Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Differentiering av mus embryonala stamceller till kortikala Interneuron prekursorer

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Det här protokollet beskriver en metod för att generera kortikala interneuron stamfäder och efter mitotiska interneuron prekursorer från mus embryonala stamceller med en modifierad embryoid kropp-till-enskiktslager metod. Dessa stamfäder/prekursorer kan vara används in vitro- fluorescently sorterade och transplanteras i neonatal hjärnbarken för att studera öde bestämning eller används i terapeutiska tillämpningar.

Abstract

GABAergic kortikala interneuroner är en heterogen population av celler som spelar avgörande roller i reglerar produktionen av excitatoriska pyramidal nervceller samt synkronisera utgångarna av pyramidal neuron ensembler. Underskott i interneuron funktion har varit inblandade i en mängd olika neuropsykiatriska störningar, schizofreni, autism och epilepsi. Härledningen av kortikala interneuroner från embryonala stamceller inte bara tillåter för att studera deras utveckling och funktion, men ger en inblick i de molekylära mekanismer bakom patogenesen av kortikala interneuron-relaterade sjukdomar. Interneuroner har också en anmärkningsvärd förmåga att överleva, migrera och integrera i värd kortikala kretsar efter transplantation, vilket gör dem till perfekta kandidater för användning i cellbaserade terapier. Här presenterar vi en skalbar, högeffektiva, modifierad embryoid kropp-till-enskiktslager metod för härledning av Nkx2.1-uttryckande interneuron stamfäder och deras avkomma från mus embryonala stamceller (mESCs). Använda en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje, kan Nkx2.1 stamfäder eller deras Lhx6-uttryckande efter mitotiska avkommor isoleras via fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och därefter används i ett antal nedströms tillämpningar. Vi ger också metoder för att berika för parvalbumin (PV) eller somatostatin (SST) interneuron undergrupper, som kan vara till hjälp för att studera aspekter av öde bestämning eller för användning i terapeutiska tillämpningar som skulle dra nytta av interneuron undergruppen-berikad transplantationer.

Introduction

Både möss och människor, ungefär hälften av alla kortikala hämmande interneuroner (CIns) har sitt ursprung inom en övergående subkortikala struktur som kallas den mediala ganglieblockerande eminens (MGE), där neuroepithelial föräldraparets CIns och andra neuronala och gliaceller undergrupper express Transkriptionfaktorn Nkx2.11,2. CIn undergrupper eller subtyper definieras av korsande morfologiska, neurokemiska, elektrofysiologiska och anslutningsmöjligheter egenskaper3,4. Den MGE-derived CIns kan grupperas i mestadels icke-överlappande undergrupper baserat på deras uttryck för antingen PV eller SST, uttrycket av som korrelerar med särskilt elektrofysiologiska och anslutning tendenser5. Dysfunktion i interneuroner, särskilt de i undergruppen som PV har varit inblandad i flera neuropsykiatriska sjukdomar och åkommor6,7. Det övergripande målet med denna metod är att producera stamceller-derived mitotiska stamfäder och flyttande prekursorer berikad för antingen PV eller SST CIn öde för att studera kortikala interneuron biologi och för användning i cellbaserade terapier.

Vi har utvecklat en skalbar, mycket effektiv metod för bestämning av Nkx2.1-uttryckande interneuron stamfäder och deras avkomma från mESCs. Använder en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje8, Nkx2.1 stamfäder eller deras Lhx6-uttryckande efter mitotiska avkomma kan vara isolerade via FACS och därefter används i ett antal nedströms tillämpningar. Genom att manipulera ett antal signalvägar, varaktighet av kultur och mode av neurogenes, kan vi få miljontals fluorescently märkt interneuron prekursorer lämplig för en mängd nedströms applikationer.

Även om det finns flera andra metoder för att generera MGE-liknande stamfäder från mESCs9,10,11,12,13,14, vår metod, som bygger på Wnt antagonist XAV-939, är särskilt effektiv på att skapa Foxg1/Nkx2.1 Co uttrycker telencephalic stamfäder. Dessutom förbättrar möjligheten att välja för interneuron föräldraparets eller deras efter mitotiska Lhx6-uttryckande avkommor via vårt dubbla reporter system, kapacitet att generera tydliga stamfäder och deras avkomma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Dubbla reporter mESC linjen beskrivs i detta protokoll är tillgängliga på begäran (sande@mail.med.upenn.edu).

1. Media förberedelse

Obs: Varma alla medier till 37 ° C före användning i cellkultur.

  1. Mus embryonala Fibroblast (MEF) media (för att förbereda 500 mL)
    1. Tillsätt 50 mL fetalt bovint serum (FBS) till 449 mL Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) och filtrera genom en 500 mL 0,22 µm porstorlek filterenhet.
    2. Tillsätt 1 mL antimikrobiellt medel (50 mg/mL) efter filtrering. Förvara materialet vid 4 ° C för upp till 1 månad eller alikvot och butiken på ≤-20 ° C.
  2. N2 media (för att förbereda 500 mL)
    1. Tillsätt 5 mL L-alanin-L-glutamin (100 x) och 500 µL 2-merkaptoetanol (55 mM) till 489.5 mL DMEM: näringsämne blandning F-12 (DMEM/F-12) och filtrera genom en 500 mL 0,22 µm porstorlek filterenhet.
    2. Tillsätt 1 mL antimikrobiellt medel (50 mg/mL) och 5 mL N2 tillägg-B efter filtrering. Förvara materialet vid 4 ° C i mörker i upp till 1 månad.
  3. Serumfritt odlingsmedium (KSR) (för att förbereda 500 mL)
    1. Tillsätt 75 mL serumfritt medium supplement, 5 mL L-glutamin (100 x), 5 mL MEM icke-essentiella aminosyror (MEM-NEAA) (100 x), och 500 µL 2-merkaptoetanol (55 mM) till icke 413.5 mL-glutamin som innehåller DMEM och filtrera genom en 500 mL 0,22 µm porstorlek filterenhet.
    2. Tillsätt 1 mL antimikrobiellt medel (50 mg/mL) efter filtrering. Förvara materialet vid 4 ° C i upp till 1 månad.
  4. Mus embryonala stamceller media (för att förbereda 500 mL)
    1. Lägg 75 mL stamceller grade FBS, 5 mL MEM-NEAA (100 x), 5 mL L-glutamin (100 x), och 500 µL 2-merkaptoetanol (55 mM) till icke 413.5 mL-glutamin som innehåller DMEM och filtrera genom en 500 mL 0,22 µm porstorlek filterenhet.
    2. Tillsätt 1 mL antimikrobiellt medel (50 mg/mL) efter filtrering. Förvara materialet vid 4 ° C i mörker för upp till 1 månad eller alikvot och butiken på ≤-20 ° C.

