N2 (1:1) 含有 FGF-2 (10 ng/毫升) 和 IGF-1 (20 ng/毫升) 的介质。
  2. 在 DD9 上, 使用 KSR:N2 (1:1) 更改介质。从这一点开始, 不需要额外的增长因素。
    1. 继续每2天更改一次媒体, 直到在 DD17 上捕获细胞。

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Representative Results

本文所描述的协议是我们已发布协议的修改版本15,16,17 , 并已针对我们的 Nkx2.1 进行了优化:: mCherry: Lhx6:: GFP 双报告制线。通过添加 Wnt 抑制剂 XAV-939 从 DD0-5, 结合重新电镀在 DD8, 我们实现了鲁棒 Nkx2.1 诱导, 其中50% 以上的 DAPI + 核在文化中也 Nkx2.1 表达 (图 1A, B)。免疫组化为 mCherry 和 GFP 的记者显示清晰的表达在区域内的 Nkx2.1 阳性反应 (图 1A)。使用本机记者的活细胞的资产管制署表明, 四的细胞群可以清楚地隔离: (1) gfp/mCherry 双阴性细胞, (2) mCherry 只表达细胞, (3) gfp 仅表达细胞, (4) gfp/mCherry 双表达细胞 (图 1C)。使用这条线, 一小部分的祖开始打开 mCherry 记者围绕 DD8-9。mCherry 水平峰值之间的 DD12-13, 然后稳步下降, 因为祖细胞退出周期和产生后有丝分裂 Lhx6::GFP+ interneuron 前体 (图 1D)。相应地, Lhx6::GFP 记者在 DD13-14 (图 1D) 周围的 DD9-10 和峰值之间打开。虽然 Lhx6::GFP 细胞的总数量在文化中继续增加, 但百分比不, 可能是由于其他血统的增殖。一旦 Lhx6::GFP+ 记者表示, 它仍然可探测无限期, 因为 Lhx6 是稳定的表达在成熟的 MGE 皮层神经元18,19。虽然 Nkx2.1 和 Lhx6 的表达在小鼠前脑内基本上是不重叠的, 但 Nkx2.1 有一个短暂的种群: mCherry 和 Lhx6::GFP 在文化中的共同表达细胞。这至少在一定程度上是由于 perdurance 的 mCherry 记者超出了正常的 Nkx2.1 表达的时间范围, 因为大多数的双标记细胞不表达 Nkx2.1 蛋白的检测水平 (泰森和安德森, 未发表)。细胞继续表达的 Lhx6 记者和樱桃/Nkx2.1 蛋白可能是纹神经元20。然而, 根据我们的活体成像研究, 有一个约18小时的窗口, 其中同步, 新的后有丝分裂前体表达 Nkx2.1:: mCherry 和 Lhx6::GFP 可以隔离 (Tischfield 和安德森, 未发布, 并看到 Tischfield et al.17). 因此, 通过收集 Nkx2.1:: mCherry 和 Lhx6::GFP 双阳性细胞在协议的任何时候, 有可能获得的细胞群, 在大约18小时内主要退出细胞周期。这与 Nkx2.1 的对比:: mCherry 和 Lhx6::GFP-only 表达细胞, 分别代表不同类型的祖和前体, 不同的生日。

Nkx2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP 双制线可用于丰富海温-注定的神经元。一般来说, 添加嘘到文化和收集 GFP + 细胞在早期的时间点的差异 (例如, DD12) 丰富的 SST 亚型。根据我们的观察, 我们没有看到 SST 的显著差异: PV 比率取决于是否在 DD5 或 DD8 (未显示数据) 中添加了嘘。通过添加嘘 (50 ng/毫升) 从 DD8-12, 然后移植的 GFP 只表达细胞, 我们得到平均7:1 的比例 SST: PV CIns (图 2A)15,17。关于在文化中的嘘和时间对 interneuron 命运的影响使用我们的双记者制线, 请参阅泰森et al.15

