Summary
يوجز هذا التقرير نهج بسيط للحث على نجاح العصب الذاتية التجريبية (EAN) استخدام البروتين المايلين صفر الببتيد180-199 (P0) في تركيبة مع adjuvant فروند بالكامل والسمية السعال الديكي. نحن نقدم نموذجا متطورة قادرة على دقة تقدير مدى عجز وظيفي وأمراض الأعصاب التي تحدث في هذا EAN.
Abstract
العصب الذاتية التجريبية (EAN) نموذج تجريبي يحظى بتقدير جيد لأمراض المناعة الذاتية دملينتينغ الطرفية. فعل المرض EAN تحصين الفئران مع الببتيدات العصبية لتوجيه هجوم تحريضية تجاه مكونات الجهاز العصبي المحيطي (PNS). ومكنت التطورات الأخيرة استحثاث EAN في السطر الماوس C57BL/6 مقاومة نسبيا استخدام البروتين المايلين صفر (P0)106-125 أو الببتيدات180-199 P0 تسليمها في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السم السعال الديكي. القدرة على حفز EAN في سلالة C57BL/6 يسمح باستخدام العديد من الأدوات الوراثية الموجودة على هذه الخلفية الماوس، ويسمح بالتالي دراسة إمراضية المرض متطورة والاستجواب للعمل آليا للمداواة الرواية في تركيبة مع نهج محوره وراثيا. في هذه الدراسة، ندلل على نهج بسيط لحمل EAN استخدام الببتيد180-199 P0 في الفئران C57BL/6 بنجاح. أننا أيضا مخطط بروتوكول لتقييم العجز الوظيفية التي تحدث في هذا النموذج، مصحوبا بمجموعة من الميزات لاثيل. وهكذا، هذا النموذج هو نموذج تجريبي قوية لدراسة الآلية المرضية لاعتلالات الأعصاب دملينتينغ الطرفية البشرية، وتحديد مدى فعالية العلاجات المحتملة التي تهدف إلى تشجيع إصلاح المايلين وحماية ضد تلف الأعصاب في المناعة الذاتية العصب.
Introduction
اعتلالات الأعصاب الطرفية يمكن أن تكون وراثية في الأصل أو المكتسبة، أما مع اعتلالات الأعصاب المكتسبة بعد أما الإقفارية الأيضية،، بريسيبيتانتس الملتهبة أو السامة. يكون من المفيد أيضا تصنف هذه الأمراض أما محواري أو ديميليناتيفي في الأصل. الأكثر شيوعاً اكتسب دملينتينغ اعتلالات الأعصاب المحيطية هي "اعتلال دملينتينغ الالتهابات الحادة" (الرابطة، المعروف أيضا بمتلازمة غيان-باريه GBS) واعتلال دملينتينغ التهاب مزمن (سبب)1، 2 , 3 , 4؛ باثوجينيتيكالي على حد سواء تتسم بفعل المناعة الذاتية ضد غمد المايلين، مما تسبب في ديمييلينيشن الأعصاب المحيطية. في هذه الأمراض، وتنشيط خلايا تي عبور حاجز الدم في الأعصاب وتولد رد فعل المناعة في السندات الإذنية. يؤدي تنشيط الضامة داخل العصب ثم demyelination أما مباشرة عن طريق هجوم متجولة أو غير مباشر عن طريق وسطاء التهابات يفرزها، نتج عنه عجز السريرية مثل الشلل والخلل الحسي5. بينما محاور عصبية ديميليناتيد الاحتفاظ بالقدرة على أن تكون ريميليناتيد بعد ديميليناتيون، ريميليناتيون غالباً ما يتأخر أو غير مكتملة، أسفر عن قابلية محاور عصبية عارية لضرر لا يمكن إصلاحه، وهو السبب الرئيسي للدائم السريرية العجز. حاليا العلاجات الأكثر فعالية إيمونومودولاتوري، ولكن على الرغم من فعاليتها، في كثير من الحالات الانتعاش بطيء غالباً، والمرضى ~ 25% سوف تواجه العجز الوظيفية المتبقية التي تقلل إلى حد كبير على نوعية حياة6، 7.