2. odling mESCs

  1. Plattan mitotiskt inaktiva MEF feeder celler i MEF media till vävnadsodling behandlade plattorna vid 3-4 x 104 celler/cm2. Låt minst 12 h för dem att bosätta sig i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2 före plätering i mESCs. Inte används omedelbart, ersätta MEF media var 3 dagar. Kassera MEFs om inte används inom 7 dagar efter bordläggningen.
  2. Lägga till mESCs (densitet varierar från 1-4 x 104 celler/cm2) MEF plattor i mESC media som innehåller mus leukemi hämmande faktor (mLIF) (1000 U/mL). Inkubera cellerna vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2.
  3. Passagen mESCs med hjälp av trypsin-EDTA (0,05% trypsin) (1:5-1:10) När skålen blir ~ 70-80% konfluenta eller om kolonierna börjar röra. Detta vanligtvis inträffar varannan dag, men kan ta upp till 4 eller 5 dagar beroende på den inledande plätering densiteten.
  4. Upprätthålla mESCs på ett MEF feeder lager i mESC medium att hålla pluripotency.
  5. Innan du börjar differentiering, passage cellerna minst en gång på gelatin belagda plattor utan MEFs att späda ut MEFs.
    1. Förbereda gelatin belagda plåtar genom att lägga till 0,1% gelatin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med Ca2 +/Mg2 + till en vävnadskultur behandlas maträtt och lämnar vid 37 ° C i minst 1 h. plattan 1,5-2 x 106 celler/10 cm platta (2,7-3,6 x 104 celler/cm2) och låta cellerna att expandera i 2 dagar innan du börjar differentiering.

3. att differentiera mESCs mot MGE-liknande Telencephalic stamfäder

  1. Differentiering dag (DD) 0 = ”flyta celler”
    1. Efter mESCs har vuxit på gelatin belagda plåtar för 2 dagar, aspirera media och tvätta cellerna en gång med PBS utan Ca2 +/Mg2 +. Lägg tillräckligt trypsin-EDTA (0,05% trypsin) för att täcka ytan av plattan (vanligtvis 4 mL trypsin-EDTA för en 10 cm vävnadsodling maträtt) och placera cellerna tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2 för 4 min.
    2. Efter 4 min, släcka den trypsin-EDTA med 2 gånger volymen med mESC media. Överföra cellerna till en lämplig storlek centrifugrör och centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min. Efter 5 min, ta bort röret och aspirera media utan att störa pelleten. Återsuspendera pelleten i 1 mL KSR:N2 media (1:1) som innehåller den BMP-hämmaren LDN-193189 (250 nM) och den Wnt-hämmaren XAV-939 (10 µM).
    3. Mäta cellkoncentrationen använder en hemocytometer eller automatiserade cell räknare. Börjar växa celler som embryoid organ (EBs) genom att lägga till 75 000 celler/mL i KSR:N2 media (1:1) som innehåller LDN-193189 (250 nM) och XAV-939 (10 µM) i icke-anhängare vävnadsodling rätter. Inkubera cellerna vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2.
  2. På DD1, förbereda för cell som ”landning” av beläggning vävnadsodling behandlas rätter med poly-L-lysin (10 µg/mL i PBS med Ca2 +/Mg2 +) över natten (O/N) vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet eller för minst 1 h.
  3. På DD2, aspirera den poly-L-lysin och täck plattorna med laminin (10 µg/mL i PBS med Ca2 +/Mg2 +) O/N vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet.
    Obs: Medan O/N är optimal, så lite som 2 h kan räcka. Om plattorna inte används av nästa dag, aspirera laminin, ersätta med PBS utan Ca2 +/Mg2 +och förvaras vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
  4. DD3 (”mark celler”)
    1. Innan du börjar EB dissociation, aspirera till laminin och låta plåtarna till helt torra i en vävnadskultur huva. Använd inte plattor som visas blanka eller synligt våt. Överföra EBs med media i en 15 mL rör och Centrifugera under 3-4 minuter vid 15 x g eller tills EBs har pelleterat.
  5. Aspirera media och tillsätt 3 mL cell avlossning lösning som innehåller DNAS (2 U/mL) och inkubera vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2 för 15 min. Knacka försiktigt röret varje 3 min stöd i EB dissociation.
  6. När EBs inte längre synliga eller 15 min har förflutit, lägga till 6 mL KSR:N2 (1:1) som innehåller DNAS (1 U/mL) och Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g.
  7. Platta celler i KSR:N2 (1:1) som innehåller LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 µM), och den ROCK-hämmaren Y-27632 (10 µM) på 4,5-5 x 104 celler/cm2.

4. SST-berikande protokollet ”: DD12 GFP hög Sonic Hedgehog (SHH)” (fortsättning från steg 3,7)

  1. På DD5, ändra media med KSR:N2 (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), och SSH (50 ng/mL).
  2. Förbereda vävnadsodling plattor åter plätering på dag 8 (steg 4,4) med hjälp av instruktionerna i steg 3,2-3.3.
  3. På DD7, ändra media med KSR:N2 (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), och SHH (50 ng/mL).
  4. På DD8, åter tallrik cellerna.
    Obs: Detta steg är inte nödvändigt, åter plätering cellerna kan minska tidigt-differentierade, oönskade celltyper. Re plätering också bryter upp bollar av celler som försvårar nedströms immunhistokemiska analyser och ökar effektiviteten i FACS vid senare tidpunkter.
    1. Att åter platta celler, lossa cellerna från plattan med trypsin-EDTA (0,05% trypsin) under 5 minuter vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2. Släcka den trypsin-EDTA med 2 gånger volymen med KSR:N2 och centrifugera vid 200 x g för 5 min. filtrera cellerna genom en 40 µm filter slang att ta bort eventuella klumpar. Re tallrik cellerna på 250 000 celler/cm2 i N2/KSR (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), och Y-27632 (10 µM) med SHH (50 ng/mL).
      Obs: Om beslutet inte görs istället, åter tallrik DD8 celler, ändra media med KSR:N2 som innehåller SHH (50 ng/mL) varannan dag från DD7 till DD12 och fortsätta att lägga till IGF-1 (20 ng/mL) och FGF-2 (10 ng/mL) tills DD9.
  5. Ändra media på DD10, med KSR:N2 som innehåller SHH (50 ng/mL).
  6. På DD12, för att få celler som är berikad för SST subtyper, Använd FACS för att isolera Lhx6::GFP-endast uttrycker celler.
    1. För att lossa cellerna, använda en icke-trypsin innehållande cell-dissociation reagens i stället för trypsin-EDTA. Tvätta cellerna en gång med PBS utan Ca2 +/Mg2 +. Lägg till före värmde icke-trypsin innehållande cell-dissociation reagens innehåller DNAS (2 U/mL) till cellerna. Placera dem i inkubatorn vid 37 ° C med ≥ 95% relativ luftfuktighet och 5% CO2 för 10-30 min eller tills cellerna har lossnat. Knacka försiktigt på plåtarna var 5 minut stöd dissociation.
      Obs: För DD11-12 kulturer, endast 10-15 min kan vara nödvändigt. För DD15-16 kulturer, kan 30 min eller mer krävas för fullständig dissociation.
    2. När cellerna har helt lyfte plattan, vidare till FACS isolering använder standardprotokoll eller använda cellerna i andra nedströms analyser.

5. PV-berikande protokollet: ”DD11/DD17 mCherry + aPKCi” (fortsättning från steg 3,7)

  1. På DD5, ändra media med KSR:N2 (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL) och IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Förbereda vävnadsodling plattor åter plätering på DD8 (steg 4,4) med hjälp av instruktionerna som beskrivs i steg 3,2-3.3.
  3. På DD7, ändra media med KSR:N2 (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL) och IGF-1 (20 ng/mL).
  4. På DD8, åter platta celler som beskrivs i steg 4.4 med följande undantag: när åter plätering cellerna, ersätta SHH med glättas agonist (SAG; 30 nM) och lägga till atypiska PKC-hämmare (aPKCi; 2 µM). Sammantaget åter bordläggningen media är nu N2/KSR (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), och aPKCi (2 µM).
  5. Ändra media på DD10, med KSR:N2 som innehåller aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Obs: vid denna punkt, Nkx2.1::mCherry+ celler är berikad för att bli PV CIns.
    1. Lossa cellerna från plattan för FACS använder samma protokoll som beskrivs i steg 4,6. Om beslut fattas att samla Nkx2.1::mCherry+ celler vid en senare differentiering-dag, bortse från detta steg.
  7. Ändra media på DD12, med KSR:N2 som innehåller aPKCi (2 µM). Ändra media på DD14, med KSR:N2 som innehåller aPKCi (2 µM). Ändra media på DD16, med KSR:N2 som innehåller aPKCi (2 µM). På DD17, samla de Nkx2.1::mCherry+ cellerna använder samma protokoll som beskrivs i steg 4,6.

6. PV-berikande protokollet: ”DD17 mCherry låg SHH” (fortsättning från steg 3,7)

  1. På DD5, ändra media med KSR:N2 (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL) och IGF-1 (20 ng/mL). På DD7, ändra media med KSR:N2 (1:1) som innehåller FGF-2 (10 ng/mL) och IGF-1 (20 ng/mL).
  2. På DD9, ändra media med KSR:N2 (1:1). Från denna punkt framåt behövs ingen ytterligare tillväxtfaktorer.
    1. Fortsätta att ändra media varannan dag fram till skörd cellerna på DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet beskrivs i detta dokument är en modifierad version av vår publicerade protokoll15,16,17 och har optimerats för användning med våra Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje. Genom att lägga till den Wnt-hämmaren XAV-939 från DD0-5, kombinerat med nytt plätering på DD8, uppnå vi robust Nkx2.1 induktion, vari uppemot 50% av alla DAPI + kärnor i kultur också Nkx2.1 uttrycker (figur 1A, B). Immunhistokemi för mCherry och god Jordbrukarsed reportrar visar tydligt uttryck inom regioner i Nkx2.1-positiv immunoreaktivitet (figur 1A). FACS av levande celler använder infödda reportern visar att fyra populationer av celler kan isoleras tydligt: (1) god Jordbrukarsed/mCherry dubbla negativa celler, (2) mCherry endast uttrycker celler, (3) god Jordbrukarsed endast uttrycker celler och (4) GFP/mCherry dubbel-uttryckande celler ( Figur 1 c). Använda denna linje, börjar en bråkdel av föräldraparets slå på mCherry reporter runt DD8-9. MCherry nivåer topp mellan DD12-13 och sedan sjunka stadigt som föräldraparets avsluta cellcykeln och producera efter mitotiska Lhx6::GFP + interneuron prekursorer (figur 1 d). På motsvarande sätt Lhx6::GFP reportern som tänds mellan DD9-10 och toppar runt DD13-14 (figur 1 d). Även om det totala antalet Lhx6::GFP celler fortsätter att öka i kultur, procentsatsen inte, förmodligen på grund av spridningen av andra. En gång de Lhx6::GFP + reporter uttrycker, det fortfarande kan urskiljas på obestämd tid eftersom Lhx6 uttrycks stabilt i mogen MGE-derived kortikala interneuroner18,19. Även om Nkx2.1 och Lhx6 uttryck är till stor del icke-överlappande inom murina framhjärnan, finns det en övergående befolkning på Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP tillsammans uttrycker celler i kultur. Detta är åtminstone delvis på grund av perdurantismen av mCherry reporter utanför normala tidsramen för Nkx2.1 uttryck, som de flesta av de dubbel-märkt cellerna inte uttrycker detekterbara halter av Nkx2.1 protein (Tyson och Anderson, opublicerad). Cellerna fortsätter att uttrycka både Lhx6 reporter och Cherry/Nkx2.1 protein kan vara striatum interneuroner20. Men baserat på vår levande imaging studier, finns ett fönster på ca 18 h vari synkron, nyligen efter mitotiska prekursorer uttrycka Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP kan vara isolerade (Tischfield Anderson, opublicerade och se Tischfield o.a. 17). därmed, genom att samla Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP dubbel positiva celler när som helst under protokollet, det är möjligt att få en population av celler som huvudsakligen har lämnat cellcykeln inom ungefär 18 h av varandra. Detta är i motsats till Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP-bara uttrycka celler, som representerar olika typer av stamfäder och prekursorer, respektive, av varierande födelsedatum.

Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC raden kan användas för att berika för SST-ödesbestämd interneuroner. I allmänhet, att lägga till SHH till kulturer och samla GFP + celler vid tidigare tidpunkter i differentieringen (t.ex., DD12) berikar för SST undertyper. Utifrån våra observationer, vi har inte sett en signifikant skillnad i förhållandet SST:PV beroende på huruvida SHH läggs på DD5 eller DD8 (inga data anges). Genom att lägga till SHH (50 ng/mL) från DD8-12 och sedan transplantera GFP-bara uttrycker cellerna, vi får i genomsnitt förhållandet 7:1 SST:PV CIns (figur 2A)15,17. För mer information om effekterna av SHH och tid i kultur på interneuron öde med hjälp av vår dual-reporter mESC linje, se Tyson m.fl. 15

För att berika för PV-ödesbestämd CIns, bör SHH utelämnas från kultur media. Notera, förenligt med kravet på SHH signalering att upprätthålla Nkx2.1 uttryck i mitotiska föräldraparets21, SHH signalering finns i dessa kulturer utan exogena SHH läggs sedan den SHH signalering antagonist cyclopamine eliminerar Nkx2.1 uttryck15. Om cellerna är åter guldpläterade på DD8, denna endogena SHH är dock bort, sådant det SAG (30 nM) bör läggas till media från DD8-10 att upprätthålla Nkx2.1 uttryck och produktionen av CIns. Vår tidigare studie visade att genom att undanhålla SHH från odlingsbetingelserna och sortering för Nkx2.1::mCherry+ celler på DD17, en ~2.6:1 förhållandet av PV:SST celler kan erhållas (figur 2B)15. I motsats till SST subtyper, som är berikad på tidigare stadier och i närvaro av exogena SHH, ökade varaktighet i kultur och avsaknaden av exogena SHH berikar för PV subtyper15. I en senare studie fann vi att aPKCi tillämpas på vårt ”MGE” protokoll avsevärt ökar andelen Nkx2.1::mCherry stamfäder som uttrycker cyklin D217, en markör för mellanliggande progenitor celler22. Detta protokoll variation baserades på vår slutsats som PV-uttryckande CIns härstammar primärt från mellanliggande progenitorceller, SST föräldraparets kommer främst från radiella föräldraparets den ventrikulära ytan23. Vi har funnit att när sorterad och transplanteras i neonatal mus neocortex, dessa stamfäder är kraftigt vinklade för att producera PV-undertyper. Lägga aPKCi från DD8-11 och sedan Sortera Nkx2.1::mCherry celler, kunde vi få förhållandet 5.8:1 PV:SST subtyper (figur 2 c)17. För att ytterligare berika för PV subtyper, har vi också isolerat Nkx2.1::mCherry celler odlade i närvaro av aPCKi från DD8-17. Dock vi inte att uppnå en ökning av förhållandet PV:SST bortom vad vi kunde få på DD11, trots en marginell ökning av andelen PV subtyper genereras (figur 2D). Flödesscheman för var och en av dessa protokoll återfinns i figur 3. Immunfärgning av mus brains 30 dagar efter transplantation med anti-PV, anti-SST och anti-GFP (att förbättra identifieringen av Lhx6::GFP +-celler) antikroppar visar att Lhx6::GFP + celler uppvisar mogen morfologiska egenskaper med mönster av PV och SST uttryck besläktad med sina i vivo motsvarigheter (figur 4 och figur 5).

För att underlätta att avgöra huruvida en CIn differentiering visas framgångsrika, har vi förberett en serie bilder i varje skede av protokollet att Visa normal variabilitet (figur 6, figur 7, figur 8). Vi har även en figur som visar hur en misslyckad differentiering visas på DD4 (figur 9). Misslyckade differentieringar kommer i allmänhet att ge låga nivåer (mindre än 10%) av Nkx2.1 uttryck och procentsatser av Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP induktion av ungefärligt 1% eller mindre.