为了丰富 PV 的 CIns, 应该从文化媒体中略去。注意, 与嘘信号的要求保持 Nkx2.1 表达在有丝分裂祖细胞21, 嘘信号存在于这些文化没有外在嘘被增加, 因为嘘信号拮抗剂杷消除Nkx2.1 表达式15。然而, 如果细胞被重新镀在 DD8, 这内生嘘被去除, 因此凹陷 (30 毫微米) 应该增加到媒介从 DD8-10 维护 Nkx2.1 表示和生产 CIns。我们以前的研究表明, 通过扣留嘘从文化条件和排序为 Nkx2.1:: mCherry + 细胞在 DD17, a ~ 2.6: 1 PV 的比率: 海温细胞可以获得 (图 2B)15。与海温亚型相比, 在早期和外源性嘘的情况下丰富, 文化的持续时间增加和缺乏外源嘘丰富的 PV 亚型15。在最近的一项研究中, 我们发现 aPKCi 应用于我们的 "MGE" 协议显著增加了 Nkx2.1 的分数: mCherry 表达细胞周期素 D217, 一个中间前体细胞的标记22。这个协议的变化是基于我们的发现, PV 表达 CIns 主要来源于中间祖, 而 SST 祖的起源主要来自径向祖细胞在心室表面23。我们发现, 当分类和移植到新生的小鼠大脑皮层时, 这些祖细胞对产生 PV 亚型有很大的偏见。通过添加 aPKCi 从 DD8-11, 然后排序 Nkx2.1:: mCherry 细胞, 我们能够获得 5.8: 1 PV 的比率: SST 亚型 (图 2C)17。为了进一步丰富光伏亚型, 我们还分离了 Nkx2.1:: mCherry 细胞生长在 aPCKi 从 DD8-17 的存在。然而, 我们没有实现 pv 的增加: SST 比我们能够获得在 DD11, 尽管在光伏亚型生成的百分比的边际增加 (图 2D)。每个协议的流程图都包含在图 3中。免疫鼠脑30天后移植与抗 pv, 抗海温, 抗 GFP (以增强 Lhx6::GFP+ 细胞的鉴定) 抗体表明, Lhx6::GFP+ 细胞表现出成熟的形态特征与 pv 和 sst 表达模式类似于它们的在体内对应 (图 4和图 5)。

为了帮助确定是否成功, 我们在协议的每个阶段都准备了一系列图像, 以显示正常的可变性 (图 6, 图 7, 图 8)。我们还包括一个图, 演示如何在 DD4 上出现不成功的差异 (图 9)。一般来说, 不成功的分化将产生低的水平 (少于 10%) 的 Nkx2.1 表达和百分比的 Nkx2.1:: mCherry 和 Lhx6::GFP 诱导约1% 或更少。

Figure 1
图 1: Nkx2.1 的生成: mCherry 和 Lhx6::GFP interneuron 前体.(A) 这里显示的是免疫的代表性图像, Nkx2.1, Nkx2.1:: mCherry (RFP) 和 Lhx6::GFP (GFP) 从分化日 12 (DD12) 文化。请注意, 这些图像是来自同一视图字段的重叠通道。(B) 定量的 DAPI + 核的平均百分比, 表达 Nkx2.1 在 DD12 的文化 (n = 3 独立的差异)。(C) 代表性的外地资产管制计划, 展示四不同的细胞群, 可以使用我们的双重记者制线隔离。注意, mCherry 在 x 轴上, GFP 位于 y 轴上。因此, 右上框表示 mCherry/GFP-双阳性的单元格。(D) Nkx2.1 的时间过程:: mCherry 和 Lhx6::GFP 诱导 DD6-16 表达为在文化中的细胞百分比, 要么是 mCherry 表达, 要么是 gfp 表达, 要么是 mCherry/gfp 联合表达。这些百分比是从在海温丰富的协议中, 在嘘的存在下生长的细胞获得的, 并且代表了3独立差异的平均值。(B) 和 (D) 中的误差线代表 SEM. 刻度栏 = 150 µm (A)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 培养条件的操作差异丰富了 PV 与 SST-注定制的皮质神经元.(A) pv +、sst + 和 pv/sst-神经元获得的百分比当 DD12, GFP-仅表达细胞的存在嘘 (50 ng/毫升) 从 DD5-12 移植到新生儿大脑皮层和分析30天后移植。(B) pv +、sst + 和 pv/sst-神经元获得的百分比当 DD17, mCherry 只表示没有补充嘘的细胞被移植到新生儿大脑皮层, 并分析了30天后移植。(C) pv +、sst + 和 pv/sst-神经元的百分比在 DD11 时获得, mCherry 只表示在凹陷存在下生长的细胞 (30 nM;DD8-10) 和 aPKCi (2 µM;DD8-11) 移植到新生儿大脑皮层, 分析30天后移植。(D) pv +、sst + 和 pv/sst-神经元的百分比当 DD17 时, mCherry 只表示从 aPKCi 的 DD8-10 和µM (2 DD8-17) 的凹陷 (30 nM) 中生长的细胞被移植到新生儿大脑皮层, 并分析了30天后.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 演示本研究中描述的不同 PV 和 SST 丰富协议的流程图.(A) 对于所有协议, 导致包括 DD0-5 在内的差异开始的步骤是相同的。在 N2:KSR (1:1) 中, 所有细胞都是从 DD0-3 的胚状体生长而来, 辅以 BMP 抑制剂 LDN-193189 和 Wnt 抑制剂 XAV-939。在 DD3, 细胞是 "着陆" 在 N2:KSR (1:1) 含有 LDN-193189, XAV-939, 和岩石抑制剂 Y-27632。为了丰富 SST-亚型, 嘘是从 DD5-12 添加。另外, 嘘是从 DD8-12 添加, 因为, 在我们的经验, 从 DD5 和 DD8 起增加嘘不显著影响 PV 的比例: SST 亚型生成。协议的以前版本 (参见泰森et al.15) 没有在 DD8 上加入一个重新电镀步骤, 而是用外生嘘的 DD5 来补充媒体。该协议后来被修改, 以纳入一个重新电镀步骤的 DD8 连同介绍嘘, 这两个明显改变 PV: SST 比。在这种 "高嘘" 协议中, Lhx6::GFP+ 细胞在外源性嘘的存在下被隔离在 DD12 上, 用于下游应用。(B) 对于 "低嘘" 光伏协议, 外源嘘以及重新电镀步骤的 DD8 被省略。相反, Nkx2.1:: mCherry + 细胞是隔离在 DD17 上用于下游应用的外地资产管制系统。(C) 对于 "+ aPKCi" PV 协议, aPKCi 将与 DD8-10 中的凹陷一起添加, 并且只有 aPKCi 从 DD10 向前添加。在 DD11 或 DD17, Nkx2.1:: mCherry 细胞是分离的, 用于下游应用。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: Lhx6::GFP+ 细胞中的 PV 和 SST 免疫30天后移植到新生儿大脑皮层.(a) 高功率图像的 SST 表达, Lhx6::GFP+ 细胞30天后移植到新生儿大脑皮层。在每列四图像是单通道图像的 Lhx6::GFP, PV 和 SST 表达与3通道合并图像在底部。如顶部面板所示, 这个 Lhx6::GFP+ 神经元阐述了一个成熟的形态学的多个过程。(B) 高功率图像两个 PV 表示, Lhx6::GFP+ 细胞移植后30天。(C) 高功率图像的 SST-/PV 双负, Lhx6::GFP+ 电池。虽然这个细胞阐述了多个过程一致的完全分化和皮质融合, 这个细胞没有明确表示 PV 或 SST。