EAN هو نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع من دملينتينغ الأعصاب الطرفية التي قدمت أفكاراً قيمة في المرضية ووسيلة لتقييم العوامل العلاجية رواية4. يمكن أن يتسبب هذا الطراز في الأنواع المختلفة مثل الأرانب، الجرذان، الفئران وخنازير غينيا، وهو فعل التحصين مع المستضدات العصبية. ومع ذلك، في نهاية المطاف التعريفي EAN ناجحة يعتمد على استجابة مناعية مناسبة للمرض إلى حدوث. ونظرا للاختلافات الأنواع (وبينها species/سلالة) في وظيفة المناعة، قد وضعت مجموعات متعددة من المستضدات، ومأمونية بنجاح حمل EAN. من حيث الأدوات الوراثية مورين، C57BL/6 هو الأكثر استخداماً؛ ومع ذلك، الببتيد بروتين P2 التقليدية 57-81 (P257-81) التي ينتج عنها مرض في سلالة من الماوس سخل عرضه8 غير قادر على المرضية غير المشروعة مما أدى إلى عجز وظيفي في سلالة C57BL/6. لحسن الحظ، تسليم نماذج التوعية باستخدام P0106-125 أو الببتيدات P0180-199 ، في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السعال الديكي السمية يمكن التغلب على هذا الحاجز، تمكين أدوات الجينية المتطورة التي ستستخدم في موريني EAN النموذجي.
ويرد هنا، طريقة بسيطة لاستحثاث EAN في الفئران C57BL/6. وباﻹضافة إلى ذلك، تقدم نهجاً مفصلة شاملة لتقييم العجز الوظيفي ولاثيل المرتبطة بهذا المرض. واختير P0180–199 الببتيد9 تفضيل البديل57-81 P010. الطراز199 180–P0 قد وصفت لإنتاج علامات سريرية أقل حدة بالمقارنة مع البديل57-81 P010فمن المرجح أن تحمل إدخال يحتمل أن الاضطرابات الوراثية الضارة، التعافي من العمليات الجراحية (مثل غرس مضخة ناضح)، وهي قابلة للمطحنة مشيه دالة اختبار4. ومع ذلك، الاختبارات الدالة مشيه المطحنة وغذائها البروتوكولات المذكورة هنا يمكن بسهولة تطبيق عند دراسة هذا المرض في متغير57-81 التي يسببها P0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات الموصوفة هنا أقرها المعهد فلوري لعلم الأعصاب والصحة العقلية (مركز الدماغ ملبورن) الحيوان لجنة الأخلاقيات واتبع "قانون الممارسة الأسترالية" "استخدام الحيوانات" للعلم الأغراض-
1-تحريض EAN
ملاحظة: EAN يمكن أن يتسبب بنجاح في الفئران C57BL/6 الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6 8 أسابيع. البروتوكول التوجيهي يأخذ 9 أيام في المجموع. اليوم 0 يشير إلى يوم التحصين الأولى. لهذا البروتوكول، وقد أجريت الحقن تحت التخدير (راجع الخطوة 1-1-2 أدناه)-
- "في اليوم"-1:
- إعداد "السم السعال الديكي" حل (انظر الجدول للمواد) 1.6 ميكروغرام/مل باستخدام الفوسفات متساوي التوتر الماوس عقيم في م 0.1 مخزنة المالحة (طن متري-برنامج تلفزيوني).
- أنيسثيتيزيشن مع إيسوفلوراني:
- ضع الماوس (C57BL/6، ذكر، 6-8 أسابيع) في قاعة أنيسثيتيزيشن وضبط تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر/دقيقة
- قم بتشغيل المرذاذ isoflurane وضبطه إلى 2.5 في المائة لمراقبة التنفس وأنيسثيتيزيشن، وانتظر لمدة 2 دقيقة، أو حتى ردود الفعل الأولية (أطرافهم القرنية وهند) التي لم تعد تستجيب
- إزالة الماوس من قاعة أنيسثيتيزيشن وإدارة 250 ميليلتر من الحل "السمية السعال الديكي" أعلاه عن طريق حقن داخل (القائمة) استخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 1/2 ز.
- تعد العدوى عن طريق الحقن للتحصين:
- تحضير الحل استخدام حل 2 مغ/مل من P0 الببتيد 180-199 (مع > نقاوة 98%، تسلسل S-S-K-R-G-R-قتبفلياملدهسرس) في المحلول الملحي 0.9 ٪.
- تحضير حل ب استخدام الحل 20 ملغ/مل من بكتريا السل (انظر الجدول للمواد) في فروند ' s كاملة adjuvant (قانون المنافسة المنصفة، تتألف من: مونولاتي مانيدي 15% + 85% من زيت البارافين و 0.5 ملغ/مل من يهتمان قتلوا والمجففة الزبدية متفطره M)-
- جعل العدوى النهائي للحقن، الجمع بين أجزاء متساوية الحجم من حلول A و B في الخافق حبة ومزجها في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: الحلول A و B يمكن الاحتفاظ بها كمخزون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد ولكن العدوى النهائي الموحد يجب أن يكون مستعدا طازجة في يوم حقن الفأر.
- "في اليوم" 0، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقن تحت الجلد استخدام إبرة 23 ز.
ملاحظة: الحقن يمكن أن توضع بين ريش الكتف، أو بين أطرافهم هند وذيل على dorsum والذيلية. - في اليوم 1، جعل الحل "السمية السعال الديكي" 1.2 ميكروغرام/مل (في النقل المتعدد الوسائط-برنامج تلفزيوني) وإدارة 250 ميليلتر في ماوس عن طريق الحقن القائمة باستخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 1/2 ز.
- في 3 يوم، كرر الخطوة 1-3 أعلاه.
ملاحظة: يمكن أن تتكون حلول الأسهم A و B والمخزنة في ˚C 4 لمدة أقصاها شهر واحد. غير أن العدوى عن طريق الحقن النهائي، أنتجت عن طريق الجمع بين الحلول الأسهم A و B، يجب أن يتم في اليوم للحقن. - في يوم 8، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقنه تحت الجلد (راجع الخطوة 1-2 أعلاه)، في موقع الحقن نفسها كما في الخطوة 1، 2 (لكل الحيوانات)
2-"التهديف السريرية"
- أداء التهديف السريرية بها يوميا ابتداء من اليوم 0.
- إعطاء كل الماوس على درجة من 0، 1، 2، 3، أو 4 وفقا لمعايير منشورة 4. انظر الجدول 1 للتهديف السريرية EAN.
ملاحظة: للاتساق، ينبغي بذل مجهود نقاط الفئران في نفس الوقت يوميا بنفس الباحث.
3. السيارات "تقييم الدالة"
ملاحظة: تقييم أداء المحرك بالتوازي مع التهديف السريرية للفوج نفسه من الحيوانات. يجب أن تكون متصلاً جهاز تقييم الدالة السيارات إلى جهاز كمبيوتر أن له (انظر الجدول للمواد) تركيب جهاز تصوير دالة مشيه. من المستحسن أيضا أن جميع الفئران تقييم ينبغي أن اعتادوا على المهمة قيد التشغيل قبل التعريفي EAN. للقيام بذلك، تتم ممارسة تشغيل (تشغيل الاختبار 2 للماوس) ثلاثة أيام قبل تحريض المرض (اليوم-3)-
- بدوره على جهاز تقييم وظيفة الحركة والتبديل على زر الضوء.
- القفا الماوس بحزم والحبر قدميها بتخفيض على حاوية مليئة بالحبر الأحمر بينما يمسك ذيله.
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لسلالة C57BL/6، ولكن يمكن تخطي إذا كان يتم استخدام سلالة ماوس مع لون معطف أبيض- - ضع الماوس في المقصورة المشي وتعيين سرعة المطحنة في 15 سم/س.
- تشغيل في حلقة مفرغة وانقر " سجل " الزر لالتقاط حركة تشغيل الماوس باستخدام الدالة مشيه نظام التصوير (انظر الجدول للمواد). استخدام جهاز ضبط وقت
- وقياس كل تشغيل 36 s. بعد 36 ثانية، وإيقاف التسجيل ووقف حلقة مفرغة.
ملاحظة: تعتبر الفئران التي لا يمكن إكمال بنجاح هذه المهمة قيد التشغيل لهذا الفاصل s 36 لم. - حفظ ملف الفيديو في مجلد معين.
- كرر الخطوات أعلاه لكل الماوس لتقييمها. اختبار الفئران بنفس المهمة قيد التشغيل كل 3 أيام-
- تحليل ملفات الفيديو تم تحريرها باستخدام البرمجيات لمعلمات الدالة مشيه (انظر الجدول للمواد)-
ملاحظة: تفاصيل كيفية تحليل معلمات الحركية المختلفة تختلف بين البرامج حتى الرجاء الرجوع إلى الشركة المصنعة ' تعليمة s قبل التحليل. للحصول على أدلة النسيجي محواري وتلف المايلين عبر إيمونوهيستوتشيميستري أو المجهر الإلكتروني، الحيوان الأنسجة يمكن أن تتخذ في أي مرحلة وظيفة وظيفة الحركة التقييم اعتماداً على أهداف محددة للبحوث-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الببتيد180-199 P0 المستحث EAN C57BL/6 الفئران يؤدي إلى مرض أحادية الطور مع نقاط سريرية بداية من بعد 6 أيام ويلاحظ أول التحصين (نقطة في البوصة)، والأعلى درجة الخطورة من 25 نقطة في البوصة متبوعاً ببعض نقاط السريرية تحسن من 40 نقطة في البوصة المدة (الشكل 1)4،9. من حيث الوظيفة مشيه، الفئران تبدأ تفشل في مهمة قيد تشغيل بسيطة أقرب 6 نقطة في البوصة، ومن الفئران 35 نقطة في البوصة قد قدرة ضئيلة على إكمال حلقة مفرغة بسيطة تشغيل المهمة ولم تتحسن في تشغيل القدرة حتى على 55 نقطة في البوصة4 (الشكل 1). الفئران التي يسببها مع EAN انخفض تدريجيا في قدرتها على أداء المهمة قيد التشغيل على مر الزمن. ويلاحظ تشغيل فشل المهمة في 80% من الفئران، ولكن بالإضافة إلى هذا، مشيه أطرافهم هند الآخذة في الاتساع في حلقة مفرغة تشغيل عجز وظيفية رئيسية التي لم تحل على مدى مدة المرض4.
وهناك العديد من الميزات الرئيسية لاثيل في P0180-199 التي يسببها EAN: الأضرار التي لحقت غمد المايلين؛ إكسون الإجهاد؛ والعقدة زيادة العرض والأضرار بالهياكل بارانودال. وتكشف دراسة الأقسام شبه رقيقة مأخوذة من الأعصاب الوركي مجالات ديمييلينيشن (الشكل 2B، أسهم) مقارنة بالاعصاب الوركي من مطابقة سن ضوابط صحية (الشكل 2A). الأهم من ذلك، فمن الممكن الحصول على نسب ز من الصور التي تم التقاطها من شبه رقيقة العصب الوركي المقاطع المصورة في طاقة عالية مع الخفيفة الميكروسكوب4. ومع ذلك، صور المجهر الإلكتروني (TEM) انتقال الطاقة العالية المطلوبة لتحديد ميزات لاثيل محددة مثل ديسميليناتون، الأضرار التي لحقت لوحة المايلين، ونشدد على علامات إكسون مثل تورم المتقدرية (ديسارانجيمينت و تشويه كريستي وكريستوليسيس الجزئي أو الكلي) (2Dمنالشكل 2–). يتفق مع الأدلة ultrastructural إكسون الإجهاد (الشكل 2-2د)، نموذج EAN180-199 التي يسببها P0 أيضا يعرض الضرر محواري الحاد، تجلى هائلة مرتفعة بيتا-اميلويد السلائف تعبير البروتين (APP) في الأعصاب الوركي (الشكل 3A). وهذا لا يحترم في أنسجة مطابقة سن مراقبة صحية (الشكل 3A). تم توثيق التغييرات لاثيل في العقد وبارانوديس جيدا في باريه؛ على وجه الخصوص، البديل11،أمان12. في نموذجنا EAN مورين، نحدد أن توسيع نطاق العقد وتعطل براندي ميزات إضافية لاثيل من P0 المستحث180-199 EAN (الشكل 3B).