Figure 1
Figur 1: Generation av Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP interneuron prekursorer. (A) visas här är representativa bilder av immunfärgning för Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) och Lhx6::GFP (GFP) från en differentiering dag 12 (DD12) kultur. Observera att dessa bilder överlappande kanaler från samma synfält. (B) kvantifiering av den genomsnittliga procentandelen DAPI + kärnor som uttrycker Nkx2.1 på DD12 i kultur (n = 3 oberoende differentieringar). (C), representativa FACS tomt visar de fyra olika cellpopulationer som kan isoleras med vår dubbla reporter mESC linje. Observera att mCherry är på x-axeln och god Jordbrukarsed är på y-axeln. Den översta högra rutan utgör därmed, celler som är mCherry/GFP-dubbel positiv. (D) tidsförloppet för Nkx2.1::mCherry och Lhx6::GFP induktion från DD6-16 uttryckt som en procentsats av celler i kultur som är antingen mCherry-bara uttrycker GFP-bara att uttrycka eller mCherry/GFP tillsammans uttrycker. Dessa procentsatser erhölls från celler odlade i närvaro av SHH under ett SST-berikande protokoll och representerar medelvärden från 3 oberoende differentieringar. Felstaplar i (B) och (D) representerar SEM. skala bar = 150 µm (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Manipulation av odlingsbetingelser differentially berikar för PV-kontra SST-ödesbestämd mESC härrör kortikala interneuroner. (A) andel av PV +, SST + och PV- / SST-interneuroner erhålls när DD12, GFP-bara uttrycker celler odlade i närvaro av SHH (50 ng/mL) från DD5-12 transplanteras in i neonatal neocortex och analyserat 30 dagar efter transplantation. (B) andel av PV +, SST + och PV- / SST-interneuroner erhålls när DD17, mCherry-bara att uttrycka celler odlas utan kompletterande SHH är transplanteras i neonatal neocortex och analyserat 30 dagar efter transplantation. (C) andel av PV +, SST + och PV- / SST-interneuroner erhålls när DD11, mCherry-bara uttrycker celler odlade i närvaro av SAG (30 nM. DD8-10) och aPKCi (2 µM; DD8-11) transplanteras in i neonatal neocortex och analyserat 30 dagar efter transplantation. (D) andel av PV +, SST + och PV- / SST-interneuroner erhålls när DD17, mCherry-bara uttrycker celler odlade i närvaro av SAG (30 nM) från DD8-10 och aPKCi (2 µM) från DD8-17 transplanteras in i neonatal neocortex och analyserat 30 dagar efter transplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödesscheman illustrerar de olika PV och SST-berikande protokoll som beskrivs i denna studie. (A) för alla protokoll, stegen fram till början av differentieringen inklusive DD0-5 är identiska. Alla celler odlas som embryoid kroppar från DD0-3 i N2:KSR (1:1) kompletteras med den BMP-hämmare LDN-193189 och den Wnt-hämmaren XAV-939. På DD3, är cellerna ”landade” i N2:KSR (1:1) som innehåller LDN-193189, XAV-939 och den ROCK-hämmaren Y-27632. För att berika för SST-subtyper, läggs SHH DD5-12. Alternativt läggs SHH DD8-12 eftersom vår erfarenhet tillägg av SHH från DD5 kontra DD8 och framåt betydligt inte påverkar förhållandet mellan PV:SST subtyper genereras. Tidigare versioner av protokollet (se Tyson et al. 15) har inte tagit ett nytt bordläggningen steg på DD8 och i stället kompletteras media med exogena SHH på DD5. Detta protokoll har senare ändrats för att införa ett nytt bordläggningen steg på DD8 tillsammans med införandet av SHH, varav ingen påtagligt förändra förhållandet PV:SST. I detta ”hög-SHH” protokoll är Lhx6::GFP +-celler odlas i närvaro av exogena SHH FACS isolerad på DD12 för användning i efterföljande program. (B) för ”låg-SHH” PV-protokollet, exogena SHH samt steget åter bordläggningen på DD8 utelämnas. Istället är Nkx2.1::mCherry+ celler FACS isolerad på DD17 för användning i efterföljande program. (C) för den ”+ aPKCi” PV protokoll, aPKCi läggs tillsammans med SAG från DD8-10 och endast aPKCi läggs från DD10 framåt. På DD11 eller DD17 är Nkx2.1::mCherry celler FACS isolerade för användning i efterföljande program. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: PV och SST immunfärgning i Lhx6::GFP + celler 30 dagar efter transplantation till neonatal neocortex. (A) hög effekt bild av en SST-uttrycker, Lhx6::GFP + cell 30 dagar efter transplantation till neonatal neocortex. Inom varje kolumn av fyra bilder är enda kanal bilder av Lhx6::GFP, PV och SST uttryck med en 3-kanals sammanslagna bilden längst ned. Som visas i den övre panelen, utarbetar denna Lhx6::GFP + neuron flera processer tyder på en mogen morfologi. (B) hög effekt bild av två PV-uttrycker, Lhx6::GFP + celler 30 dagar efter transplantationen. (C) hög effekt bild av en SST- / PV-dubbel negativ, Lhx6::GFP + cell. Även om denna cell utvecklar flera processer överensstämmer med komplett differentiering och kortikala integration, uttrycker inte denna cell tydligt PV eller SST. Observera att det finns en PV + kärnan i anslutning till cellen Lhx6::GFP + men att det inte överlappar. Skala barer = 50 µm (A-C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Medium och låg power bilder av PV, SST och Lhx6::GFP proteinuttryck 30 dagar efter transplantation till neonatal neocortex. (A) medelhög effekt bild av en region av mus neocortex innehåller 30 Lhx6::GFP + celler 30 dagar efter transplantationen. Dessa celler odlades med hjälp av PV-protokollet (+ aPKCi från DD8-11; FACS isolera och transplantera Nkx2.1::mCherry+ på DD11). Av 30 cellerna ses här, 16 express PV, 4 express SST och 10 express varken PV eller SST. (B) låg effekt bild av en region av mus neocortex innehåller många, väl differentierade Lhx6::GFP + celler 30 dagar efter transplantationen. Observera överflödet av Lhx6::GFP + processer coursing hela cortex. Enstaka celler finns också i hippocampus, där de visas att integrera och utveckla processer som överensstämmer med en mogen fenotyp. Skalstapeln = 50 µm (A). 550 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: normala utseende mus embryonala fibroblast feeder lager och odifferentierade stamceller. (A) visas här är 4 X och 10 X förstoring brightfield bilder visar det typiska utseendemässigt av våra mus embryonala fibroblast (MEF) feeder lager 24 h efter bordläggningen. (B) visas här är det typiska utseendemässigt av vår mus embryonala stamceller (mESCs) 2 dagar efter plätering på MEF matare. Observera att kolonierna har en ljusa omkrets och elliptiska eller ovala i utseende. Om kolonierna förlorar denna ljusa omkretsen eller börja skicka yttre projektioner, är detta tecken på att cellerna kan vara att differentiera. (C) visas här är mESCs 1 och 2 dagar efter åter plätering på gelatin överdragna rätter för att späda ut MEF matare före början differentiering. Observera att stamcellerna expandera betydligt efter 48 h på gelatin och börjar återfå en äggformad utseende med en ljusa omkrets. Skalstapeln = 100 µm i 4 X och 10 X foton. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: utseendet på mus embryonala stamceller på differentiering dagar 1 till 7. (A), en dag efter flytande, stammen celler kan ses bildar små embryoid kroppar (EBs). Dag två EBs har vuxit avsevärt. Observera att vissa EBs har klibbat tillsammans och bildat större kluster av celler. Vi tycker inte att detta negativt påverkar differentieringen. Efter 3 dagar, EBs har blivit ännu större och några inte längre överför ljus genom dem. Det är normalt att se cellfragment i bakgrunden. (B) visas här är stamceller 24 h efter landning på differentiering dag 4 (DD4). Observera tätheten av cellerna. Många har börjat utöka små processer, vilket kommer att öka differentieringen fortsätter. Observera här att cellerna är även färgad med små svarta prickar spridda. Om cellerna är blanka eller homogen som förekommer, är det ett tecken på avvikande differentiering. (C) av DD5, cellerna har fortsatt att föröka sig och bilda neurala rosetter. Många celler har utökat långa, tunna processer. (D) av DD7, cellerna bör konfluenta. Det är normalt att se en ”Swiss-ost” mönster, vari stora, platta, Multinucleära celler (möjligen ependymceller eller gliacellerna) skapa cirkulära öar inom ett lager av neurala stamfäder. Ibland gör när cell densiteten är högre än normalt, detta ”schweizerost” mönster inte utveckling, som visas i bilden i mitten. Beroende på differentieringen, kan detta påverka neurala induktion. 4 x och 10 x anger förstoringen. Skalstapeln = 100 µm i 4 X och 10 X foton. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: uppkomsten av differentiering på dagar 9 genom 14. (A) enstaka celler kan visualiseras en dag efter åter plätering. Observera deras bipolär utseende, vilket är typiskt för neurala stamfäder. Kulturen är homogen med några andra infiltrating celltyper. Densiteten är lämpliga för detta steg. (B) av DD11, cellerna har vuxit till en enskiktslager. Liknar tidigare stadier i differentieringen, stora ”ägg-liknande” celler med flera kärnor kan ses interspersed i hela. (C) av DD13 celler har fortsatt att föröka. De kan nu ses bildar små högar. Många ”ägg-liknande” celler är fortfarande närvarande i hela. Från denna punkt framåt visar kulturen bara några få ändringar, med undantag av högarna växer större. 4 X, 10Xx, och 20 X anger förstoringen. Skalstapeln = 100 µm i 4 X och 10 X foton och skalstapeln = 50 µm i 20 X foton. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: uppkomsten av en misslyckad differentiering på dag 4. DD4 är viktigt när det gäller utvärdering av framgången hos en differentiering eftersom det följer ett av de svåraste stegen i protokollet: landning på DD3. Cellerna har DD4 hade 24 h att återhämta sig efter att skiljas från embryoid organ. Som kan ses här, är de flesta av cellerna glänsande och homogen visas. Varvas i hela är enstaka celler som verkar normala, har ett mörkare utseende med små svarta prickar spridda. Dessutom verksamhetsnivåer stora platta celler (som kan ses i den nedre vänstra panelen) avvikande differentiering. I den nedre högra panelen visas minst tre små grupper av celler (gula pilar) som små embryoid kroppar, som anger antingen felaktig differentiering, ofullständig EB dissociation eller dålig följsamhet till ytan av cell kultur plattan. Dessa bilder visas i motsats till de som visas i figur 7B, som skildrar friska, normala celler på DD4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även denna metod är mycket effektiv vid mönstring J1-derived mESCs (SCRC-1010), har vi upplevt varierande framgång med andra mESC linjer och klonal isolat. Exempelvis Foxg1::venus mESCs (EB3-härlett; Danjo o.a. 13) svara dåligt på detta protokoll och Foxg1-induktion av DD12 är vanligtvis storleksordningen 1-2%. Av skäl som vi inte förstår, producerar en annan Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dubbla reporter klon (kallas JQ59) som var isolerad samtidigt som den linje som beskrivs i detta protokoll (kallas JQ27), mindre än 1% Nkx2.1-uttryckande celler när odlas under identiska förhållanden. Linjen överordnade (J1; ATCC SCRC-1010), dock svarar väl till detta protokoll och producerar procentsatser Nkx2.1-uttryckande celler på DD12 liknar de som visas i figur 1B. Vid behov kan koncentrationerna av XAV-939 och SHH/SAG justeras för att optimera villkoren differentiering på grundval av linje. Vår erfarenhet använder det här protokollet differentieras andra mESC linjer till MGE-liknande stamfäder är dock begränsad.