注意, 有一个 PV + 核毗邻的 Lhx6::GFP+ 细胞, 但它不重叠。缩放条形图 = 50 µm (A-c)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: PV、SST 和 Lhx6::GFP 蛋白表达的中低功耗图像30天后移植到新生儿大脑皮层.(a) 在移植后30天内包含 30 Lhx6::GFP+ 细胞的小鼠大脑皮层区域中功率图像。这些细胞是使用光伏协议 (+ aPKCi 从 DD8-11;隔离和移植 Nkx2.1:: mCherry + DD11)。在这里看到的30细胞中, 16 快 pv, 4 express sst, 10 表示既不 pv 也非 sst。(B) 小鼠大脑皮层区域的低功耗图像, 含有大量的、分化良好的 Lhx6::GFP+ 细胞, 30 天后移植。注意 Lhx6::GFP+ 过程在整个皮层中的丰富性。偶尔的细胞也会在海马体中发现, 在那里, 他们似乎整合和精细的过程与成熟的表型相一致。刻度栏 = 50 µm (A);550µm (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和未分化干细胞的正常外观.(A) 这里显示的是4X 和10X 放大明图像, 演示了我们的鼠标胚胎成纤维细胞 (MEF) 给料层的典型外观24小时后电镀。(B) 这里显示的是我们的小鼠胚胎干细胞 (mESCs) 的典型外观2天后, 对 MEF 喂食器电镀。注意, 殖民地有一个明亮的周长和椭圆形或卵球形的外观。如果蜂群失去这个明亮的周长或开始向外投射, 这些都是细胞可能分化的迹象。(C) 这里显示的是 mESCs 1 和2天后, 重新电镀到明胶涂层的菜肴, 以稀释在开始分化前的 MEF 馈线。注意, 在48小时后, 干细胞在明胶上有很大的扩张, 并开始重新得到一个具有明亮周长的卵球形外观。缩放栏 = 100 µm 在4X 和10X 照片。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 小鼠胚胎干细胞在分化日1到7的外观.(A) 在漂浮后的某一天, 可以看到干细胞形成小的胚状体 (EBs)。到第二天, EBs 的增长相当可观。注意, 一些 EBs 已经粘在一起, 形成了更大的细胞簇。我们并不认为这会对分化产生负面影响。3天后, EBs 变得更大, 一些不再通过它们传送光。在背景中看到细胞碎片是正常的。(B) 这里显示的是干细胞在分化日 4 (DD4) 着陆后24小时。注意细胞的密度。许多人已经开始扩展小的过程, 随着分化的继续, 这将会增加。请注意, 在这里, 细胞甚至是彩色的小黑点遍布。如果细胞有光泽或均匀的出现, 这是一个异常分化的迹象。(C) 通过 DD5, 细胞继续增殖并形成神经花环。许多细胞延长了细长的过程。(D) 通过 DD7, 单元格应该是汇合的。这是正常的看到一个 "瑞士奶酪" 模式, 其中大, 扁平, 核细胞 (可能膜或胶质细胞) 创建循环岛屿内的一层神经祖。有时当细胞密度高于正常值时, 这种 "瑞士奶酪" 模式不发育, 如中间图像所示。根据差异, 这可能会影响神经诱导。4x 和10x 表示放大倍数。缩放栏 = 100 µm 在4X 和10X 照片。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 9 到14天的差异的外观.(A) 在重新电镀后的某一天可以可视化单个电池。注意他们的双极外观, 这是典型的神经祖细胞。这种培养是同质的, 很少有其他浸润细胞类型。密度是适当的在这个阶段。(B) 通过 DD11, 细胞已长成单层。类似于早期的分化阶段, 大的 "卵状" 多核细胞可以被看到穿插在整个。(C) 通过 DD13, 细胞继续增殖。他们现在可以看到形成小土墩。许多 "蛋样" 细胞始终存在。从这一点开始, 文化将只显示一些变化, 除了土墩越来越大。4X、10Xx 和20X 表示放大倍数。缩放条 = 100 µm 在4X 和10X 相片, 和缩放酒吧 = 50 µm 在20X 相片。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 4 天未成功区分的外观.DD4 在评估差异的成功方面是重要的, 因为它遵循了协议中最困难的步骤之一: 登陆 DD3。通过 DD4, 细胞在与胚体分离后有24小时的恢复。正如这里可以看到的, 大多数细胞是闪亮和均匀的出现。穿插在整个是偶尔出现的细胞正常, 有一个黑暗的外观与小黑点蔓延整个。此外, 大的扁平细胞 (如左下面板所示) 是异常分化的指示。在右下方的面板中, 至少有三小组细胞 (黄色箭头) 显示为小的胚状体, 表明有缺陷的分化, 不完全的 EB 离解, 或对细胞培养板表面粘附不良。这些图像与图 7B中所示的图片相反, 它们描述了 DD4 上正常的显示单元。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

