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Immunology and Infection

Avidin-बायोटिन प्रणाली के साथ गैर आनुवंशिक सतह सजावट के माध्यम से माइकोबैक्टीरियम bovis बीसीजी वैक्सीन में Exogenous एंटीजन की अभिव्यक्ति

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

एक जीवाणु की सतह पर तेजी से प्रतिजन प्रदर्शन के लिए एक उपंयास तकनीक प्रस्तुत किया है, जो सतह biotinylation monomeric avidin के साथ संलयन में ब्याज की प्रोटीन के लिए जोखिम के बाद शामिल है । चयनित प्रतिजनों के साथ बीसीजी लोड हो रहा है सफलतापूर्वक अपनी immunogenicity में सुधार, सुझाव है कि सतह सजावट पारंपरिक आनुवंशिक दृष्टिकोण बदल सकते हैं ।

Abstract

तपेदिक (टीबी) एक गंभीर संक्रामक रोग है और केवल उपलब्ध वैक्सीन एम. bovis बैसिलस Calmette-Guérin (बीसीजी) सुरक्षित और बच्चों की गंभीर टीबी दिमागी बुखार और प्रसार किया टीबी के कुछ रूपों के खिलाफ संरक्षण के लिए प्रभावी है, लेकिन की रक्षा करने में विफल रहता है फुफ्फुसीय टीबी के खिलाफ, जो रोग का सबसे प्रचलित रूप है । होनहार रणनीतियों में सुधार करने के लिए वर्तमान में या तो immunodominant एम. तपेदिक (एमटीबी)-विशिष्ट प्रतिजनों और/या प्रतिजन को उत्तेजित करेगा कि सह कारकों कूटबंधन जीन के साथ पूरक के जीन के साथ अपने परिवर्तन पर भरोसा कक्ष प्रस्तुत कर रहा है । इन तरीकों के लिए प्रमुख सीमाएं कम दक्षता, कम स्थिरता, और अभिव्यक्ति वैक्टर की सुरक्षा के अनिश्चित स्तर शामिल हैं । इस अध्ययन में, हम वैक्सीन सुधार के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो plasmids एंकोडिंग इसी जीन के साथ परिवर्तन के बजाय बैक्टीरिया की सतह पर ब्याज की exogenous प्रोटीन के साथ बीसीजी पूरकता के होते हैं । सबसे पहले, ब्याज की प्रोटीन मानक ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रणालियों में monomeric avidin के साथ फ्यूजन में व्यक्त कर रहे है और फिर biotinylated बीसीजी की सतह को सजाने के लिए इस्तेमाल किया । पशु प्रयोग बीसीजी सतह का उपयोग कर सरोगेट ovalbumin प्रतिजन के साथ सजाया प्रदर्शित करता है कि संशोधित जीवाणु पूरी तरह से immunogenic और विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण में सक्षम है । कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत डेटा दृढ़ता से एक उपंयास और वर्तमान बीसीजी वैक्सीन कि exogenous न्यूक्लिक एसिड के साथ पूरकता के श्रमसाध्य पारंपरिक दृष्टिकोण की जगह देने के लिए कुशल विधि का समर्थन करते हैं ।

Introduction

विभिंन रणनीतियों वर्तमान टीबी वैक्सीन बीसीजी की जगह प्रस्तावित किया गया है, जिसमें प्रोटीन सहायक सिस्टम, वायरल वैक्टर प्रौद्योगिकियों, तनु जी एम टीबी उपभेदों, और आनुवंशिक रूप से संशोधित बीसीजी उपभेदों, या तो जीन परिचय अधिक-व्यक्त बीसीजी एंटीजन संक्रमण के दौरान पर्याप्त रूप से व्यक्त नहीं कर रहे हैं कि1 या एमटीबी-विशिष्ट एंटीजन में बीसीजी2मौजूद नहीं है. आनुवंशिक इंजीनियरिंग, हालांकि, सुरक्षा के अनिश्चित स्तर, समय लेने वाली प्रक्रिया, और अभिव्यक्ति की कम क्षमता वैक्टर4,5सहित कई बाधाओं का सामना । साथ बीसीजी में सुधार करने का संबंध है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए अनिश्चित आनुवंशिक प्रत्यावर्तन की आवश्यकता के बिना immunogenicity में सुधार की जरूरत है ।

इस अध्ययन में, हम बीसीजी कोशिका की सतह पर ब्याज की संयोजक प्रोटीन के प्रदर्शन के लिए एक उपंयास रणनीति है कि अच्छी तरह से जाना जाता उच्च संबंध avidin के साथ संपर्क पर आधारित है परिचय । इस दृष्टिकोण biotinylated बीसीजी की सतह पर संयोजक avidin फ्यूजन प्रोटीन की तेजी और प्रतिलिपि लगाव की अनुमति देता है, जो बीसीजी के व्यापक जोड़तोड़ की सुविधा को अपनी उत्कृष्ट सुरक्षा बनाए रखते हुए इसकी प्रभावकारिता में अधिक से अधिक सुधार प्राप्त करने के लिए रिकॉर्ड, उपयोग के दशकों में मनाया ।

बायोटिन के लिए Avidin संबध अत्यंत उच्च है (Kd = 10− 15 एम) और एक बार गठित, बायोटिन-Avidin जटिल बहुत स्थिर है और केवल denaturing शर्तों के तहत बाधित किया जा सकता है6. हालांकि, इस प्रकार की बातचीत के लिए एक जीन हस्तांतरण विधि वैकल्पिक, दीर्घकालिक लेकिन संयोजक प्रोटीन की प्रतिवर्ती प्रदर्शन के रूप में सेवा के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, हम यहां पेश एक कम अपनत्व monomeric avidin (Kd = 10− 7 एम) कि प्रोटीन की प्रतिवर्ती रिहाई की ओर जाता है सतह से सजाया बीसीजी एक बार के अंदर किया जाता है प्रतिजन कोशिकाओं को पेश । आदेश में अवधारणा का सबूत प्रदान करने के लिए, हम इस विधि का परीक्षण एक monomeric avidin chimeric प्रोटीन एक किराए ovalbumin (ओवा)7,8से व्युत्पंन प्रतिजन के लिए इसी का उपयोग कर । परिणामों से पता चला कि बीसीजी सेल की सतह को आसानी से और तेजी से monomeric avidin फ्यूजन प्रोटीन के साथ सजाया जा सकता है और यह है कि बीसीजी सतह के लिए बाध्यकारी बैक्टीरियल विकास और अस्तित्व में detectable परिवर्तन के बिना स्थिर और प्रतिलिपि है । इसके अलावा, हमने पाया है कि बीसीजी के साथ monomeric avidin के साथ जुड़े ओवा (AviOVA) एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समान प्रेरित कर सकते है कि बीसीजी आनुवंशिक रूप से दोनों विट्रो में और vivo मेंएक ही प्रतिजन व्यक्त करने के लिए । बैक्टीरियल सतह पर ब्याज की प्रोटीन के प्रतिवर्ती प्रदर्शन की यह तकनीक इसलिए पारंपरिक जीन हस्तांतरण के दृष्टिकोण का एक प्रभावी प्रतिस्थापन है और बीसीजी के व्यापक जोड़तोड़ और वैक्सीन में आगे अनुप्रयोगों के लिए एक मंच प्रदान कर सकते है विकास.

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Protocol

सभी जानवरों को ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार बनाए रखा गया था । प्रयोगों पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित और पशु देखभाल दिशानिर्देश पर कनाडा परिषद के अनुसार प्रदर्शन किया गया । पशु आश् वासन कल् याण संख् या A11-0247 है ।

1. जनरेशन ऑफ Monomeric Avidin फ्यूजन प्रोटीन्स Plasmids व्यक्त

  1. उप क्लोन monomeric avidin अनुक्रम12 में pDEST17 प्लाज्मिड के बीच "सीटीसी" और "गाा" साइटों जो 133 से मेल खाती है-134bp. (यानी, 6-histag और pDEST17 Attr1 पुनर्संयोजन साइट के बीच) p17-Avi प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: monomeric avidin डीएनए अनुक्रम नीचे दिखाया गया है । monomeric Avidin प्राप्त करने के लिए वाइल्ड-टाइप Avidin में शुरू किए गए तीन उत्परिवर्तनों को निर्भीक अक्षरों में दिखाया गया है ।
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc टीसीसीएटीसीatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTएसीसी atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acएएएaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. डिजाइन AttB1 और AttB2 पॉलीपेप्टाइड के लिए इसी के साथ पार्श्व अस्तर757-1035 (I-Abऔर H-2kb-प्रतिबंधित epitopes) डीएनए अनुक्रम । प्राइमरी जुगाड़ हैं: Attb1-ओवा
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT आणि Attb2-ओवा
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC । (Attb1 और Attb2 अनुक्रम बोल्ड कर रहे हैं) ।
    1. पीसीआर-बढ़ाना ओवा पॉलीपेप्टाइड757-1035 डीएनए अनुक्रम के ऊपर प्राइमरों के साथ एक टेम्पलेट के रूप में pUC57-ओवा प्लाज्मिड का उपयोग कर.
    2. एक साइट के माध्यम से pDONR-२२१ में पीसीआर उत्पादों क्लोन-विशेष इन विट्रो पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया (जैसे, बीपी Clonase) pDONR-ओवा प्राप्त करने के लिए ।
  3. p17 में ब्याज की जीन स्थानांतरण-avi LR Clonase प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए p17-avi-ओवा प्राप्त करते हैं ।
    नोट: बीपी और एलआर पुनर्संयोजन क्लोनिंग के विवरण के लिए, निर्माता के मैनुअल देखें ।

2. Monomeric Avidin फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धि, और खुलासा

  1. ई. कोलाई BL21 में p17-Avi-ओवा प्लाज्मिड को बदलने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए IPTG (०.१ एम) के साथ ई. कोलाई BL21 संस्कृति के २५० मिलीलीटर प्रेरित ।
  2. बैक्टीरिया और समावेशी निकायों की Lysis Solubilization
    1. ४,००० x g पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक के 30 मिनट से प्रेरित BL21 संस्कृति के २५० मिलीलीटर गोली ।
    2. lysis बफर के 10 मिलीलीटर (५० मिमी Tris-एचसीएल, १५० मिमी NaCl, 6 एम Guanidine-एचसीएल, पीएच 1.5-2.5) में छर्रों ले लीजिए और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन । एक रोटेटर पर कमरे के तापमान पर रात भर गर्मी ।
    3. १५,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के केंद्रापसारक और supernatant इकट्ठा ।
  3. Ni-NTA स्तंभों का उपयोग करके Supernatant (Solubilized समावेशी शरीर अंश) से Avi-ओवा को शुद्ध करना.
    1. lysis बफर के साथ शामिल शरीर 1:2 पतला ।
    2. संस्कृति-व्युत्पन्न समावेशी निकायों के २५० मिलीलीटर प्रति नी-NTA राल का 4 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    3. lysis बफर (पीएच ७.०) के 10 मिलीलीटर के साथ 3x धो लें ।
    4. Elute के साथ 10 एमएल का रेफरेंस बफर (lysis बफर नं० ७.० के साथ २५० एमएम imidazole) ।
  4. क्रमिक कमजोर पड़ने (1:10) और Tris बफर (पीएच ७.५) 1 मिमी डीटीटी, २०० मिमी NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio) propanesulfonate), ०.५ मिमी के बीच ८०, ५०० मिमी arginine, और 30 मिनट के लिए २०० मिमी NaCl में तेजी से भंवर से eluted प्रोटीन reफ़ोल्ड कमरे के तापमान पर ।
  5. De-नमक और बफर एक्सचेंज ने निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन संकेंद्रकों के साथ Tris बफर से पंजाब में प्रोटीन का फिर से खुलासा किया ।
  6. ३,५०० x g और 4 ° c पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा समुच्चय निकालें, और-20 डिग्री सेल्सियस पर घुलनशील प्रोटीन की दुकान aliquots ।

३. बीसीजी कक्ष की सतह का Biotinylation

  1. 10% OADC (ओलिक एसिड, एल्ब्युमिन और डेक्सट्रोज समाधान) और ०.०५% के बीच ८० पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर मंच पर ५० rpm तक Middlebrook 7H9 शोरबा में बीसीजी = 0.5-1 ।
    नोट: बीसीजी एक सुरक्षा स्तर 2 रोगज़नक़ है और बीसीजी के विषय में सभी प्रयोगों उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए ।
  2. धो 109 बीसीजी बर्फ के ५०० µ एल के साथ 3 बार-शीत endotoxin मुक्त पंजाबियों प्लस ०.१% Tween80 (PBST) (पीएच ८.०) । स्थगित बीसीजी गोली बाँझ endotoxin मुक्त पंजाबियों में ।
  3. तुरंत उपयोग करने से पहले, 10 मिमी Sulfo के 1 मिलीलीटर-बाँझ फ़िल्टर्ड पानी में एन एच एस एसएस बायोटिन तैयार.
    1. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Sulfo-एन एच एस एसएस बायोटिन की ०.५ मिमी के 1 मिलीलीटर के साथ बैक्टीरिया की मशीन ।
  4. धो ५०० ठंडी ठंड PBST के µ एल के साथ बैक्टीरिया 3 बार लेबल को हटाने के लिए गैर प्रतिक्रिया व्यक्त biotinylation reagent ।
    1. PBST के 1 मिलीलीटर में फिर से गोली सस्पेंड ।
  5. biotinylation दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Streptavidin-FITC (1:100, 25 µ l) के साथ दाग 108 biotinylated बीसीजी ।
    1. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 2% पीएफए के 1 मिलीलीटर में सना हुआ बैक्टीरिया की मशीन और फिर प्रवाह cytometry विश्लेषण के द्वारा biotinylation के स्तर की जांच ।

4. Phenotype of Biotinylated आइसोलेटों: विकास और उत्तरजीविता

  1. 10% OADC (ओलिक एसिड, एल्ब्युमिन और डेक्सट्रोज समाधान) और ०.०५% के बीच ८० पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर मंच पर ५० rpm में Middlebrook 7H9 शोरबा में बीसीजी उपभेदों बढ़ने ।
    1. एक 8 दिन की अवधि में बैक्टीरियल संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो६००) रिकॉर्ड ।
  2. मैक्रोफेज में जीवाणुओं के अस्तित्व का पता लगाने के लिए बीसीजी-ल्यूक (पहले वर्णित9) का उपयोग करें ।
    1. biotinylated बीसीजी-ल्यूक (मुि 10:1) या अनुपचारित बीसीजी-ल्यूक (नियंत्रण) के साथ कच्चे 264.7 कोशिकाओं को संक्रमित और ४८ एच समय अवधि में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    2. धो सेल monolayers और फिर ०.०२५% एसडीएस के साथ लाइसे के लिए घूस बैक्टीरिया रिलीज ।
    3. Luciferase परख प्रणाली और luminometer के साथ bioluminescence उत्पादन उपाय ।
      नोट: Luminescence संकेत बैक्टीरियल व्यवहार्यता का संकेत है । कृपया luciferase परख के विवरण के लिए निर्माता के मैनुअल को देखें ।

5. Monomeric Avidin-फ्यूजन प्रोटीन से Biotinylated बीसीजी सतह का बंधन

  1. मिश्रण 5 x 108 biotinylated बीसीजी के साथ Avi-प्रोटीन (10 μg/एमएल फाइनल में पंजाब-टी) के लिए 1 ज पर कमरे के तापमान पर शेखर मंच ।
  2. ठंडी ठंडी PBST के ५०० µ एल के साथ बैक्टीरिया 3 बार धोने और खरगोश विरोधी avidin एंटीबॉडी (अटल बिहारी) (1:100 कमजोर पड़ने के साथ दाग, पहले10वर्णित) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए और फिर FITC संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एबी के साथ एक ही परिस्थितियों में ।
  3. PBST के ५०० µ एल के साथ बैक्टीरिया 3 बार धो और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण करने के लिए सतह सजावट की हद का मूल्यांकन ।

6. Lyophilization of आइसोलेटों

  1. Biotinylate बैक्टीरिया के अनुसार कदम 3.1-3.4 और कोट biotinylated बैक्टीरिया के साथ Avi-ओवा चरण ५.१ के अनुसार.
  2. Aliquot biotinylated और लेपित बैक्टीरिया (108), पंजाबियों के साथ धो और ०.५ मिलीलीटर lyophilization मीडिया में फिर से निलंबित (25% Sauton मध्यम, ७५% एच2ओ, और १.५% ना-ग्लूटामेट) ।
  3. कांच की शीशियों के लिए स्थानांतरण बैक्टीरिया और एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर फ्रीजर ।
  4. Lyophilize भरा और जमे हुए कांच की शीशियों के लिए 24 एक फ्रीज ड्रायर का उपयोग कर एच ।
  5. कमरे के तापमान पर सूखे नमूनों की दुकान और जरूरत पड़ने पर पंजाब में पुनर्गठन ।
  6. दोहराएँ चरण ३.५ biotinylation और सतह कोटिंग स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए.

7. Phagocytosis परख

  1. DMEM मध्यम में 10 सेमी व्यास संस्कृति व्यंजन में कच्चे २६४.७ macrophage कोशिकाओं को विकसित 5% FCS, 1% एल के प्रत्येक-glutamine, HEPES, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और पेनिसिलिन और streptomycin तक 70-80% तक प्रवाह ।
  2. बीज 2 x 106 कच्चे २६४.७ macrophage कोशिकाओं में एक 6-अच्छी तरह से थाली । ३७ ° c और 5% CO2पर रात भर का पालन करने के लिए कक्षों की अनुमति दें ।
  3. DsRed बीसीजी उत्पन्न (पहले वर्णित9) Avi-ओवा (DsRed बीसीजी-avi-ओवा) से सजाया कदम 3.1-3.4 और ५.१ के अनुसार ।
  4. DsRed बीसीजी-Avi-ओवा या अनुपचारित DsRed बीसीजी के साथ संक्रमित कच्ची कोशिकाओं को मुि 20:1 पर 24 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
  5. कोशिकाओं को धो तीन बार और trypsinize ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.२५% trypsin के 1 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए 10 मिनट के लिए आंशिक रूप से अलग बैक्टीरिया को दूर ।
  6. पंजाब में २.५% पीएफए में फिक्स कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ।
  7. पंजाब के साथ 3x धो और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण ।

8. Intracellular के नलए ओवा सजाया Biotinylated बीसीजी का मैक्रोफेज मे

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
    1. बीज 3 x 105 कच्चे २६४.७ macrophage कोशिकाओं में coverslips पर एक 24 अच्छी तरह से प्लेट । ३७ ° c और 5% CO2पर रात भर का पालन करने के लिए कक्षों की अनुमति दें ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एंटीबायोटिक दवाओं के बिना रखरखाव मीडिया में आइसोलेटों (मुि 10:1) के साथ macrophage कोशिकाओं को संक्रमित और 4 से 24 एच के लिए 5% सह2
    3. धो कोशिकाओं और trypsinize सतह को हटाने के लिए संलग्न, गैर घूस बैक्टीरिया के रूप में ७.५ कदम में ।
    4. २.५% पीएफए में संक्रमित कोशिकाओं को ठीक करने के लिए पंजाब में 20 मिनट के बाद कमरे के तापमान पर पंजाबियों के साथ 3 बहाकर ।
    5. Permeabilize कक्ष के तापमान पर 20 मिनट के लिए ब्लॉक/permeabilization बफर (०.१% ट्राइटन X-१००, पंजाब में 3% BSA) में कोशिकाओं ।
      1. ब्याज की विशिष्ट एंटीबॉडी का प्रयोग करें (उदा., खरगोश विरोधी avidin Ab) permeabilization बफर में 10 μg/एमएल में 20 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, FITC-बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी) के बाद 20 मिनट के लिए ।
    6. एक बार पानी के साथ, और प्रतिदीप्ति photobleaching को कम करने के लिए जलीय बढ़ते मध्यम के 10 μL में स्लाइड पर माउंट, पंजाब के साथ 3x कोशिकाओं धो लें ।
    7. 63x/1.4 योजना-Apochromat उद्देश्य से सुसज्जित एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर डिजिटल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा स्लाइड की जांच करें । रिकॉर्ड एक डिजिटल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर करने के लिए युग्मित कैमरा का उपयोग छवियों ।
  2. Immunogold धुंधला और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
    1. बीज 2 x 106 कच्चे २६४.७ 6-अच्छी तरह से प्लेटों में macrophage कोशिकाओं ।
    2. फिक्स बीसीजी कमरे के तापमान में 4 एच के लिए 4% पीएफए के साथ संक्रमित मैक्रोफेज ।
    3. पंजाबियों के साथ दो बार नमूने धो लें ।
    4. 4% कम पिघल बिंदु agarose में नमूने एंबेड, और ७०% इथेनॉल में निर्जलीकरण ।
    5. ५० डिग्री सेल्सियस पर एक्रिलिक राल और polymerize के लिए नमूने स्थानांतरण ।
    6. एक microtome के साथ बाहर कट ६० एनएम वर्गों और निकल ग्रिड पर वर्गों को इकट्ठा ।
    7. 10 μg/एमएल avidin एंटीबॉडी के साथ लेबल नमूनों के लिए 1 घंटे में कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी समाधान में रातोंरात (पंजाब और ०.१% BSA) और फिर से धो मशीन समाधान गोल्ड-संयुग्मित एफ (ab ')2 अल्ट्रा-छोटे बकरी-विरोधी खरगोश आईजीजी (1/20) के लिए 1 घंटे के कमरे में गर्मी समाधान में तापमान ।
    8. आसुत जल में वर्गों धो, 2% glutaraldehyde में दाग, फिर से धोने, हवा सूखी, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ की जांच ।

9. पशु प्रतिरक्षण और अंग संसाधन

नोट: सभी कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए ।

  1. पास biotinylated और प्रोटीन लेपित बैक्टीरिया के माध्यम से 271/2G सुई 10 बार एकल सेल निलंबन करने के लिए ।
  2. endotoxin-मुक्त पंजाबियों के १०० μL में 1 x 106 बैक्टीरिया ले लो और छुटकारा एक महिला C57BL/6 चूहों (I-ab, H-2kb, 5-6 सप्ताह पुराने) गर्दन के कूड़ा में चमड़े के नीचे ।
    1. अकेले पंजाबियों के १०० μL के साथ नियंत्रण चूहों सुई.
  3. Euthanize प्रतिरक्षित चूहों 20 दिनों के बाद सह द्वारा प्रतिरक्षण2 साँस लेना ग्रीवा विस्थापन के बाद.
    1. तिल्ली को अलग और RPMI मीडिया में स्थानांतरण.
  4. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के साथ एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से मैश तिल्ली ।
    1. RPMI के 5 मिलीलीटर से धो लें । एक एकल सेल निलंबन को अलग करने के लिए (८०० x g, 3 मिनट) केंद्रापसारक ।
    2. Ter119/Erythroid कोशिकाओं एबी के साथ माउस बायोटिन सकारात्मक चयन किट के साथ चूस आरबीसी ।
    3. पूर्ण RPMI के 10 मिलीलीटर (10% FCS, 1% L-glutamine, 1% पेनिसिलिन, 1% streptomycin, और ५० माइक्रोन 2-ME) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करना ।

10. I-Ab tetramer की आवृत्तियों को निर्धारित करने के लिए antigen-विशिष्ट सीडी+ t कक्षों और Intracellular Cytokine की आवृत्तियों को निर्धारित करने के लिए धुंधला कर antigen-विशिष्ट T साइटोकिंस पशुओं में प्रतिरक्षित जारी कोशिकाओं

  1. Tetramer धुंधला
    1. दाग splenocytes से कंट्रोल और प्रतिरक्षित चूहों (~ 20 x 106 कोशिकाओं) के साथ पे-संयुग्मित I-Ab-ओवा323-339 1 ज के लिए tetramers (1/12.5 कमजोर पड़ने) बाध्यकारी बफर में ३७ ° c (पंजाब 2% FCS और ०.१% नण य3) के साथ ।
    2. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए splenocytes के लिए AF647 सीडी एबी (1:25) और 7-AAD (मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए) जोड़ें ।
    3. प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण ।
    4. tetramer सकारात्मक घटनाओं की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए सीडी सकारात्मक क्षेत्र में ५००,००० घटनाओं का अधिग्रहण ।
      नोट: कुल splenocytes 7-AAD सकारात्मक घटनाओं के अपवर्जन द्वारा एसएससी/FSC डॉट दाग, जीवित कोशिकाओं द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, और गेटिंग AF647 सकारात्मक घटनाओं द्वारा सीडी सबसेट ।
  2. की आवृत्ति Antigen विशिष्ट Intracellular Cytokine रिलीज़ T कक्ष
    1. लगभग 1 × 107 splenocytes में पूर्ण RPMI मध्यम के 4 मिलीलीटर में स्थानांतरण छह अच्छी तरह से प्लेटें के साथ या बिना संयोजक ओवा (10 µ g/एमएल) और 16 एच के लिए मशीन ।
    2. एक अतिरिक्त 5 एच के लिए Brefeldin एक (1:1000) के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
    3. पंजाबियों और intracellular cytokine धुंधला के अधीन के रूप में इस प्रकार से धो लें:
      1. दाग सेल नमूनों के साथ पीई-सीडी या पीई-Cy7-सीडी Ab (1:50 बाइंडिंग बफ़र में) कमरे के तापमान में 30 मिनट के लिए ।
      2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% पीएफए में फिक्स ।
      3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार permeabilization समाधान का उपयोग Permeabilize ।
      4. कक्ष के तापमान पर 20 मिनट के लिए AF647-संयुग्मित IFN-γ Ab (1:50) के साथ कोशिकाओं और लेबल को धो लें ।
      5. ऊपर वर्णित के रूप में कोशिकाओं को धोने और cytometry विश्लेषण प्रवाह के अधीन ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित सामान्य प्रक्रियाओं के साथ, बीसीजी सतह biotinylation और सरोगेट प्रतिजन ओवा के साथ सजावट की व्यवहार्यता की जांच की गई । इसके बाद संशोधित बीसीजी का immunogenicity वीवो मेंपरीक्षण किया गया । बैक्टीरियल सतह आसानी से बैक्टीरियल phenotypes में किसी भी जासूसी परिवर्तन के बिना avidin chimeric एंटीजन के तेजी से प्रदर्शन के लिए बायोटिन के साथ लेबल किया गया था । परिणामी संशोधित बीसीजी कुशलतापूर्वक antigen प्रस्तुति कक्षों द्वारा किया जाता है और चूहों में एक ओवा-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा कर सकते हैं ।

monomeric avidin फ्यूजन plasmids और प्रोटीन की जनरेशन
एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड p17-Avi गेटवे पद्धति के साथ संगत होने के लिए monomeric avidin फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा उत्पन्न किया गया था. ओवा p17-Avi में क्लोन और ई. कोलाईमें व्यक्त किया गया था, तो शुद्ध और ( चित्रा 1) ऊपर वर्णित के रूप में सामने आया ।

बायोटिन बैक्टीरिया की सतह को कुशलतापूर्वक जोड़ देता है और जीवाणु विकास या अस्तित्व को प्रभावित नहीं करता
बैक्टीरिया विभिन्न सांद्रता (0-1 मिमी) के साथ लेबल किए गए बायोटिन और ऊपर प्रोटोकॉल के अनुसार सतह biotinylation की दक्षता की जांच करने के लिए दाग. प्रवाह cytometry विश्लेषण ०.५ mM बायोटिन (चित्रा 2) के साथ लेबल बैक्टीरिया में प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम की कुल बदलाव दिखाया, और इस एकाग्रता biotinylated बैक्टीरिया उत्पन्न करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. अगले, हम बैक्टीरियल phenotype पर बैक्टीरियल सतह संशोधन के प्रभाव की जांच की और पाया कि biotinylated और नियंत्रण अनुपचारित बीसीजी एक 8 दिन की अवधि (चित्रा 3) से अधिक एक समान विकास प्रोफ़ाइल प्रदर्शित । मैक्रोफेज में बैक्टीरियल उत्तरजीविता की जांच के लिए बीसीजी एक्सप्रेस luciferase (बीसीजी-ल्यूक)9 का प्रयोग किया गया. Luminescence संकेत बैक्टीरियल व्यवहार्यता का संकेत ४८ पर दर्ज किया गया था एच परिणाम प्राप्त biotinylated और नियंत्रण जीवाणुओं के बीच क्रमिक व्यवहार्यता कमी के समान प्रोफाइल दिखाया (चित्र बी) । अंत में, इन आंकड़ों को स्पष्ट रूप से संकेत मिलता है कि बैक्टीरियल सतह biotinylation या तो बैक्टीरियल विकास या मैक्रोफेज, जो महत्वपूर्ण है के अंदर अस्तित्व को प्रभावित नहीं करता है मैक्रोफेज में वृद्धि हुई अस्तित्व जीवाणु डाह में वृद्धि का मतलब सकता है ।

बैक्टीरियल सतह सजावट की क्षमता
Biotinylated बैक्टीरिया monomeric avidin के साथ फ्यूजन में ओवा प्रतिजन पेप्टाइड के साथ लेपित थे, ऊपर प्रोटोकॉल के अनुसार । प्रवाह cytometry विश्लेषण गैर-biotinylated बैक्टीरिया (mfi = ८.३१ ± ०.४२, चित्रा 4a, शीर्ष पैनल) और biotinylated बैक्टीरिया को ओवा बंधन का महत्वपूर्ण स्तर के लिए बाध्यकारी के ंयूनतम स्तर दिखाया (mfi = ५४.६७ ± ४.९८) नियंत्रण जीवाणु की तुलना में (mfi = ५.९२ ± ०.२२, चित्रा 4a, लोअर पैनल) ।

बीसीजी सतह सजावट की स्थिरता
के बाद से पारंपरिक जीवित बीसीजी टीके सूख पाउडर के रूप में तैयार कर रहे हैं, एक महत्वपूर्ण सवाल है कि इस अध्ययन के दौरान पैदा हुई संशोधित बीसीजी की स्थिरता फ्रीज सुखाने, पुनर्गठन के बाद था, और प्रशीतित या कमरे के तापमान पर भंडारण । इसलिए, हम lyophilized बीसीजी avi-ओवा (सतह avi-ओवा के साथ सजाया) और हौसले से सजाया बैक्टीरियल तैयारी में avi-ओवा की सतह प्रदर्शन की जांच की । परिणाम (चित्रा 4B) से पता चला है कि बैक्टीरिया की सतह पर Avi-ओवा का स्तर स्थिर और detectable एक महीने के बाद lyophilization और ताजा बीसीजी Avi-ओवा की तैयारी की तुलना में कमरे के तापमान में भंडारण, जो साबित कर दिया कि इस सतह सजावट विधि वैक्सीन के विकास के लिए उपयुक्त है ।

Macrophage phenotype बैक्टीरियल सतह सजावट से प्रभावित नहीं है
यह देखने के लिए कि क्या इस सतह सजावट पद्धति मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया की प्रविष्टि के साथ हस्तक्षेप, हम कच्चे 264.7 कोशिकाओं और DsRed बैक्टीरिया9 उपयोग के लिए एक phagocytosis ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित परख प्रदर्शन करते हैं । चित्र 4c से पता चला है कि बैक्टीरियल सतह सजाया बीसीजी बैक्टीरियल प्रवेश के साथ महत्वपूर्ण हस्तक्षेप नहीं किया है (२२.५ ± १.५७%) unmacrophage जंगली प्रकार बीसीजी की तुलना में (२४.४७ ± १.१८%) का संकेत है कि बीसीजी की सतह सजावट पर कोई प्रभाव नहीं है phenotype.

Avidin फ्यूजन प्रोटीन यात्रा intracellularly और सह MHC अणुओं के साथ information
की जांच करने के लिए Avi-ओवा-सजाया बीसीजी के भाग्य मैक्रोफेज के भीतर, अनुयाई कच्चे कोशिकाओं को संक्रमित किया गया और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की, के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित. प्राप्त छवियों (चित्र 5 ए) से पता चला है कि Avi-ओवा न केवल जीवाणु की सतह पर मौजूद था, बल्कि कोशिका दूर तक बैक्टीरिया को अलग और translocated भी करता था. आगे इस परिणाम की पुष्टि करने के लिए, हम एक immunogold धुंधला प्रयोग प्रदर्शन किया और छवियों को स्पष्ट रूप से पता चला है कि Avi-ओवा एंटीजन केवल बीसीजी सतह पर मौजूद नहीं हैं, लेकिन यह भी बीसीजी सतह से अलग कर सकते हैं, phagosomal झिल्ली पार, और यात्रा cytosol (चित्रा 5B) की ओर । आगे की जांच करने के लिए कि क्या avi-ओवा सजाया बैक्टीरिया उनकी सतह प्रोटीन कार्गो प्रतिजन प्रस्तुति मार्ग को देने में सक्षम थे, मैक्रोफेज Avi-ओवा बीसीजी से संक्रमित थे, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है, और फोकल विश्लेषण के अधीन । परिणाम (चित्रा 6A) से पता चला कि वहां Avi-ओवा के colocalization था I-एक अणुओं के साथ, सुझाव है कि avidin फ्यूजन प्रोटीन अलग और translocated के लिए प्रतिजन प्रस्तुति डिब्बों जहां वे MHC द्वितीय अणुओं पर लोड किए गए थे । परिणाम यह भी पता चला है कि avi-ओवा पेप्टाइड के साथ वर्ग मैं अणुओं के भीतर phagosomes जब H-2kबी (चित्रा घमण्ड) के लिए सना हुआ है, जो प्रदर्शन किया है कि avi-ओवा प्रतिजन के संभावित प्रस्तुति के लिए सीडी+ टी कोशिकाओं द्वारा macrophage. इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एक बार सतह सजाया बैक्टीरिया मैक्रोफेज में प्रवेश, प्रतिजनों प्रतिजन प्रस्तुति रास्ते की ओर यातायात के लिए कर रहे हैं ।

सतह सजाया बैक्टीरिया पूरी तरह से कर रहे हैं immunogenic
जांच करें कि क्या सतह सजाया बीसीजी vivo में एक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्प्रेरण में सक्षम है, C57BL/6 चूहों अकेले पंजाबियों (नियंत्रण), जंगली प्रकार बीसीजी, Avi-ओवा सजाया बीसीजी के साथ प्रतिरक्षित थे, और बीसीजी आनुवंशिक रूप से एक प्लाज्मिड के साथ बदल व्यक्त करने के लिए एक समान ओवा प्रतिजन. प्रतिरक्षित चूहों 20 दिन बाद बलिदान कर दिया गया और ओवा-विशिष्ट सीडी+ t कोशिकाओं और साइटोकिंस जारी करने के लिए ओवा विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाया गया, प्रोटोकॉल के अनुसार आवृत्तियों । results (figure 7A-B) ने बीसीजी WT की तुलना में Avi-ओवा के साथ लेपित बीसीजी के साथ प्रतिरक्षित के साथ जानवरों में ओवा-विशिष्ट सीडी+टी सेल रिस्पांस का एक बड़ा अनुपात दिखाया. बीसीजी आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए एक्सप्रेस ओवा एक समान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बीसीजी दिखाया अवि-ओवा (चित्र ७). इन आंकड़ों से पता चला है कि बैक्टीरियल सतह सजावट विधि के लिए एक महत्वपूर्ण विस्तार को प्रेरित करने में सक्षम है antigen विशिष्ट सीडी+ टी कोशिकाओं और टी सेल रिस्पांस प्रेरण की डिग्री बीसीजी आनुवंशिक रूप से एक समान ओवा व्यक्त करने के लिए इंजीनियर करने के लिए तुलनीय है antigen.

चूंकि intracellular साइटोकिंस antigen विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के भी महत्वपूर्ण संकेतक हैं, intracellular साइटोकिंस धुंधला (आईसीएस) प्रयोगों और अभिव्यक्ति और आवृत्तियों का निर्धारण करके टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए आयोजित किए गए साइटोकिंस के साथ प्रतिरक्षित-बैक्टीरिया और बैक्टीरिया आनुवंशिक रूप से एक ओवा प्लाज्मिड व्यक्त के साथ रूपांतरित जानवरों में प्रभाव । हम IFN-γ रिहाई के स्तर की जांच की है, जो intracellular बैक्टीरिया के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया के एक ज्ञात सूचक है11। हमने दिखाया है कि हम के समान स्तर का पता लगाने में सक्षम थे ओवा-विशिष्ट IFN-γ जारी सीडी+ जानवरों में कोशिकाओं बैक्टीरिया सतह के साथ प्रतिरक्षित के साथ सजाया ओवा (बीसीजी-avi-ओवा और बीसीजी-p19-avi-ओवा) जानवरों की तुलना में बैक्टीरिया के साथ प्रतिरक्षित अनुवांशिक व्यक्ती ओवा (बीसीजी-p19-ओवा) (figure ८अ). महत्वपूर्ण बात, हम भी IFN-γ के काफी उच्च आवृत्तियों का पता लगाने में सक्षम थे सीडी+ जानवरों में टी कोशिकाओं बीसीजी के साथ प्रतिरक्षित-Avi-ओवा जानवरों की तुलना में प्रतिरक्षित के साथ बीसीजी आनुवंशिक रूप से व्यक्त ओवा (फिगर 8B-सी) जो दर्शाता है कि बायोटिन की avidin मध्यस्थता सतह प्रदर्शन प्रतिजन पद्धति को प्रभावी ढंग से न्यूक्लिक एसिड के साथ बीसीजी परिवर्तन बदल सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: avidin फ्यूजन प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्लाज्मिड का निर्माण । (क) एक जीन खंड monomeric avidin के लिए एंकोडिंग प्रतिबंध साइटों NdeI और नोटि और pDEST17 6x और गेटवे कैसेट के बीच histidine में उपक्लोन के साथ संश्लेषित किया गया p17-Avi प्लाज्मिड उत्पंन करने के लिए । ओवा पेप्टाइड252-345 डीएनए अनुक्रम attबी साइटों के साथ समाप्त pDONR221 में क्लोन किया गया । इसके बाद, ओवा जीन p17-Avi में उपक्लोन किया गया । PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बीसीजी biotinylation की दक्षता । बीसीजी के विभिंन एकाग्रता के साथ biotinylated था एन एच एस-बायोटिन के लिए 30 मिनट के कमरे के तापमान पर है, तो FITC-streptavidin के साथ लेबल, और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया । परिणाम हरे प्रतिदीप्ति तीव्रता के हिस्टोग्राम और डालने ग्राफ के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब है ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) 3 स्वतंत्र प्रयोगों से घटा । * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001 । PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: बीसीजी सतह के Biotinylation अपने विकास या macrophage में अपने अस्तित्व को प्रभावित नहीं किया । (क) Biot-बीसीजी और नियंत्रण unलेबलेड वंय प्रकार बीसीजी पूरा 7H9 मीडिया में बड़े हो गए थे, और एक 8 दिन की अवधि में प्रतिकृति पर नजर रखी थी । परिणाम विकास curves के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, यानी, 3 स्वतंत्र प्रयोगों से समय ± SEM के समारोह के रूप में ६०० एनएम पर अवशोषित मतलब है । (ख) मैक्रोफेज Biot-बीसीजी से संक्रमित थे-ल्यूक या नियंत्रण unलेबलेड बीसीजी-ल्यूक संकेत समय अवधि के लिए, और फिर सेल lysates तैयार किया गया और bioluminescence के लिए परख के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया का पता लगाने । परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे है रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) ± SEM 3 स्वतंत्र प्रयोगों से । PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Avi-ओवा Biot-बीसीजी और इसकी स्थिरता के लिए बाध्यकारी । (क) Biot-dsRed-बीसीजी (जीवाणुओं का लाल प्रतिदीप्ति व्यक्त करना, पहले से वर्णित९) और नियंत्रण गैर-biotinylated dsRed-बीसीजी के साथ-साथ १ एच के लिए कमरे के तापमान पर अवि-ओवा के साथ मिलाया गया था और ओवा बाइंडिंग की सीमा से सतह के दाग का मूल्यांकन किया गया था खरगोश विरोधी avidin एंटीबॉडी और FITC-बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (FL1) । नमूनों धोया और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । परिणाम हरे प्रतिदीप्ति तीव्रता के हिस्टोग्राम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, और मूल्यों का मतलब है ± SEM के MFI की Biot-बीसीजी-AviOVA बंधन तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त की । (ख) Lyophilized Biot-बीसीजी के साथ लेपित avi-ओवा और हौसले से बनाया avi-ओवा-Biot-बीसीजी का लेबल और विश्लेषण किया गया था जैसा कि प्रवाह cytometry द्वारा किया जाता है । दिखाए गए डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, और मूल्यों का मतलब है ± SEM के MFI के Avi-ओवा-Biot-बीसीजी बाइंडिंग तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त की. (ग) कच्चे मैक्रोफेज ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए DsRed बीसीजी-Avi-OOVA या DsRed-बीसीजी से संक्रमित थे । नमूने तो धोया, trypsin के साथ इलाज किया गया, फिक्स्ड, और FACS द्वारा विश्लेषण किया । परिणाम लाल प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम, जो phagocytosis की हद को प्रतिबिंबित के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त बीसीजी घूस लेने कोशिकाओं की औसत प्रतिशत ± SEM इंगित करते हैं । PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Avi-ओवा को बीसीजी सतह से अलग किया और cytosol की ओर phagosomal झिल्ली को पार किया. (क) आवरण स्लिप्स पर अनुयाई कच्ची कोशिकाएँ ३७ डिग्री सेल्सियस पर २४ एच के लिए ओवा से सजाया dsRed-बीसीजी से संक्रमित थीं और फिर permeabilized और खरगोश रोधी avidin एंटीबॉडी और FITC-बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ दाग/ नमूने माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार और डिजिटल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । लाल संकेतों बीसीजी और हरी संकेतों की स्थिति का संकेत Avi-ओवा के स्थानीयकरण को दर्शाते हैं । डॉटेड रेखा macrophage कक्ष सीमा को इंगित करती है और निचला दायां फलक बाएं फलक में दिखाए गए संमिलित की एक 4x आवर्धन है । (ख) बीसीजी के पतले वर्गों-AviOVA संक्रमित कच्चे कोशिकाओं paraformaldehyde के साथ तय किया गया और विरोधी avidin एंटीबॉडी और सोने-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी Avi-ओवा कल्पना और एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जांच के साथ क्रमिक रूप से मशीन । 12 का आवर्धन, 000X दिखाया गया है । ऐरोहेड से संकेत मिलता है Avi-ओवा असंबद्ध बीसीजी सतह से और निर्यात phagosome झिल्ली से परे । दिखाए गए चित्र दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: Avidin-फ्यूजन प्रतिजन MHC वर्ग द्वितीय और वर्ग मैं अणुओं के साथ सह स्थानीयकृत । अनुयाई bma 3.1 a7 कोशिकाओं, एक माउस macrophage सेल लाइन, के लिए सजाया ओवा से संक्रमित थे GFP-बीसीजी (ग्रीन फ्लोरोसेंट व्यक्त, पहले9वर्णित) 4 एच के लिए और फिर IFN के साथ उत्तेजित-γ के लिए 24 ज. कोशिकाओं तो तय थे/permeabilized और दाग के साथ खरगोश विरोधी avidin एंटीबॉडी, alexa ५९४ विरोधी खरगोश आईजीजी और या तो alexa ६४७ चूहा विरोधी माउस मैं एक (एक) या alexa ६४७ चूहे विरोधी माउस H-2kबी (बी) । नमूने माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार और डिजिटल फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । हरी संकेतों की स्थिति का संकेत बीसीजी-GFP और लाल संकेतों Avi-ओवा के स्थानीयकरण को प्रतिबिंबित । नीले संकेतों MHC वर्ग द्वितीय या वर्ग मैं अणुओं की स्थिति का संकेत है । डॉटेड रेखा रुचि के क्षेत्र को इंगित करती है । ऐरोहेड संकेत अवि-ओवा colocalization विथ MHC अणु. दिखाए गए चित्र दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: vivo सीडी+ टी सेल प्रतिक्रिया में ओवा-सजाया बीसीजी । C57BL/6 चूहों को बीसीजी सतह के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया ओवा, अनसंशोधित बीसीजी जंगली-प्रकार, पंजाब (नियंत्रण), बीसीजी आनुवंशिक रूप से व्यक्त करने के लिए रूपांतरित ओवा (बीसीजी-p19-ओवा), या नियंत्रण प्लाज्मिड और सतह से सजाया Avi-ओवा के साथ रूपांतरित बीसीजी-p19-AviOVA) । 20 दिन की अवधि के बाद splenocytes को euthanized जानवरों की तिल्ली से तैयार किया गया और पीई के साथ दाग-संयुग्मित I-ab-ओवा323-339 tetramers (a) के बाद AF647-सीडी एंटीबॉडी और 7-AAD. नमूने तो प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । परिणाम दो पैरामीटर डॉट भूखंड है कि औसत आवृत्तियों दिखाने के रूप में व्यक्त कर रहे है सीडी में tetramer सकारात्मक घटनाओं की ± SEM+ दो जानवरों से जनसंख्या/ दिखाया गया डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (तपसिल में मूल्यांकित प्रत्येक माउस से सेल नमूनों के साथ छह चूहों की कुल जांच की गई थी). रेखांकन में डेटा (B) अर्थ मान ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे है निरपेक्ष संख्या (५००,००० घटनाओं की कुल में) ओवा tetramer विशिष्ट सीडी+ कोशिकाओं में से दो पशु/समूह और तीन स्वतंत्र प्रयोगों से । * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001 । PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: Avi-ओवा लेपित बीसीजी-प्रतिरक्षण के जवाब में साइटोकिंस जारी करने वाली टी कोशिकाओं की आवृत्तियों. पंजाबियों के साथ प्रतिरक्षित चूहों से Splenocytes, बीसीजी जंगली-प्रकार, बीसीजी WT सतह से सजाया Avi-ओवा, बीसीजी-p19-ओवा, और बीसीजी-p19-AviOVA के साथ संयोजक ओवा प्रोटीन के लिए प्रेरित किया गया 16 ज के बाद Brefeldin ए के साथ 5 एच की अवधि के उपचार के बाद. कोशिकाओं को धोया गया और सना फर्स्ट विथ पे-Cy7 एंटी-सीडी (A) या pe anti-सीडी एंटीबॉडी (B) तो AF647 anti-IFN-γ एंटीबॉडी. कोशिकाओं को धोया और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । परिणाम दो पैरामीटर डॉट भूखंडों के रूप में व्यक्त कर रहे है औसत आवृत्तियों IFN के ± SEM दिखाने के लिए-γ सीडी में सेल सबसेट का निर्माण+ और सीडी+ दो जानवरों से आबादी/ दिखाया गया डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (तपसिल में मूल्यांकित प्रत्येक माउस से सेल नमूनों के साथ छह चूहों की कुल जांच की गई थी). रेखांकन में डेटा (C) IFN के निरपेक्ष संख्या ± SEM के माध्य के रूप में व्यक्त कर रहे है सीडी+ टी कोशिकाओं (वाम ग्राफ) या IFN γ जारी सीडी+ टी कोशिकाओं (सही ग्राफ) से दो जानवरों/समूह और तीन स्वतंत्र प्रयोगों । * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001 । PLOS एक12से अनुमति के साथ संपादित और पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम इस अध्ययन में रिपोर्ट बीसीजी सतह पर exogenous प्रोटीन के तेजी से और प्रभावी प्रदर्शन के लिए एक गैर आनुवंशिक दृष्टिकोण या तो विशिष्ट प्रतिजनों या विशिष्ट कार्यात्मक गुणों को कुशलता से जीवाणु की immunogenicity में सुधार की उंमीद जोड़ने के लिए । हमने यह दर्शाया कि बीसीजी सेल की सतह को avidin फ्यूजन प्रोटीन के साथ तात्कालिक सतह की सजावट के लिए आसानी से biotinylated जा सकता है । कुल प्रक्रिया 2 घंटे के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि आनुवंशिक परिवर्तन और सकारात्मक क्लोन के चयन समय अंतराल के 2 से 3 महीने की आवश्यकता है । सतह संशोधन बैक्टीरियल विकास और अस्तित्व को प्रभावित नहीं करता है । सरोगेट प्रतिजन ओवा के साथ सजाया बैक्टीरिया प्रतिजन प्रस्तुति मार्ग और vivo में प्रेरित विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में प्रतिजन देने के लिए सक्षम थे, जो प्रवाह द्वारा मूल्यांकन किया गया था-MHC tetramer धुंधला सहित cytometry परख और intracellular cytokine धुंधला (आईसीएस) । इससे भी महत्वपूर्ण बात, vivo में अध्ययन स्पष्ट रूप से पता चला है कि सतह को सजाया बैक्टीरिया की तुलना में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समान स्तर उत्पंन करने में सक्षम थे बीसीजी आनुवंशिक रूप से समान एंटीजन व्यक्त इंजीनियर ।

Avidin बायोटिन इंटरेक्शन 10−15 M13के Kd के साथ प्रकृति में ज्ञात सबसे मजबूत गैर-आबंध इंटरैक्शन है । यह न केवल एक उपयोगी उपकरण सामांयतः जैविक अनुसंधान14में इस्तेमाल किया है, लेकिन यह भी हाल ही में कैंसर थेरेपी में लागू होना दिखाया गया है15,16। इस अध्ययन में, ट्रिपल उत्परिवर्तन (N54A, W110K और N17I) को वाइल्ड-टाइप avidin पर लागू किया गया tetrameric avidin को monomeric avidin में परिवर्तित करने के लिए जो काफी कम हो गया है avidin-बायोटिन संबध (Kd= 10−7 M) और बाइंड reversibly ते बायोटिन. यह monomeric avidin एक p17-Avi प्लाज्मिड कि गेटवे पुनर्संयोजन क्लोनिंग (Invitrogen) के साथ संगत है के लिए एक कदम तेजी से ब्याज की एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए विकसित किया गया था । monomeric avidin के इस नए संस्करण बड़े जीवाणु झुरमुट एकत्रीकरण और ब्याज की प्रोटीन की परिवर्तनीय जीवाणु सतह प्रदर्शन को रोकने सहित कई फायदे हैं । इसलिए, एक बार मेजबान सेल द्वारा घूस, Avi-फ्यूजन प्रोटीन biotinylated बैक्टीरिया और यातायात intracellularly की सतह से अलग कर सकते हैं । अंत में, उत्परिवर्तनों एक गैर में avidin परिवर्तित-ग्लाइकोसिलेटेड रूप है कि खमीर या ट्रांसजेनिक संयंत्रों में लागू हो सकता है17,18 युकेरियोटिक प्रणालियों में avidin संलयन प्रोटीन की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए । monomeric avidin का यह रूप monomeric streptavidin (एमएसएल) के एक संस्करण के बजाय चुना गया था19, जो दोनों streptavidin और rhizavidin अनुक्रम है और एक उच्च बाध्यकारी अपनत्व था (Kd of 10−9 M) mAvidin की तुलना में । प्रारंभिक परीक्षण के साथ, एमएसए कल्पना प्रोटीन mAvidin कल्पना प्रोटीन की तुलना में biotinylated बैक्टीरिया को एक बहुत कम बाध्यकारी दक्षता था । इस अध्ययन, इसलिए, mAvidin पर आधारित था, लेकिन monomeric streptavidin या streptavidin/avidin के अन्य रूपों भी अन्य अनुप्रयोगों के लिए एक संभावना होगी.

वर्णित प्रोटोकॉल के सफल कार्यांवयन जनित फ्यूजन प्रोटीन और बैक्टीरियल सतह biotinylation की दक्षता की गुणवत्ता पर निर्भर करता है । Eluted Avi-टैग की गईं प्रोटीन de-नमकीन और बफर उचित आणविक वजन प्रोटीन संकेंद्रक का उपयोग कर पंजाब में विमर्श किया जाना चाहिए । वर्षण कुछ प्रोटीन के लिए उच्च एकाग्रता कारकों पर हो सकता है, इसलिए, एकाग्रता कारक का परीक्षण किया जाना चाहिए और पहले eluted प्रोटीन की छोटी मात्रा का उपयोग कर निर्धारित, उदा, ०.५ solubilized समावेशन शरीर के 1 मिलीलीटर से पंजाब के 20 मिलीलीटर में पतला और फिर ध्यान केंद्रित । यह भी वर्षा से बचने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस के आसपास प्रोटीन के तापमान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

बैक्टीरियल सतह biotinylation की दक्षता में सुधार करने के लिए, Sulfo-एन एच एस एसएस बायोटिन 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में अपने मूल कंटेनर में संग्रहित किया जाना चाहिए । रिएजेंट अत्यंत नमी संवेदनशील है; इसलिए, एक एजेंट युक्त शीशियों खोलने से पहले कमरे के तापमान के लिए equilibrated होना चाहिए । इसके अलावा, बायोटिन स्टॉक समाधान (10 मिमी) एन एच एस-एस्टर moiety hydrolyzes के रूप में उपयोग करने से पहले तुरंत किया जाना चाहिए और गैर-प्रतिक्रियाशील बहुत जल्दी हो । बायोटिन स्टॉक समाधान संग्रहीत और फिर से उपयोग नहीं किया जा सकता; हर biotinylation प्रयोग के लिए एक नई बायोटिन की शीशी की जरूरत होती है । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, बीसीजी के ताजा संस्कृतियों, ताजा मीडिया, साथ ही साथ ताजा बफ़र्स की सिफारिश कर रहे हैं । के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, biotinylated और लेपित बीसीजी lyophilized हो सकता है और सतह कोटिंग की गुणवत्ता को प्रभावित किए बिना कम से कम 30 दिनों के लिए संरक्षित । यह विशेष रूप से उपयोगी है जब एक स्थान से नमूने भेजने या स्थानांतरित करने के लिए दूसरे या लंबे समय तक पाठ्यक्रम प्रयोग करते समय ।

यह बीसीजी सतह सजावट विधि भी अंय रोमांचक संभावनाओं का विश्लेषण और एक तेजी से और सही तरीके से नव विकसित टीके उंमीदवारों की immunogenicity का मूल्यांकन प्रदान करता है । उपंयास टीबी टीकों का प्राथमिक लक्ष्य सीडी+ और सीडी+ टी कोशिकाओं है कि टीबी के खिलाफ संरक्षण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के रूप में TH1 प्रकार की कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए है । इस अध्ययन में विकसित avidin-बायोटिन सिस्टम इन टी कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण प्रदान करता है । तेजी से प्रदर्शित करने के इस उपंयास प्रौद्योगिकी संयोजक प्रोटीन/एंटीजन पर बीसीजी सतह का मूल्यांकन करने के लिए एक महान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है जल्दी और सही रूप से कई immunogenic प्रोटीन की सुरक्षात्मक प्रभावकारिता (जैसे, गुप्त विशेष एम. टीबी प्रोटीन), और इस तरह कुशल टीके के विकास में अनुवाद किया जा सकता है ।

समायोजन और बैक्टीरिया की सतह पर Avi-फ्यूजन प्रोटीन की एकाग्रता बदलती द्वारा, इस विधि का एक और लाभ के लिए एक साथ बैक्टीरिया की सतह पर ब्याज की विभिन्न एंटीजन प्रदर्शित करने के लिए वैक्सीन की प्रभावशीलता को अधिकतम करने के लिए हो सकता है. अध्ययनों से पता चला है कि बीसीजी जैसे महत्वपूर्ण macrophage कार्यों के साथ हस्तक्षेप phagosome परिपक्वता के रूप में20,21 और प्रतिजन प्रस्तुति21, एक संभावना आगे में सुधार करने के लिए बीसीजी के साथ बीसीजी सतह सजा हो सकता है कारकों का एक संयोजन ब्याज की एंटीजन के साथ phagosome परिपक्वता में तेजी लाने के लिए जाना जाता है ।

इस प्रौद्योगिकी की कुछ सीमाएं संयोजक प्रोटीन के बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता को शामिल करते हैं, जो कम आय वाले क्षेत्रों में चुनौतीपूर्ण और महंगा हो सकता है । इसके अलावा, कठिन उत्पादन के लिए प्रोटीन शुद्ध समस्या निवारण और अनुकूलन की आवश्यकता होगी । हालांकि, इन सीमाओं संयोजक प्रोटीन उत्पादन प्रौद्योगिकियों के सुधार के साथ दरकिनार किया जा सकता है । एक और सीमा की संभावना है कि स्वाभाविक रूप से होने वाली विरोधी avidin एंटीबॉडी प्रयोगशाला पशुओं और मनुष्यों में आम शामिल है22 चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए avidin के उपयोग में बाधा हो सकती है । हालांकि, अंय प्रयोगशालाओं सुरक्षा और avidin चिकित्सा की प्रभावकारिता का परीक्षण किया है और पता चला है कि avidin सुरक्षा और प्रभावकारिता काफी इसके immunogenicity23से प्रभावित नहीं थे । दिलचस्प है, एक monomeric रूप में जंगली प्रकार tetrameric avidin परिवर्तित काफी इसके immunogenicity24कमी आई ।

योग करने के लिए, इस उपंयास एक avidin-बायोटिन प्रणाली का उपयोग प्रौद्योगिकी ब्याज के प्रोटीन के साथ एक तेजी से और प्रतिलिपि गैर आनुवंशिक जीवाणु सतह संशोधन के माध्यम से है बीसीजी immunogenicity में सुधार सफलतापूर्वक बीसीजी के पारंपरिक परिवर्तन की जगह ले सकते है antigen-एंकोडिंग plasmids के साथ । इसके अलावा, इस उपंयास विधि न केवल वर्तमान बीसीजी वैक्सीन के सुधार की सुविधा कर सकते हैं, लेकिन यह भी वस्तुतः किसी भी संभावित प्रतिजन या प्रोटीन के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक उपंयास मंच प्रदान कर सकते है आम तौर पर मुश्किल आनुवंशिक रूप से बीसीजी में व्यक्त, व्यापक के साथ टीबी वैक्सीन विकास में आवेदन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

तकनीकी सहायता के लिए बीसीजी पाश्चर तनाव और तलाल के लिए हम डॉ॰ आर स्टोक्स का धन्यवाद करते हैं । हम भी जीन संश्लेषण के साथ मदद के लिए GenScript धन्यवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १३१ माइकोबैक्टीरियम तपेदिक मैक्रोफेज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संयोजक प्रोटीन टी कोशिकाओं एंटीजन बायोटिन avidin-बायोटिन
Avidin-बायोटिन प्रणाली के साथ गैर आनुवंशिक सतह सजावट के माध्यम से <em>माइकोबैक्टीरियम bovis</em> बीसीजी वैक्सीन में Exogenous एंटीजन की अभिव्यक्ति
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Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J.,… More

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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