Inte alla Nkx2.1 + celler uttrycker angående vår Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dubbla reporter mESC line, mCherry. Även om nästan alla mCherry +-celler uttrycker Nkx2.1 proteiner, släpar reporter uttryck efter Nkx2.1 proteinuttryck, speciellt under tidiga stadier av differentiering (DD7-9). Fraktionen av Nkx2.1 + celler som uttrycker mCherry stadigt ökar under loppet av differentiering. På toppnivåer (~ DD12-14) mCherry uttrycks i ca 30% av alla Nkx2.1 uttrycker föräldraparets17. Dessutom har samma bakteriella artificiella kromosomen används för att driva mCherry uttryck använts för att köra Cre recombinase i Nkx2.1-uttryck domäner av transgena möss24. I dessa möss, Cre-uttryck var svag inom Nkx2.1-uttryckande celler i regionen dorsal-mest i MGE och öde-mappning med denna mus verkade under etiketten SST-uttryckande CIns som är kända att genereras till stor del från denna region25, 26,27,28. Men trots dessa skillnader, kan miljontals GFP eller mCherry-uttryckande celler isoleras med bara några timmars FACS.

Det finns två huvudsakliga fördelar med denna teknik. Först, i kombination med vår Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje, det är möjligt att få ett stort antal interneuron prekursorer berikad för att bli PV eller SST-ödesbestämd kortikala interneuron undertyper. Den andra stora fördelen är den relativa lätthet med vilken ett stort antal interneuron ödesbestämd celler kan erhållas. Även om det finns flera andra modifierade EB-tekniker för att skilja MGE stamfäder och nervceller, dessa protokoll normalt förlitar sig på användningen av Wnt-hämmande molekyler såsom Dkk113,14,29. Vi har funnit att den Wnt-hämmaren XAV-939 kraftigt förbättrar generationen av pallidal telencephalic progenitorceller, vilket framgår av Foxg1 och Nkx2.1 uttryck15.

Som tidigare nämnts, finns flera andra metoder för att generera MGE-liknande stamfäder från mESCs. Watanabe o.a. 14 pionjärer inom telencephalic differentiering från mESCs genom att vara de första att utveckla ett serumfritt suspension kultur metod följt av nytt plätering på en vidhäftande yta. De fann att de Wnt och Nodal antagonister, Dkk1 och LeftyA, respektive, effektivt körde mESCs in i tidig neuroektodermala härstamningar13. Genom att tillämpa SHH dessa kulturer, de konstaterade att mellan 5-15% av alla celler i kultur samarbete uttryckta Nkx2.1/Foxg1 och kunde betraktas som MGE-liknande föräldraparets13. Men samtidigt lägger grunden för många studier framöver, hade denna studie inte ett sätt att isolera MGE föräldraparets eller berika för viss CIn undertyper.

Flera år senare, Danjo o.a. 13 används samma serumfritt suspension kultur metod i kombination med tidsinställda administrering av olika tillväxtfaktorer, i synnerhet SHH, för att uppnå underregionala specifikation av mESC-derived ventrala telencephalic vävnader. Använda en Foxg1::venus reporter linje, fann de att SHH administrering från DD3-12 efter Dkk1 behandling resulterade mellan 45-68% av alla celler i kulturen att uttrycka Foxg1::venus reporter13. Inom Foxg1::venus + befolkningen uttryckt cirka 32% av cellerna Nkx2.113. Genom att ersätta SHH för SAG och lägga till Fgf8, ökat de ytterligare andelen av Nkx2.1 stamfäder inom Foxg1::venus + befolkningen till cirka 41%13. När analyseras för öde, produceras dessa celler cirka 17% SST, 21% PV, 18% NPY och 8% calretinin subtyper13. Medan denna studie beskrivs en metod för att ange CGE kontra MGE-derived CIn öden, det dock inte beskriver en metod för att selektivt berika för PV eller SST undertyper.

Året därpå Cambray o.a. 11 används en serumfritt enskiktslager metod med nytt plätering på DD5 för att studera effekten av activin på differentiering och identitet av telencephalic neurala prekursorer som härrör från mus och människa ESCs. Även om denna studie inte rapporterade andelen Nkx2.1 celler genereras i sina protokoll, rapporterar de att cirka 54% av celler i kultur tillsammans uttryckt Nestin/Foxg1 på DD2 (5 dagar av tillväxt i serum fria medier följt av ytterligare 2 dagar av kultur efter åter plätering)11. De rapporterade också att med tillägg av activin, ~ 55% av celler tillsammans uttryckt nestin och CouptfII, som anger att dessa celler kan utgöra kaudala ganglieblockerande eminens-liknande celler, som producerar merparten av calretinin-uttryckande kortikala interneuroner 11. Ja, med 8 dagar i kultur (13 dagar totalt) 39% av cellerna befanns Co express calretinin/BIII-tubulin, medan 59% av cellerna hittades tillsammans uttrycka GABA/BIII-tubulin11. Denna studie undersökte inte produktionen av PV eller SST undertyper.

Igen med en modifierad EB metod, Chen et al. 12 visade att MGE-specifika enhancer element kunde användas för att följa och rena stamceller som härrör MGE-liknande celler12. I denna studie jämförde de effekten av olika odlingsbetingelser under riktat differentieringar av mESCs till MGE-liknande föräldraparets använder en Lhx6::GFP reporter linje; samma linje som tjänade som den överordnade raden för raden Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter beskrivs i detta manuskript. De visade att genom att lägga till Dkk1 till kulturen villkor från DD0-3, följt av tillägg av SAG, upwards för ~ 10% av alla celler i kulturen uttryckt Lhx6::GFP12. De fann också att samma protokoll, tillämpas på den Foxg1::venus linjen beskrivs av Danjo o.a. 12, resulterade i ungefär 37% av alla celler som uttrycker Foxg1::venus reporter. När Lhx6::GFP celler var transplanterade i vivo, följande genomsnittliga procentsatserna för CIn subtyp markörer observerades: 22% PV, 58% SST och 16% NPY12.

Mer nyligen, har andra grupper använt uttrycket påtvingad härstamning-definiera transkriptionsfaktorernas att direkt ange CIns. Kanske var den första demonstrationen av detta av Petros o.a. 10 som använt en doxycyklin-inducerbara arrangören för att köra Nkx2.1 uttryck i Ainv15 mESCs som har ändrats för att innehålla en Lhx6::GFP bakteriella artificiella kromosom. Denna studie använde kultur förhållanden liknande dem som beskrivs i det nuvarande manuskriptet, men utan tillsats av XAV-93910. Av skäl som är dåligt känd, observerades dock en lägre andel av Lhx6::GFP + celler på samma villkor differentiering jämfört med när du använder J1 Lhx6::GFP överordnade raden beskrivs i detta manuskript10. Trots att uppnå liknande nivåer av Foxg1 uttryck (totalt % okänd), fanns det en måttlig minskning av det totala antalet Nkx2.1 celler utan större än 2% av alla celler som uttrycker de Lhx6::GFP reporter10. Denna studie belyser de inneboende skillnader som finns mellan olika ESC linjer och utmaningarna som forskare möter när du försöker använda differentiering protokoll till ESC linjerna skiljer sig från dem som användes för att ursprungligen utveckla protokollen.

Med en elegant metod, Au et al. 9 används sekventiell Tvingad uttrycket av transkriptionsfaktorer för att generera specifika subtyper av kortikala interneuroner använder samma ventrala telencephalic differentiering paradigm utvecklats av Watanabe o.a. 14 medan de inte rapporterar de exakta procentandelarna av Foxg1 +, Nkx2.1 + och Olig2 + prekursorer som produceras i kultur, de uppger att ungefär 50% av alla celler i kultur differentieras efter GABAergic nervceller9. Vid 11 dagar efter differentiering, EBs skiljas och transplanteras till MGE av E13.5 värd embryon9. En liten andel av dessa (mindre än 1%) migreras från MGE in i hjärnbarken, där de identifierade genom deras Dlx5/6-andra reporter och analyseras för öde9. Författarna observerade olika procentsatser av PV, SST och CGE-liknande öden utifrån deras valda påtvingad induktion strategi9. Intressant, med uttryck av Transkriptionfaktorn Lmo3, de observerade i genomsnitt cirka 57% PV, 21% SST och 15% CGE-derived subtyper (SST- / reelin + eller VIP-endast +)9. Den största andelen SST subtyper observerade erhölls med en Nkx2.1/Dlx2 GOF-linje, som producerade cirka 32% SST, 35% PV och 25% CGE-derived subtyper9.

I 2015, Colasante o.a. 30 visade att uttrycket påtvingad av fem transkriptionsfaktorer (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 och Lhx6) inom fibroblaster från GAD67-GFP reporter möss omvandlas GABAergic-liknande CIns 15% av alla celler. Anmärkningsvärt, cirka 90% av dessa celler gick på uttrycka PV, med endast sällsynta celler som uttrycker SST30. Även om denna metod inte tillämpades till mESCs, var det används med mänskliga iPSCs, där det uppskattas att cirka 30% av alla celler antas en GABAergic identitet30.

Som visas i figur 2, finns det flera sätt att generera berikad populationer av PV eller SST CIns. De främsta fördelarna med den PV-protokoll utnyttja aPKCi över DD17-protokollet är det större antalet celler som kan isolera, cell livskraft, och varaktigheten av kultur. Även om vi inte visar data för DD17 induktion nivåer i figur 1, det är ungefär dubbelt så många mCherry +-celler vid DD11 som finns på DD17 (inga data anges). När du samlar in celler för transplantation, finner vi att ett större antal start celler (se nedan) är fördelaktigt, eftersom ungefär 30-50% av cellerna är förlorad i processen att koncentrera dem för injektion. Dessutom kan ett större antal celler erhållas med kortare FACS gånger, vilket begränsar mängden tid som cellerna är på is och sänker den totala kostnaden. Förmodligen eftersom en högre andel av cellerna körsbär + är stamfäder, uppvisar celler från tidigare stadier av kultur (t.ex., DD11) ökad överlevnad jämfört med DD17 celler efter transplantation till neonatal neocortex. När det stora antalet livskraftiga celler behövs, är till exempel när det gäller stamcellstransplantation att behandla epilepsi, att ha både en större start befolkning och ökad lönsamhet en stor fördel.