虽然这种方法是非常有效的模式 J1-derived mESCs (SCRC-1010), 我们已经经历了可变的成功与其他制线和克隆分离株。例如, Foxg1::venus mESCs (EB3-derived;Danjo et al.13) 对此协议的响应很差, DD12 的 Foxg1 归纳通常按1-2% 的顺序进行。出于我们不完全理解的原因, 另一个 Nkx2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP 双报告克隆 (称为 JQ59), 同时被隔离为该协议中描述的线 (称为 JQ27), 生长时产生少于 1% Nkx2.1 表达的细胞在相同的条件下。父行 (J1;但是, ATCC SCRC-1010) 对该协议的响应很好, 并且在 DD12 上生成的 Nkx2.1 表达式单元格的百分比与图 1B中显示的相同。如有必要, 可对 XAV-939 和嘘/凹陷的浓度进行调整, 以逐行地优化差异条件。然而, 我们的经验使用这个协议来区分其他制线到 MGE 象祖是有限的。

关于我们的 Nkx2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP 双制线, 并非所有 Nkx2.1 + 细胞表达 mCherry。虽然几乎所有的 mCherry + 细胞表达 Nkx2.1 蛋白, 记者表达滞后于 Nkx2.1 蛋白表达, 特别是在早期分化 (DD7-9)。在分化过程中, 表达 mCherry 的 Nkx2.1 + 细胞的分数稳步增加。在峰值水平 (〜 DD12-14) mCherry 是表示约30% 的所有 Nkx2.1 表示祖细胞17。此外, 同样的细菌人工染色体驱动 mCherry 表达已被用来驱动重组在 Nkx2.1 表达领域的转基因小鼠24。在这些小鼠中, Nkx2.1 表达在 MGE 背多数区域的细胞内表现较弱, 与这只老鼠的命运映射出现在标签海温表达 CIns, 已知主要来自这个区域的25, 26、27、28。然而, 尽管有这些差异, 数以百万计的 GFP 或 mCherry 表达的细胞可以隔离, 只有几个小时的外地资产管制。

这项技术有两个主要优点。首先, 结合我们的 Nkx2.1:: mCherry: Lhx6:: GFP 双制线, 有可能获得大量的 interneuron 前体富集成为 PV 或 SST-注定的皮质 interneuron 亚型。第二个主要优势是相对容易, 大量的 interneuron 命运的细胞可以获得。虽然存在一些其他的改进 EB 技术来区分 MGE 祖和神经元, 这些协议通常依赖于使用 Wnt 抑制分子, 如 Dkk113,14,29。我们发现, Wnt 抑制剂 XAV-939 大大提高了球 telencephalic 祖的生成, 如 Foxg1 和 Nkx2.1 表达式15所证明的那样。

如前所述, 还有其他几种方法来生成来自 mESCs 的 MGE 样祖。渡边et al.14率先开发了无血清悬浮培养方法, 并在附着面上重新电镀后, 从 mESCs telencephalic 分化的领域。他们发现, Wnt 和节点拮抗剂, Dkk1 和 LeftyA, 分别, 有效地推动 mESCs 早期神经血统13。通过对这些文化的应用嘘, 他们观察到, 在文化中的所有细胞中, 5-15% 之间的 Nkx2.1/Foxg1, 可以被视为 MGE 样的祖先13。然而, 在为许多研究打下基础的同时, 这项研究并没有找到一种方法来分离 MGE 祖细胞或丰富特定的特殊类型。

几年后, Danjo et al.13使用相同的无血清悬浮培养方法与各种生长因子的定时管理相结合, 特别是嘘, 以达到分次制的腹 telencephalic 组织的规范。使用 Foxg1::venus 记者线, 他们发现, 嘘行政从 DD3-12 后 Dkk1 治疗导致45-68% 之间的所有细胞的文化表达 Foxg1::venus 记者13。在 Foxg1::venus+ 人口中, 大约32% 的细胞表达了 Nkx2.113。通过替代嘘凹陷和添加 Fgf8, 它们进一步提高了 Foxg1::venus+ 种群中 Nkx2.1 祖细胞的分数, 使其在大约 41%13。当检测到命运, 这些细胞产生约 17% SST, 21% PV, 18% NPY, 8% calretinin 亚型13。然而, 虽然这项研究描述了一种方法来指定 CGE 与 MGE 衍生的命运, 它没有描述一种方法, 选择性丰富的 PV 或 SST 亚型。

第二年, Cambray et al.11在 DD5 上采用无血清单层膜法, 研究激活对小鼠和人干细胞 telencephalic 神经前体的分化和同一性的影响。虽然这项研究没有报告在他们的协议中产生的 Nkx2.1 细胞的百分比, 他们报告说, 大约有54% 的细胞在文化合作表达 Nestin/Foxg1 DD2 (5 天的血清自由培养基的增长后, 另外2天的文化重新电镀后)11。他们还报告说, 随着激活, 55% 的细胞 co 表达巢和 CouptfII, 表明这些细胞可能代表尾节隆起样细胞, 从而产生大多数 calretinin 表达皮质神经元11. 事实上, 在文化中8天 (总共13天), 39% 的细胞被发现为联合表达 calretinin/比尔-蛋白, 而59% 的细胞被发现为联合表达 GABA/比尔-蛋白11。这项研究没有考察 PV 或 SST 亚型的产生。

再次使用改进的 EB 方法, 陈et al.12演示了 MGE 特定的增强元素可用于跟踪和纯化干细胞衍生 MGE 样细胞12。在这项研究中, 他们比较了不同的文化条件的影响, 在定向分化 mESCs 成 MGE 样祖使用 Lhx6::GFP 记者线;同一行, 作为 Nkx2.1 的父行:: mCherry: Lhx6:: GFP 双报告线在本手稿中描述。他们表明, 添加 Dkk1 的文化条件从 DD0-3, 其次是下垂, 向上的〜10% 的所有细胞在文化表达 Lhx6::GFP12。他们还发现, 适用于 Danjo et al.描述的 Foxg1::venus 行的同一协议12, 导致大约37% 的所有单元格表示 Foxg1::venus 报告器。当 Lhx6::GFP 细胞被移植到体内时, 发现了以下的平均百分比: 22% PV、58% SST 和 16% NPY12。

最近, 其他团体使用了强制表达谱系定义转录因子直接指定 CIns。也许第一次演示是由彼得罗斯米et al.10使用强力霉素诱导的启动子在 Ainv15 mESCs 中驱动 Nkx2.1 表达, 并对其进行了修改, 以包含 Lhx6::GFP 细菌人工染色体。这项研究使用了类似于当前手稿中所描述的文化条件, 但没有添加 XAV-93910。然而, 由于不太了解的原因, 与使用本手稿10中描述的 J1 Lhx6::GFP 父行相比, 在相同的分化条件下观察到的 Lhx6::GFP+ 细胞百分比较低。尽管达到了类似的 Foxg1 表达水平 (总% 未知), 但 Nkx2.1 细胞总数的适度减少, 在表达 Lhx6::GFP 记者10的所有单元格中不超过2%。本研究强调了各种 esc 线之间存在的内在差异, 以及研究人员在尝试将差异化协议应用于与最初开发协议的 esc 线不同时所面临的挑战。

使用优雅的方法, Au et al.9使用由渡边et al.开发的相同的腹 telencephalic 分化范例, 利用转录因子的顺序强制表达来生成皮层神经元的特定亚型。14虽然它们不报告在文化中产生的 Foxg1+、Nkx2.1 + 和 Olig2+ 前体的确切百分比, 但它们指出, 在文化中, 大约50% 的细胞被分化为 gaba 神经元9。在11天后分化, EBs 被离解和移植到 MGE 的 E13.5 宿主胚胎的9。其中的一小部分 (少于 1%) 从 MGE 迁移到皮质, 在那里他们被他们的 Dlx5/6-eGFP 记者识别并为命运分析9。作者根据他们所选择的强制归纳策略9, 观察了 PV、SST 和 CGE 之类的命运的各种百分比。有趣的是, 随着转录因子 Lmo3 的表达, 他们观察到平均约 57% PV, 21% sst 和 15% CGE 衍生的亚型 (SST-/reelin + 或仅 VIP +)9。观测到的 sst 亚型的最大百分比是使用 Nkx2.1/Dlx2 GOF 线获得的, 它产生了大约 32% sst、35% PV 和 25% CGE 派生的亚型9。

在 2015年, Colasante et al.30显示五转录因子 (Foxg1、Sox2、Ascl1、Dlx5 和 Lhx6) 在成纤维细胞内从 GAD67-GFP 报告鼠中强迫表达, 将15% 的所有细胞转换成 gaba 样 CIns。值得注意的是, 大约90% 的这些细胞继续表达 PV, 只有稀有的细胞表达 SST30。虽然此方法不适用于 mESCs, 但它用于人类干细胞, 据估计, 大约30% 的所有单元格都采用了 gaba 标识30。

如图 2所示, 有多种方法可以生成 PV 或 SST CIns 的富集种群。PV 协议的主要优点是利用 aPKCi 在 DD17 协议上, 可以隔离的细胞数量越多, 细胞的活力和培养的持续时间就越多。虽然我们在图 1中没有显示 DD17 感应级别的数据, 但在 DD11 中有大约两倍于 DD17 (未显示数据) 的 mCherry + 单元格。当收集细胞进行移植时, 我们发现大量的起始细胞 (见下文) 是有益的, 因为大约30-50% 的细胞在集中注射的过程中丢失了。此外, 更多的细胞可以获得与更短的资产管制时间, 这限制了时间的数量, 细胞在冰上, 并降低了总成本。可能是因为樱桃 + 细胞的百分比较高, 所以早期培养阶段的细胞 (例如, DD11) 与移植到新生大脑皮层后的 DD17 细胞相比, 具有更大的存活率。当需要大量的活细胞时, 例如在细胞移植治疗癫痫的情况下, 有一个更大的开始人口和更大的生存能力是一个主要优势。

如图 2所示, 根据协议的不同, 大约25-39% 的 Lhx6::GFP+ 细胞分析了30天后移植不表达 PV 或 SST 蛋白的常规免疫组织化学检测水平。一般来说, 这些 PV/SST-细胞表达 GABA 以及 Sox6, MGE 的皮质神经元的标志 (见泰森et al.15, Tischfield et al.17). 不到1% 的 PV/SST Lhx6::GFP+ 细胞表达其他 interneuron 子群的标记, 如 calretinin、reelin 或神经肽 Y (未显示数据)。这类似于在体内的命运测绘研究表明, 在〜15-25% 之间的 MGE 衍生神经元不表示 PV 或 SST23,25,31。当 Nkx2.1:: mCherry + 或 Lhx6::GFP+ 细胞被隔离和镀在大鼠皮层饲养者在体外, 我们发现, 40-70% 的 Lhx6::GFP+ 细胞分析后28天的文化是 PV-/SST-, 与大多数的那些做染色阳性表示 SST。pv/SST 细胞的这种增加可能是由于没有外部的成熟信号 (在体内存在), 特别是在成熟的 pv 表达式中, 或者馈线细胞的电生理输入的次优。不管原因是什么, 我们更愿意将细胞移植到新生儿大脑皮层进行命运分析, 而不是体外分化。

对于大多数移植实验, 我们建议在 DD0 上漂浮至少两个10厘米的非附着组织培养皿, 每个都含有 7.5 x 105 mESCs 在10毫升的 N2/KSR (7.5 x 104细胞/毫升; 20 毫升总体积)。同时, 这两个板块通常会产生 8-12 x 106细胞后 EB 离解 DD3, 其中 5.4 x 106细胞可用于种子两 6-良好组织培养处理板 (5万细胞/cm2; 约110厘米2共计)。由 DD8, 每个6井板的产量约 5-7 x 107细胞, 然后可用于在密度为25万的单元/cm2 (在 4.05 10 的情况下总共需要 7 x 三6单元格) 中再播种一个额外的三到五 6-井板在五 6-井板的情况下, 板或 6.75 x 107单元格。由 DD14, 每个 6-井板块通常会产生 1-2. 5 x 106 mCherry 或 GFP 表达细胞。根据实验的需要, 我们已经最小化了 7.5 x 105 mESCs, 用于小规模免疫组化分析, 用于大型移植项目的 6 x 106 mESCs。

该协议的最关键的步骤是保持 mESCs 在一个多能状态在开始分化之前和着陆/离解步骤的 DD3。如果细胞保持正常, 在 DD3 上的着陆/分离是仔细进行的, 分化通常会成功。只有干细胞才显得健康, 应该用于分化。如果 EBs 不能形成在 DD0-3 或形成多个, 小, 不对称的身体之间, 分化很可能是不成功的。此外, 在 eb 分离的 DD3, eb 应仔细监测, 直到不再可见的眼睛, 以避免长期接触的非胰蛋白酶含有细胞离解摄政。

在优化条件下, 利用质量控制试剂, 得到了本文的结果。这是很重要的注意, 因为我们偶尔有困难实现稳健的 Nkx2.1 归纳, 并通过扩展, mCherry 和 GFP 记者表达。根据我们的经验, 我们相信 FBS 的很多变化可能是这些改变的原因。因此, 明智的做法是测试不同的大量 FBS, 以确定哪些工作最适合于维护 mESCs。虽然我们没有使用2的 i/LIF 系统 (无血清培养基含有酮抑制剂 PD03259010 和 GSK-3α/β抑制剂 CHIR99021), 它是可能的无血清制条件可能产生更一致的结果。然而, 我们没有测试这一假说, 也没有关于使用无血清制介质是否会影响 mESCs 分化为 MGE 样祖细胞的数据。另外, 在可能的情况下, 一定要使用新鲜的生长因子, aliquoting 它们进行一次性使用。根据用户, 细胞密度可能需要增加, 以获得足够的细胞生存, 特别是在着陆步骤在 DD3。

神经元具有卓越的生存、迁移和整合到宿主电路后移植的能力。因此, 本议定书可用于将 interneuron 前体移植到癫痫小鼠模型和其他神经系统和神经精神疾病模型中 (见罗伯特·索恩韦尔et al.32和泰森和安德森33 interneuron 细胞基治疗的审查)。例如, 在最近的一项研究中, Donegan et al.34丰富了 PV 和 SST CIns 的种群, 以便移植到精神分裂症的小鼠模型中. 他们发现, pv 和 SST 的丰富移植对小鼠的行为产生了不同的影响, 而 pv 丰富的人群正对他们所研究的精神分裂症 endophenotypes 进行规范化。

近年来, PiggyBac 转系统已被用于在多个系统中实现转基因的稳定表达。利用该系统可以快速、方便地建立稳定表达的强力霉素诱导 miRNA 结构, 研究 interneuron 发育过程中特定基因的作用。我们也使用这项技术创建双重记者制线, 表达 channelrhodopsin-2 (ChR2) optogenetically 驱动器制派生神经元或 DREADD 受体技术打开或关闭移植细胞成批.

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 Nkx2.1 的发展:: mCherry: Lhx6: GFP 双重记者制线以及詹妮弗. 泰森、Maroof 和蒂姆. 彼得罗斯米为帮助开发这一协议而进行的早期工作。我们还感谢印章流式细胞仪的核心技术援助。这项工作得到了 NIH R01 MH066912 (SA) 和 F30 MH105045-02 (DT) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

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神经科学 问题 130 脑 小鼠 interneuron 分化 皮层 细胞培养 干细胞 移植
小鼠胚胎干细胞向皮质 Interneuron 前体细胞的分化
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Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

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