رقم 1: التمثيل التخطيطي لنموذج التعريفي EAN، السريرية نقاط التقييم، وقدرة تشغيل خلال EAN. () لمحة عامة عن تحريض EAN البروتوكول في الفئران C57BL/6، ابتداء من 6-8 أسابيع عمر، مع الخطط (ب) (ج) وعشرات السريرية المتوقعة طبعا أوقات التشغيل أثناء المرض (انظر المرجع4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: عرض الفئران مع EAN المايلين فقدان وتلف المايلين وعلامات الإجهاد محاور عصبية. (A) A مشرق حقل الصورة (تحت 100 X التكبير) مأخوذة من مقاطع شبه رقيقة للأعصاب الوركي من مراقبة صحية تطابق العمر. (ب) مشرق حقل الصورة (تحت 100 X التكبير) مأخوذة من مقاطع شبه رقيقة للأعصاب الوركي من الفئران التي يسببها مع EAN في 55 يوما بعد التحصين الأولى (نقطة في البوصة). وتشير إلى مناطق تفتقر إلى المايلين محاطة بمحاور عصبية رقيقة myelinated (رؤوس) ريميلينيشن؛ وهذا لم يلاحظ في الأنسجة التي تم الحصول عليها من ضوابط صحية مطابقة المسنين (انظر ألف). (ج) ممثل الميكروسكوب الإلكتروني الصورة (تحت 5,000 X التكبير) اتخذت فرومسسياتيك الأعصاب من الفريق ب إظهار المايلين الباثولوجيا (السهم مفتوحة) والإجهاد إكسون (ربط ساحة تشير إلى تورم الميتوكوندريا على 55 نقطة في البوصة). (د) صورة تيم عالية قوة (المربع في ج المحيط) الميتوكوندريا منتفخة تبين أن تدل إكسون التشديد (رؤوس الأسهم)، ولكن هذا غير موجود من ضوابط صحية تطابق العمر (البيانات لا تظهر). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (أ، ب)، و 500 نانومتر (ج، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الإجهاد إكسون والباثولوجيا العقدي سمة من سمات P0180-199 التي يسببها EAN. (أ) طائرة واحدة [كنفوكل] الصور (تحت 40 X التكبير) المتخذة من خلال الأعصاب الوركي عند 55 نقطة بالبوصة. وتظهر الأنسجة من الفئران EAN هائلة مرتفعة التعبير التطبيق المترجمة يشترك مع β-ثالثا tubulin (علامة على الخلايا العصبية) التي تشير إلى علامات الإجهاد محواري. (ب) عالية الطاقة Z-الإسقاطات (100 X التكبير) من بارانوديس ملطخة بجسم مضاد ضد كاسبر في فروع العصب الوركي. في العقد من الفئران EAN، هناك زيادة مسافة بين بارانوديس المجاورة التي تشير إلى توسيع العقدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظتها في الفئران EAN الباثولوجيا العقدي مثل اختلال في هيكل براندي لكن تغيب من مطابقة سن ضوابط صحية. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (A)، و 5 ميكرومتر (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| نقاط | معايير | ملاحظات وتعليقات من معايير التقييم |
| 0 | ماوس عادي | |
| 1 | أقل حيوية أو لاثيري | هذا هو تقييم استجابة للمناولة العادية، الفئران عادة ما تظهر أول علامات على انخفاض النشاط في التحصين بوست يوم 5 |
| 2 | شلل الذيل أو | ويتم تقييم شلل الذيل باختبار السكتة الدماغية الذيل (التحريك الذيل). |
| شلل أطرافه خفيفة | شلل أطرافه خفيف يشير إلى سحب الفئران على البطن على الأرض عند المشي على سطح مستو | |
| 3 | ذيل شلل + شلل أطرافه خفيفة أو | يتم تقييم ترنح معتدل كأي صعوبة في المشي العادي |
| ذيل شلل + ترنح خفيفة أو | ||
| شلل أطرافه خفيفة + ترنح معتدل | ||
| 4 | ترنح شديد | ترنح شديد تم تعريفها بواسطة شاذة إلى الوراء المشي، جنبا إلى جنب مع شلل أطرافه، وشلل أطرافه خفيفة، أو شلل الذيل |
الجدول 1: نقاط EAN السريرية النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويوجز هذا التقرير طريقة بسيطة لحمل EAN استخدام الببتيد180-199 P0 في الفئران C57BL/6، وتمكين التحديد الكمي للعجز لاثيل والوظيفية الرئيسية في الفئران التي يسببها مع EAN. متميزة في بروتوكول التعريفي EAN الموصوفة هنا استخدام التخدير أثناء إجراء حقن التحصين. استخدام التخدير isoflurane يعزز إلى حد كبير القدرة على ضمان أن الحجم الإجمالي للعدوى يتم حقن تحت الجلد في الموقع المطلوب مع الحد الأدنى من الخطأ والإجهاد للحيوانات.
سوف تبدأ الفئران لعرض علامات سريرية للمرض من 6 نقطة في البوصة4 باستخدام هذا الأسلوب لتحريض EAN. ومع ذلك، ظهور المرض كما تقاس درجة السريرية قد مسبقاً تم الإبلاغ عن حدوث من9،نقطة في البوصة ~ 1010. وفي حين يمكن أن يكون هذا الاختلاف في بداية المرض كما تحددها نقاط سريرية جزئيا بسبب معايير التهديف سريرية مختلفة، فمن المحتمل أكثر شرح باستخدام المواد المختلفة في العدوى لتحريض EAN. هذا البروتوكول يستخدم adjuvant فروند كاملة تحتوي على الزبدية م.، الذي يستكمل السل م. دراسات أخرى استخدام adjuvant الشعبية فروند تستكمل إلا السل م في العدوى حقن تحتوي على P0180-199 الببتيد،من910 للتحصين.
في هذا البروتوكول، ينصح بتقديم السم السعال الديكي عن طريق الحقن القائمة الأفضلية في الوريد (رابعا) ذيل حقن الوريد. فقد ثبت أن وضع التسليم السعال الديكي لا يغير كثيرا من ظهور أو تطور المرض4، ولكن الدافع هو خيار تسليم عبر الطريق القائمة، بدلاً من المنطلق الذيل الرابع، بالتخفيف من حدة المخاطر، ومحاولة للحد من فرصة التشغيل خطأ. وكثيراً ما ذيل الوريد رابعا الحقن من الناحية التقنية أكثر صعوبة مقارنة مع الحقن حجم متساو. فقد ثبت سابقا أن استخدام السعال الديكي السمية adjuvant ضروري لحمل EAN عند استخدام الببتيد180-199 P09. من المثير للاهتمام، الأعمال السابقة أظهرت أن تخفيض الجرعة من السعال الديكي المبينة في هذا الأسلوب، كافية لغير المشروعة EAN تقاس درجة السريرية وأمراض الأعصاب ومشية في الاتساع خلال حلقة مفرغة تشغيل4. بيد إنقاص جرعة السمية السعال الديكي المستخدمة في خلال EAN التعريفي يؤثر إلى حد كبير قدرة قيد التشغيل، وأداء الفئران إلى حد كبير أفضل في حلقة مفرغة تشغيل المهمة عند فعل EAN مع نصف الجرعة الموصوفة في هذا الأسلوب السعال الديكي 4.
العجز الحركي الملاحظة في هذا النموذج EAN الببتيد الناجمين عن180-199 P0 مصحوبة ومدعومة بأدلة لاثيل قوية. سابقا، وقد ثبت أن التحديد الكمي لحجم الأضرار المايلين حساسة بما يكفي للكشف عن التغييرات في شدة المرض الذي نتج عن خفض جرعة السمية السعال الديكي خلال EAN التعريفي. هنا، يتم تعريف أخرى بصمات EAN مثل الإجهاد محواري وتعطيل لهياكل العقدة/بارانودال، أسفر عن مجموعة من علامات لاثيل الكمية P0180-199 التي يسببها EAN. وهذا يتيح لفحوص أكثر حصافة من أمراض الأعصاب عند تقييم عمليات المرض، أو فعالية العوامل العلاجية رواية. المثير، وقد ترتبط هذه التقييمات لاثيل بقراءات وظيفية في محاولة لتقديم رؤى أعمق وفهم أفضل للعلاقة بين أمراض الأعصاب والعجز الدالة التي سمة من سمات هذا النموذج من EAN. بالإضافة إلى تحليلات لاثيل واختبار وظيفة مشيه المستخدمة في هذه الدراسة، يقترح التقييمات الفنية الأخرى مثل قياس سرعة التوصيل العصبي من أجل التقاط تماما نتائج التدخلات العلاجية باستخدام الدالة هذا النموذج.
EAN نموذج تجريبي قوية واستخداما لدراسة demyelination الطرفية وريميلينيشن، مع الأعصاب الوركي وذيل الفرس كودا يجري التحقيق الأكثر متكرر الأعصاب المحيطية. والميزة الرئيسية ل EAN أنه ينتج عجزا موتور استنساخه والقابلة للقياس الكمي، مما يسمح لتحليلات لإصلاح نيوروبروتيكشن والمايلين من الناحية سريرية. علاوة على ذلك، تلف المايلين الحادة واستنساخه مما يسمح لتحليلات تفصيلية المايلين والضرر محواري من منظور نسيجية.
بينما يمثل نموذج EAN وسيلة تجريبية مثيرة للتحقيق دملينتينغ اعتلال الأعصاب المحيطية، وهناك القيود المحتملة، فضلا عن التحديات التقنية. من المهم أن نقدر طبيعة التغاير دملينتينغ الأعصاب الطرفية في البشر، والتي تنطوي على تفاعل معقد بين جهاز المناعة والجهاز العصبي المحيطي. أن التحدي الحالي أنه لا يوجد نموذج الحيوان EAN واحد يمكن أن تحاكي إخلاص جميع جوانبه. علاوة على ذلك، هناك تباينات كبيرة بين الأنواع وسلالة بين الوكالات فيما يتعلق بخطورة المرض والمتوالية من الطراز EAN. على سبيل المثال، وجدنا أن عموما EAN المستحث في الفئران C67/B6 أقل حدة مما EAN فعل الفئران لويس (بيانات غير منشورة). داخل نفس السلالة، وهناك أيضا الفرق بين الجنسين. لدينا معطيات غير منشورة تبين أن النموذج EAN المستحث في الفئران الذكور C57/B6 استنساخه بأكثر من واحدة الناجمين عن السبب بالضبط التي يقوم عليها هذا الفرق بين الجنسين في الفئران الإناث، ومع ذلك، من غير الواضح.
وفي الختام، أبلغنا بروتوكول يسمح لتحريض قوي وسريع من طراز EAN في الفئران الذكور C57/B6. الجمع بين التهديف السريرية وتقييم الدالة السيارات مع الدراسات لاثيل يوفر أداة استراتيجية لدراسة دملينتينغ الأعصاب الطرفية من منظور السريرية والمرضية على حد سواء. الأهم من ذلك، أنها تعزز الدراسات المستقبلية على الآليات العلاجات التي تستهدف إصلاح المايلين الأعصاب الطرفية باستخدام النهج الماوس المحورة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين قد لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.
Acknowledgments
وهو استيراد NHMRC بيتر دوهرتي وزميل مهنة أوائل أستراليا البحوث التصلب المتعدد (MSRA). جلف معتمد من قبل MSRA زمالات ما بعد الدكتوراه. تم دعم هذا العمل الصحة الوطنية الأسترالية ومنح المشروع مجلس البحوث الطبية (NHMRC) #APP1058647 JX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R.
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G.
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