Som avbildas i figur 2, beroende på protokollet, analyserat cirka 25-39% av Lhx6::GFP + celler 30 dagar efter transplantation inte uttrycker detekterbara halter av PV eller SST protein med rutinmässiga immunohistokemi. Generellt, dessa PV - SST-celler Express GABA samt Sox6, en markör för MGE-derived kortikala interneuroner (se Tyson m.fl. 15, Tischfield et al. 17). mindre än 1% av PV- / SST - Lhx6::GFP + celler express markörer för andra interneuron undergrupper, såsom calretinin, reelin eller neuropeptid Y (inga data anges). Detta liknar i vivo öde mappning studier som har visat att mellan ~ 15-25% av MGE-derived interneuroner inte uttrycker PV eller SST23,25,31. När Nkx2.1::mCherry+ eller Lhx6::GFP + celler är isolerade och ströks på råtta kortikala matare i vitro, har vi funnit att ~ 40-70% av Lhx6::GFP +-celler analyseras efter 28 dagar i kultur är PV-/ SST-, med en majoritet av dem som fläcken positiva att uttrycka SST. Denna ökning av PV- / SST-celler kan bero på avsaknad av en yttre maturational signal som är närvarande i vivo, som kan särskilt vara fallet för mogna PV uttryck eller suboptimala elektrofysiologiska input från mataren celler. Oavsett orsaken kan vara, föredrar vi att transplantera celler till neonatal neocortex för öde analys snarare än i vitro differentiering.

För de flesta transplantation experiment, rekommenderar vi flyter på DD0 minst två 10-cm icke-anhängare vävnadsodling rätter varje innehållande 7,5 x 105 mESCs i 10 mL N2/KSR (7,5 x 104 celler/mL, 20 mL total volym). Båda plattorna ger tillsammans, vanligtvis 8-12 x 106 celler efter EB dissociation på DD3, varav 5,4 x 106 celler kan användas till utsäde två 6-väl vävnadsodling behandlade plattor (50 000 celler/cm2, cirka 110 cm2 totalt). Av DD8 ger varje 6-well platta ca 5-7 x 107 celler, som sedan kan användas till utsäde en ytterligare tre till fem 6-väl plattor med en täthet av 250 000 celler/cm2 (som kräver totalt 4,05 x 107 celler när det gäller tre 6-väl plattor eller 6,75 x 107 celler när det gäller fem 6-väl plattor). Genom DD14, kommer varje 6-well platta vanligtvis avkastning 1-2,5 x 106 mCherry eller GFP-uttryckande celler. Beroende på behoven av experimentet, har vi flöt minst 7,5 x 105 mESCs för småskaliga immunohistokemi analyser till uppemot 6 x 106 mESCs för stora transplantation projekt.

De viktigaste stegen i protokollet är att upprätthålla mESCs i pluripotenta stadiet före början differentiering och landning/dissociation steg på DD3. Om cellerna har underhållits korrekt och landning/dissociation på DD3 görs noggrant, kommer differentieringen vanligtvis att lyckas. Endast stamceller som visas friska och bör användas för differentiering. Om EBs inte bildar mellan DD0-3 eller bilda flera, små, asymmetrisk organ, differentieringen sannolikt att misslyckas. Dessutom under EB dissociation på DD3, bör EBS övervakas noga tills inte längre synliga av ögat för att undvika långvarig exponering för icke-trypsin innehållande cell-dissociation regent.

De resultat som presenteras i denna uppsats erhölls under optimerade förhållanden med kvalitetskontrollerade reagens. Detta är viktigt att notera eftersom vi ibland har svårigheter att uppnå robust Nkx2.1 induktion, och i förlängningen, mCherry och god Jordbrukarsed reporter uttryck. Baserat på vår erfarenhet, tror vi att parti-för-parti variabilitet för FBS troligen konton för dessa förändringar. Som sådan, är det klokt att testa olika massor av FBS att avgöra som fungerar bäst för att upprätthålla mESCs. Även om vi inte har använt systemet 2i/LIF (serumfritt medium som innehåller den MEK-hämmare PD03259010 och GSK-3α/β hämmaren CHIR99021), är det möjligt att serumfritt mESC villkor kan ge mer konsekvent resultat. Vi har dock inte testat denna hypotes och har inga uppgifter om huruvida användning av serumfritt mESC media påverkar differentieringen av mESCs till MGE-liknande stamfäder. Dessutom måste du använda färsk tillväxtfaktorer när det är möjligt av alikvotering dem för engångsbruk. Beroende på användaren, kan cell tätheter behöva ökas för att uppnå tillräcklig cellöverlevnad, särskilt under landning steg på DD3.

Interneuroner har en anmärkningsvärd förmåga att överleva, migrera och integrera i värd-kretsar efter transplantation. Som sådan, detta protokoll kan användas för att transplantera interneuron prekursorer till epileptiska mus och andra modeller av neurologiska och neuropsykiatriska sjukdomar (se Southwell o.a. 32 och Tyson och Anderson33 för recensioner av interneuron cell baserat terapier). Till exempel i en färsk studie Donegan o.a. 34 berikad populationer av PV och SST CIns för transplantation till en musmodell av schizofreni. De fann att PV och SST berikad transplantationer produceras olika effekter på mus beteende, med PV berikad populationer normalisera de schizofreni endofenotyper som de studerade.

Under de senaste åren har PiggyBac transposon systemet använts för att uppnå stabil uttryck av transgener i ett antal system. Vi har använt detta system för att snabbt och enkelt skapa stabilt uttrycker doxycyklin-inducerbara miRNA konstruktioner för att studera vissa gener roll under interneuron utveckling. Vi är också med denna teknik för att skapa dubbla reporter mESC rader som uttrycker channelrhodopsin-2 (ChR2) till optogenetically enhet mESC framställda interneuroner eller DREADD receptor-teknik för att aktivera eller inaktivera transplanterade celler i massor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Qing Xu för att utveckla den Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dubbla reporter mESC linje och Jennifer Tyson, Asif Maroof, samt Tim Petros för deras tidiga arbete med att hjälpa till att utveckla detta protokoll. Vi tackar också CHOP flöde flödescytometri kärnan för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av en NIH R01 MH066912 (SA) och F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Neurovetenskap fråga 130 hjärnan mus interneuron differentiering cortex cellodling stamceller transplantation
Differentiering av mus embryonala stamceller till kortikala Interneuron prekursorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter