Det här protokollet beskriver en metod för att generera kortikala interneuron stamfäder och efter mitotiska interneuron prekursorer från mus embryonala stamceller med en modifierad embryoid kropp-till-enskiktslager metod. Dessa stamfäder/prekursorer kan vara används in vitro- fluorescently sorterade och transplanteras i neonatal hjärnbarken för att studera öde bestämning eller används i terapeutiska tillämpningar.
GABAergic kortikala interneuroner är en heterogen population av celler som spelar avgörande roller i reglerar produktionen av excitatoriska pyramidal nervceller samt synkronisera utgångarna av pyramidal neuron ensembler. Underskott i interneuron funktion har varit inblandade i en mängd olika neuropsykiatriska störningar, schizofreni, autism och epilepsi. Härledningen av kortikala interneuroner från embryonala stamceller inte bara tillåter för att studera deras utveckling och funktion, men ger en inblick i de molekylära mekanismer bakom patogenesen av kortikala interneuron-relaterade sjukdomar. Interneuroner har också en anmärkningsvärd förmåga att överleva, migrera och integrera i värd kortikala kretsar efter transplantation, vilket gör dem till perfekta kandidater för användning i cellbaserade terapier. Här presenterar vi en skalbar, högeffektiva, modifierad embryoid kropp-till-enskiktslager metod för härledning av Nkx2.1-uttryckande interneuron stamfäder och deras avkomma från mus embryonala stamceller (mESCs). Använda en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje, kan Nkx2.1 stamfäder eller deras Lhx6-uttryckande efter mitotiska avkommor isoleras via fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och därefter används i ett antal nedströms tillämpningar. Vi ger också metoder för att berika för parvalbumin (PV) eller somatostatin (SST) interneuron undergrupper, som kan vara till hjälp för att studera aspekter av öde bestämning eller för användning i terapeutiska tillämpningar som skulle dra nytta av interneuron undergruppen-berikad transplantationer.
Både möss och människor, ungefär hälften av alla kortikala hämmande interneuroner (CIns) har sitt ursprung inom en övergående subkortikala struktur som kallas den mediala ganglieblockerande eminens (MGE), där neuroepithelial föräldraparets CIns och andra neuronala och gliaceller undergrupper express Transkriptionfaktorn Nkx2.11,2. CIn undergrupper eller subtyper definieras av korsande morfologiska, neurokemiska, elektrofysiologiska och anslutningsmöjligheter egenskaper3,4. Den MGE-derived CIns kan grupperas i mestadels icke-överlappande undergrupper baserat på deras uttryck för antingen PV eller SST, uttrycket av som korrelerar med särskilt elektrofysiologiska och anslutning tendenser5. Dysfunktion i interneuroner, särskilt de i undergruppen som PV har varit inblandad i flera neuropsykiatriska sjukdomar och åkommor6,7. Det övergripande målet med denna metod är att producera stamceller-derived mitotiska stamfäder och flyttande prekursorer berikad för antingen PV eller SST CIn öde för att studera kortikala interneuron biologi och för användning i cellbaserade terapier.
Vi har utvecklat en skalbar, mycket effektiv metod för bestämning av Nkx2.1-uttryckande interneuron stamfäder och deras avkomma från mESCs. Använder en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje8, Nkx2.1 stamfäder eller deras Lhx6-uttryckande efter mitotiska avkomma kan vara isolerade via FACS och därefter används i ett antal nedströms tillämpningar. Genom att manipulera ett antal signalvägar, varaktighet av kultur och mode av neurogenes, kan vi få miljontals fluorescently märkt interneuron prekursorer lämplig för en mängd nedströms applikationer.
Även om det finns flera andra metoder för att generera MGE-liknande stamfäder från mESCs9,10,11,12,13,14, vår metod, som bygger på Wnt antagonist XAV-939, är särskilt effektiv på att skapa Foxg1/Nkx2.1 Co uttrycker telencephalic stamfäder. Dessutom förbättrar möjligheten att välja för interneuron föräldraparets eller deras efter mitotiska Lhx6-uttryckande avkommor via vårt dubbla reporter system, kapacitet att generera tydliga stamfäder och deras avkomma.
Även denna metod är mycket effektiv vid mönstring J1-derived mESCs (SCRC-1010), har vi upplevt varierande framgång med andra mESC linjer och klonal isolat. Exempelvis Foxg1::venus mESCs (EB3-härlett; Danjo o.a. 13) svara dåligt på detta protokoll och Foxg1-induktion av DD12 är vanligtvis storleksordningen 1-2%. Av skäl som vi inte förstår, producerar en annan Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dubbla reporter klon (kallas JQ59) som var isolerad samtidigt som den linje som beskrivs i det…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Qing Xu för att utveckla den Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dubbla reporter mESC linje och Jennifer Tyson, Asif Maroof, samt Tim Petros för deras tidiga arbete med att hjälpa till att utveckla detta protokoll. Vi tackar också CHOP flöde flödescytometri kärnan för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av en NIH R01 MH066912 (SA) och F30 MH105045-02 (DT).
Bottle-top vacuum filter system | Corning | CLS430769 | |
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | ThermoFisher | Corning 352235 | |
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35 |
FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37 |
N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Do not filter with base media — add after filtration |
Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39 |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11 |
L-glutamine (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher | 21985023 | |
KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11 |
Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11 |
Tissue culture treated dish (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
Non-adherent sterile petri dish (10cm) | VWR | 25384-342 | |
Leukemia inhibitory factor (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11 |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
0.1% Gelatin Solution | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P6282 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11 |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M610A | |
LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
rhFGF-2 | R&D Systems | 233-FB | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
rhIGF-2 | R&D Systems | 291-G1 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
ROCK inhibitor (Y-27632) | Tocris | 1254 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
Smoothened agonist (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
rm Sonic Hedgehog/SHH | R&D Systems | 464-SH-025 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated | EMD Millipore | 539624 | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |