Summary
דו ח זה מתווה גישה פשוטה לזירוז בהצלחה ניסוי חיסון לדלקת בעצה (EAN) באמצעות חלבון המיאלין אפס פפטיד180-199 (P0) בשילוב עם אדג'וונט מלאה של פרוינד, הרעלן שעלת. אנו מציגים פרדיגמה מתוחכם המסוגל להעריך במדויק את היקף הגירעונות פונקציונלי, neuropathology המתרחשים EAN הזה.
Abstract
לדלקת בעצה חיסון ניסיוני (EAN) הוא מודל ניסיוני היטב להערכה של מחלות אוטואימוניות של המיאלין היקפיים. EAN מחלה הנגרמת על ידי immunizing עכברים עם פפטידים neurogenic לביים מתקפה דלקתיות כלפי מרכיבי מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). התפתחויות אחרונות אפשרו את אינדוקציה של EAN בקו עמיד יחסית C57BL/6 העכבר באמצעות חלבון המיאלין אפס (P0)106-125 או פפטידים180-199 P0 יועבר. בתוך אדג'וונט בשילוב עם ההזרקה של הרעלן שעלת. היכולת לגרום EAN בנימה זו C57BL/6 מאפשר השימוש בכלים גנטיים רבים הקיימים על רקע זה העכבר, ובכך מאפשר חקר המחלה פתוגנזה מתוחכמים והחקירה של הפעולה מכניסטית של הרומן הרפוי ב בשילוב עם גישות מהונדס. במחקר זה, נדגים בגישה פשוטה לזירוז בהצלחה EAN באמצעות פפטיד180-199 P0 בעכברים C57BL/6. אנחנו גם חלוקה לרמות פרוטוקול להערכה של גירעונות פונקציונלי המתרחשות במודל זה, בליווי מגוון רחב של תכונות neuropathological. לפיכך, המודל הזה הוא מודל ניסיוני עוצמה ללמוד בפתוגנזה של האנושי מחלות עצבים היקפיים המיאלין, וכדי לקבוע את היעילות של טיפולים פוטנציאליים שואפים לקדם את תיקון המיאלין ולהגן מפני נזק עצבי אוטואימוניות לדלקת בעצה.
Introduction
מחלות עצבים היקפיים יכול להיות גנטי במקורם או הנרכש, עם נזקי רכשה שיש גם מטבולית, ischaemic, precipitants דלקתיות או רעילים. מחלות אלו מסווגים גם מועיל או עצב, או demyelinative במקורם. הנפוצות ביותר רכשה demyelinating מחלות עצבים היקפיים הם חריפה דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (AIDP, הידוע גם בשם תסמונת גיליאן, GBS) כרונית דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (CIDP)1, 2 , 3 , 4; שניהם מאופיינים שאינן קשורות pathogenetically תגובה אוטואימונית נגד למעטפת מיאלין, גורם demyelination של העצבים ההיקפיים. במחלות אלה, תאי T מופעל לחצות את מחסום הדם העצבים וליצור תגובה חיסונית בתוך מערכת העצבים ההיקפית. הפעלה של מקרופאגים בתוך העצב ואז גורם demyelination או ישירות באמצעות התקפה phagocytic או בעקיפין באמצעות מופרשים מתווכים דלקתיים, והתוצאה היא מגבלה קליניים כגון שיתוק ובעיות תפקוד חושי5. ואילו האקסונים demyelinated לשמור על היכולת להיות remyelinated בעקבות demyelination, remyelination מתעכבת לעיתים קרובות או שלם, וכתוצאה מכך הרגישות של האקסונים עירום כדי נזק בלתי הפיך, שהיא הגורם הקבוע קליני נכות. כיום, הטיפולים היעילים ביותר הם immunomodulatory, אבל למרות היעילות שלהם, במקרים רבים ההתאוששות הוא לרוב איטי, ~ 25% מהחולים יחוו שיורית גירעונות פונקציונלי זה להפחית באופן משמעותי את איכות החיים שלהם6, 7.
EAN הוא מודל בעלי חיים בשימוש נרחב של demyelinating נוירופתיה אשר סיפקה תובנות לתוך פתוגנזה ואת אמצעי כדי להעריך את הרומן סוכני טיפולית4. מודל זה יכול להיגרם מינים שונים כגון ארנבות, חולדות, עכברים, שרקנים, הנגרמת על ידי חיסון עם אנטיגנים neurogenic. עם זאת, בסופו של דבר אינדוקציה EAN מוצלח תלוי תגובה חיסונית המתאים למחלה להתרחש. בהתחשב הווריאציות מינים (וגם בין-species/זן) בתפקוד המערכת החיסונית, צירופים מרובים של אנטיגנים וחיסונים adjuvants פותחו לזירוז בהצלחה EAN. מבחינת כלים גנטיים מאתר, C57BL/6 היא הנפוצה ביותר; עם זאת, פפטיד חלבון P2 מסורתי 57-81 (P257-81) זה גורם למחלה רגישים SJL העכבר זן8 אין אפשרות פתוגנזה איליקיט שמוביל לגירעונות פונקציונלי המתח C57BL/6. למרבה המזל, פרדיגמות רגישות עולה באמצעות P0106-125 או פפטידים180-199 P0, יועבר. בתוך אדג'וונט בשילוב עם ההזרקה של שעלת ניתן הרעלן להתגבר על מכשול זה הפעלת כלים גנטיים מתוחכמים להיות מנוצל מודל EAN מאתר.
כאן מוצגת שיטה פשוטה עבור אינדוקציה של EAN בעכברים C57BL/6. בנוסף, מסופק בגישה מפורט מקיף מאת בו יש להעריך את גירעונות neuropathological פונקציונלי הקשורים במחלה. פפטיד9 199 180–P0 נבחר העדפה P057-81 חלופי10. המודל199 P0180–שתיארנו לייצר סימנים קליניים חמורים פחות בהשוואה P057-81 אלטרנטיבית10ולכן נוטים לספוג את ההקדמה של פוטנציאל לפליטת גנטי ברישול, להתאושש הליכים כירורגיים (כגון משאבת osmotic השרשה), והוא נוטה הליכון בהליכה פונקציית בדיקת4. עם זאת, ההליכון הילוך תפקודי והפרוטוקולים היסטולוגית המתוארים כאן יכול בקלות להיות מיושם כשלמדתי המחלה ב- variant57-81 המושרה P0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים כאן ואושרו על ידי מכון Florey Neuroscience, ועדת האתיקה של בריאות הנפש (מרכז המוח מלבורן) חיה ופעל קוד האוסטרלי של התרגול עבור שימוש של בעלי החיים עבור מדעי מטרות.
1. EAN אינדוקציה
הערה: EAN יכולה להיגרם בהצלחה בעכברים C57BL/6 גברים בגילאי 6-8 שבועות. פרוטוקול אינדוקציה לוקח 9 ימים בסך הכל. יום 0 מתייחס ביום התחסנות הראשון. עבור פרוטוקול זה, נערכו זריקות תחת הרדמה (ראה שלב 1.1.2 להלן).
- על יום-1:
- להכין את הרעלן שעלת (ראה טבלה של חומרים) פתרון של 1.6 µg/mL באמצעות פוספט העכבר-מול סטרילי של 0.1 M buffered תמיסת מלח (MT-PBS).
- ההרדמה עם איזופלוריין:
- הנח את העכבר (C57BL/6, זכר, 6-8 שבועות) בבית הבליעה ההרדמה ולהתאים את זרימת החמצן 1 ליטר לדקה
- להדליק את מכשיר אידוי איזופלוריין, להתאים אותו ל- 2.5% עבור ההרדמה, והצג נושם, לחכות 2 דקות, או עד ראשי רפלקסים (האיבר הקרנית, האחוריות) הם כבר לא מגיבה
- להסיר את העכבר מן החדר ההרדמה ולפקח 250 µL של הפתרון שעלת הרעלן לעיל באמצעות הזרקה בקרום הבטן (i.p.) בעזרת מזרק 0.5 mL עם מחט 30 1/2 G.
- להכין את inoculum בזריקות חיסון:
- להכין פתרון A באמצעות 2 מ"ג/מ"ל תמיסת פפטיד 180-199 P0 (עם > טוהר 98%, רצף S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) ב- saline 0.9%.
- הכן B פתרון באמצעות 20 מ"ג/מ"ל תמיסת שחפת Mycobacterium (ראה טבלה של חומרים) בפרוינד ' s אדג'וונט מלאה (FCA, הכוללת: monoolate mannide 15% + 85% שמן פרפין, 0.5 מ"ג/מ"ל של שבבי נהרג ויבשים מ' Mycobacterium butyricum).
- לעשות את inoculum הסופית על הזרקת, לשלב חלקים שווים נפח של פתרונות A ו- B מכה חרוז ומערבבים אותם במהירות מקסימלית עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: פתרונות A ו- B יכול להיות שמר בתור מניות ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר חודש אבל inoculum הסופית משולב חייב להיות מוכן טרי ביום של הזריקה העכבר.
- ביום 0, לנהל µL 50 של inoculum (הכנה המתוארים שלב 1.1.4) לתוך עכבר באמצעות זריקה תת עורית באמצעות מחט 23 גרם-
הערה: הזרקת וניתן לשים בין השכמות, או בין הגפיים האחוריות הזנב סימטרית dorsum. - -1 יום, להפוך את הפתרון שעלת הרעלן של 1.2 µg/mL (ב- MT-PBS) ולפקח 250 µL לתוך עכבר באמצעות הזרקת i.p. באמצעות מזרק 0.5 mL עם מחט 30 1/2 G.
- על יום 3, חזור על שלב 1.3 לעיל.
הערה: פתרונות מניות A ו- B יכול להיות מורכב ומאוחסנים ב 4 הלעפה תרוטרפמט לתקופה מקסימלית של חודש אחד. עם זאת, inoculum להזרקה הסופי, המיוצר על ידי שילוב של פתרונות מניות A ו- B, חייב להיעשות ביום של הזריקה. - ביום 8, לנהל µL 50 של inoculum (הכנה המתוארים שלב 1.1.4) לתוך עכבר באמצעות זריקה תת עורית (ראה שלב 1.2 לעיל), באותו אתר הזרקת כמו שלב 1.2 (עבור כל חיה)
2. הניקוד קלינית
- לבצע קליניים ניקוד יומי החל ביום 0-
- לתת את העכבר כל ציון של 0, 1, 2, 3 או 4 לפי הקריטריונים שפורסמו 4. ראה טבלה 1 עבור ניקוד קליניים EAN.
הערה: עקביות, מאמץ כדי להבקיע עכברים באותו זמן מדי יום על ידי החוקר אותו.
3. מנוע הערכת פונקציה
הערה: ביצועי המנוע שקובעת במקביל הבקיע קליניים עבור אותה קבוצה של בעלי חיים. מנגנון הערכה המוטורית חייב להיות מחובר למחשב כי מערכת הדמיה של הפונקציה הילוך (ראה טבלה של חומרים) התקין. מומלץ גם כי עכברים כל לפנות לבדיקה צריך להיות בלתי לפעילות פועל לפני EAN אינדוקציה. כדי לעשות זאת, תרגולים (2 הרצפים מבחן לכל עכבר) מבוצעים שלושה ימים לפני המחלה אינדוקציה (יום-3)-
- להפעיל מנגנון הערכה המוטורית ולעבור על כפתור קלה.
- עורפה העכבר בחוזקה, דיו רגליה על ידי הורדתו לתוך מיכל מלא דיו אדום תוך החזקת זנבו.
הערה: שלב זה נדרש עבור המתח C57BL/6, אך ניתן לדלג אם זן עכבר עם צבע החלוק הלבן משמש. - הנח את העכבר לתוך תא הליכה ו להגדיר את מהירות הליכון-15 ס מ/s.
- להפעיל את ההליכון ולחץ " שיא " כפתור כדי ללכוד את התנועה המצטבר של העכבר באמצעות הפונקציה הילוך מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
- השתמש טיימר ולמדוד כל ריצה ל-36 s. לאחר 36 s, הקלטת עצור, עצור ההליכון.
הערה: עכברים אין אפשרות להשלים בהצלחה המשימה הפועלת עבור מרווח זמן 36 זה s נחשבים נכשלו. - לשמור את קובץ הווידאו בתיקיה המיועדת.
- חזור על השלבים שלעיל עבור כל עכבר לפנות לבדיקה. מבחן העכברים עם המשימה הפועלת באותו כל 3 ימים.
- לנתח את קבצי הווידאו הערוכות באמצעות תוכנה עבור פרמטרי הפונקציה הילוך (ראה טבלה של חומרים).
הערה: הפרטים של כיצד לנתח פרמטרים מוטוריים שונים להשתנות בין תוכנה אז נא לפנות ליצרן ' s הדרכה לפני ניתוח. כדי לקבל עדות היסטולוגית של עצב נזק המיאלין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיה רקמות ניתן לקחת על כל שלב פוסט המוטורית ההערכה בהתאם מטרות ספציפיות של מחקר או אימונוהיסטוכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P0180-199 פפטיד המושרה EAN ב- C57BL/6 הפניות עכברים במחלה monophasic עם הציון הקליני תחילת ממוצב 6 ימים חומרת הציון הראשונה של חיסון (dpi), מרבי נצפית של 25 dpi ואחריו את הציון הקליני כמה שיפור של 40 dpi משך (איור 1)4,9. מבחינת תפקוד ההליכה, עכברים להתחיל להיכשל מוקדם ככל 6 dpi-משימה פועלת פשוטה, ויש על ידי עכברים 35 dpi קיבולת קטנה כדי להשלים הליכון פשוט פועל פעילות ולשפר לא פועל יכולת אפילו ב- 55 dpi4 (איור 1). עכברים המושרה עם EAN ירדה בהדרגה ביכולתם לבצע את המשימה הפועלת לאורך זמן. הפעלת מכשל במשימה נצפית ב- 80% של עכברים, אך בנוסף, בהליכה הגפיים האחוריות הרחבת בהליכון ריצה ו פונקציונלי מפתח זה לא נפתרת על-פני משך המחלה4
ישנן מספר תכונות neuropathological מפתח ב- P0180-199 המושרה EAN: נזק למעטפת מיאלין; האקסון לחץ; צומת מוגברת רוחב ו נזק למבנים paranodal. בחינת למחצה דק מקטעים שנלקחו ממוגלה העצבים מגלה תחומי demyelination (איור 2B, חצים) לעומת ממוגלה העצבים מפני פקדי בריא מתאימים-גיל (איור 2 א). חשוב, זה אפשרי להשיג G-יחס של תמונות שנלכדו ממקטעים למחצה דק בעצב עם תמונה בעוצמה גבוהה עם מיקרוסקופ אור4. עם זאת, מתח גבוה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) תמונות נדרשים כדי לזהות תכונות neuropathological ספציפיות כגון dysmyelinaton, נזק lamella המיאלין, ומתח סימנים של האקסון כגון נפיחות מיטוכונדריאלי (disarrangement, עיוות של cristae ו cristolysis חלקי או מלא) (איור 2C–2D). בקנה אחד עם הראיות ultrastructural של האקסון מתח (איור 2C-2יח), המודל EAN180-199 המושרה P0 מציג גם נזק עצב חריפה, שהפגינו קודמן β-עמילואיד גבוהות באופן דרמטי חלבון (APP) ביטוי העצבים בירך (איור 3 א). זה הוא לא ציין ברקמות תואם גיל בקרה בריאים (איור 3 א). שינויים neuropathological את הצמתים, את paranodes תועדו היטב GBS; בפרט, אמן variant11,12. במודל EAN מאתר שלנו, אנו מזהים כי הרחבת של צמתים, הפרעה paranode הן תכונות neuropathological נוספות של P0180-199 המושרה EAN (איור 3B).
איור 1: ייצוג סכמטי של EAN אינדוקציה הפרדיגמה, קליניים ניקוד הערכת והקיבולת פועל במהלך EAN. () סקירה של EAN אינדוקציה פרוטוקול בעכברים C57BL/6, החל מ- 6-8 שבועות של גיל, עם שרטוט של (B) ציונים קליניים הצפוי ואת (C) פועל פעמים במהלך המחלה כמובן (ראה התייחסות4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: עכברים עם EAN מציגים המיאלין הפסד, נזק המיאלין סימני מצוקה אקסונים. (א) א שדה בהיר תמונה (תחת 100 X הגדלה) שנלקחו למחצה דק מקטעים של עצבים ממוגלה מקונטרול בריא מתאימים-גיל. תמונת שדה בהיר (B) א (תחת 100 X הגדלה) שנלקחו למחצה דק מקטעים של עצבים ממוגלה של עכברים המושרה עם EAN-55 ימים פוסט ראשון חיסונים (dpi). חסר המיאלין מוקפת דק ו דנדריטים (חץ) מצביעים על remyelination; זה לא נצפתה רקמה המתקבל מתאימים יישון פקדים בריא (ראה א'). (ג) A מיקרוסקופ אלקטרונים נציג התמונה (X 5,000 תחת הגדלה) נלקחה fromsciatic העצבים דרך פאנל B המפגינים פתולוגיה מיאלין (חץ פתוח) ומתח האקסון (ריבוע איגוד המציינת את המיטוכונדריה נפוחות ב 55 dpi). (ד) תמונת TEM מתח גבוה (תוחמת ג') המפגינים המיטוכונדריה נפוח זה מרמז על האקסון להדגיש (ראשי חץ), אבל זה נעדר מ תואם גיל פקדים בריא (נתונים לא מוצג). גודל ברים = 10 מיקרומטר (A, B), ו 500 ננומטר (C, D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: פתולוגיה קטרי והמתח האקסון הוא תכונה של P0180-199 המושרה EAN. (א) מישור יחיד קונאפוקלית תמונות (מתחת לגיל 40 X הגדלה) נלקח דרך העצבים ממוגלה ב 55 dpi. רקמת EAN עכברים להראות גבוהות באופן דרמטי ביטוי APP שותף מקומי עם β-III אנלוגיים טובולין (סמן של נוירונים) סימני מצוקה עצב. מתח גבוה (B) Z-תחזיות (100 X הגדלה) של paranodes צבעונית עם נוגדן נגד Caspr בסעיפים בעצב. בקשרי מ EAN עכברים, יש מרחק מוגברת בין paranodes סמוכים המציין הרחבת הצומת. בנוסף, פתולוגיה קטרי כגון הפרעה במבנה paranode יכול להיות שנצפו בעכברים EAN אך נעדר מ תואם גיל פקדים בריא. גודל ברים = 10 מיקרומטר (א) ו- 5 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הציון | קריטריונים | הערות והערות של הערכת קריטריונים |
| 0 | העכבר הרגיל | |
| 1 | פחות תוסס או lathery | זו שקובעת בתגובה טיפול רגיל, עכברים בדרך כלל קודם מראים סימנים של פעילות מופחתת ב מ התחסנות פוסט יום 5 |
| 2 | הזנב paresis או | הזנב paresis שקובעת בבחינה שבץ הזנב (מצליף את הזנב). |
| האיבר מתון paresis | האיבר מתון paresis מתייחס עכברים לגרור את הבטן שלהם על הקרקע בעת הליכה על משטח שטוח | |
| 3 | זנב paresis + paresis האיבר מתון או | אטקסיה קלה מוערך כמו כל קושי הליכה רגילה |
| זנב paresis + אטקסיה קלה או | ||
| האיבר מתון paresis + אטקסיה קלה | ||
| 4 | אטקסיה חמור | אטקסיה חמור מזוהה על-ידי טיפוסיות לאחור הליכה, בשילוב עם האיבר paresis, האיבר מתון paresis או זנב paresis |
טבלה 1: EAN קליניים ציון פרדיגמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דו ח זה מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום EAN באמצעות פפטיד180-199 P0 בעכברים C57BL/6, המאפשר כימות של גירעונות neuropathological ופונקציונליים מפתח בעכברים המושרה עם EAN. ברורים בפרוטוקול אינדוקציה EAN המתוארים כאן הוא השימוש של הרדמה תוך כדי ביצוע זריקות חיסון. השימוש איזופלוריין הרדמה משפר באופן משמעותי את היכולת להבטיח כי הנפח הכולל של inoculum מוזרק subcutaneously במיקום הרצוי עם שגיאה מינימלית ומתח החיות.
עכברים יתחיל להציג את הסימנים הקליניים של מחלת 6 dpi4 בשיטה זו האינדוקציה EAN. עם זאת, תחילת המחלה כפי שנמדד על ידי ציון קליני בעבר דווח להתרחש מ ~ 10 dpi9,10. ההפרש בין תחילת המחלה כפי שנקבע על ידי ציון קליני יכול להיות חלקית בשל קריטריונים הבקיע קליניים שונים, סביר יותר הסביר על ידי שימוש adjuvants שונים ב- inoculum עבור EAN אינדוקציה. פרוטוקול זה משתמש אדג'וונט מלאה של פרוינד המכיל butyricum מ', אשר השלים עם מ. שחפת. מחקרים אחרים להשתמש אדג'וונט של פרוינד שיושלם רק עם מ. שחפת ב inoculum מוזרק המכיל את P0180-199 פפטיד9,10 עבור חיסונים.
ב פרוטוקול זה, אספקת שעלת הרעלן באמצעות הזרקת i.p. מומלץ העדפה תוך ורידית (עירוי) זנב בהזרקה לווריד. הוכח כי המצב של שעלת משלוח אינה משנה באופן משמעותי תחילת או התקדמות המחלה4, אבל הבחירה להעביר דרך המסלול i.p., בניגוד הווריד הזנב של עירוי, מונע ע י במזעור הסיכונים, בניסיון להפחית סיכוי של הפעלה שגיאה. לעתים קרובות, זריקות עירוי לווריד הזנב הם יותר טכנית מאתגר לעומת זריקות של אמצעי אחסון שווה. בעבר הוכח כי השימוש של שעלת הרעלן אדג'וונט הכרחי לזירוז EAN בעת שימוש P0180-199 פפטיד9. מעניין, עבודה קודמים הראו כי halving את המינון של שעלת שתואר בשיטה זו מספיקה כדי לא חוקיות EAN נמדד על ידי ציון קליני, neuropathology הילוך הרחבת במהלך הליכון לרוץ4. עם זאת, הפחתת המינון של שעלת רעלן בשימוש ב במהלך EAN אינדוקציה באופן משמעותי משפיע ריצה קיבולת ולבצע עכברים באופן משמעותי יותר על ההליכון הפעלת המשימה EAN הוא המושרה עם מחצית הכמות שעלת שמתואר בשיטה זו 4.
גירעונות מוטורי נצפו במודל EAN זה P0180-199 פפטיד המושרה מלווה, נתמכת על ידי ראיות neuropathological חזקות. בעבר, זה הוכח כי לכימות היקף הנזק המיאלין הוא רגיש מספיק כדי לזהות שינויים בחומרת המחלה שנבעו halving את המינון של שעלת הרעלן במהלך EAN אינדוקציה. . כאן, מזוהים אחרים המחפשים EAN כגון מתח עצב ובהפסקות למבנים צומת/paranodal, והתוצאה היא חבילה של סמנים neuropathological כמותיים עבור P0180-199 המושרה EAN. פעולה זו מאפשרת לבחינות שקול יותר neuropathology בעת הערכת תהליכי מחלה, או את היעילות של הרומן סוכני טיפולית. Excitingly, הערכות neuropathological אלה עשויים להיות בקורלציה המפרט פונקציונלי בהצעה לספק תובנות עמוקות יותר, הבנה טובה יותר של הקשר בין neuropathology של גירעונות פונקציה כי הם תכונה של מודל זה של EAN. בנוסף על ניתוחים neuropathological ו מבחן תפקוד ההליכה מועסקים במחקר זה, הערכות פונקציונליים אחרים כגון מדידת מהירות הולכה עצב הם הציעו במטרה ללכוד באופן מלא תוצאות הפונקציה של התערבויות טיפוליות באמצעות מודל זה.
EAN הוא מודל ניסיוני עוצמה, נפוץ לבחון היקפיים demyelination ואת remyelination, עם העצבים בירך, זנב הסוס להיות הכי קרובות חקרו את העצבים ההיקפיים. היתרון העיקרי של EAN הוא כי התוצאה הדירים לכימות גירעון המנוע, ובכך לאפשר ניתוח של neuroprotection ותיקון המיאלין מנקודת מבט קליני. עוד יותר, הנזק המיאלין היא חריפה לשחזור ובכך מאפשר ניתוח מפורט של המיאלין ונזק עצב מנקודת מבט histopathological.
בעוד EAN דגם מייצג של רשע ניסיוני מרגש לחקור demyelinating נוירופתיה, קיימות מגבלות אפשריות, כמו גם אתגרים טכניים. חשוב להעריך את מהות הטרוגניות demyelinating נוירופתיה בבני אדם, המערבים של אינטראקציה מורכבת בין מערכת החיסון לבין מערכת העצבים ההיקפית. האתגר הנוכחי הוא במודל חיה אחת אין EAN בנאמנות שיכולים לחקות כל ההיבטים שלה. עוד יותר, ישנן וריאציות בין המינים ואת הבין-המתח משמעותי לגבי חומרת המחלה ו התקדמות של המודל EAN. לדוגמה, מצאנו את הכולל EAN המושרה בעכברים C67/B6 היא פחות חמורה מאשר EAN המושרה בחולדות לואיס (נתונים שלא פורסמו). בתוך המתח זהה, יש גם ההבדל בין המינים. שלנו נתונים שלא פורסמו להציג את המודל EAN המושרה בעכברים זכרים C57/B6 לשחזור יותר מאשר האחד המושרה בעכברים נקבה, עם זאת, הסיבה המדויקת לגורם המרכזי עליו מושתתת את הפער המגדרי הזה לא ברור.
לסיכום, אנו דיווח פרוטוקול המאפשר של אינדוקציה חזקה ומהירה של המודל EAN בעכברים C57/B6 זכר. שילוב של הניקוד קלינית והערכת בתפקוד המוטורי עם מחקרים neuropathological מספק כלי אסטרטגי ללמוד demyelinating נוירופתיה מזוויות קלינית והן פתולוגי. חשוב מכך, היא מקדמת מחקרים עתידיים על המנגנונים של טיפולים המיועדים לתיקון המיאלין במערכת העצבים ההיקפית באמצעות העכבר הטרנסגניים גישות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים בנוגע לזה לעבוד.
Acknowledgments
DGG הוא NHMRC פטר דוהרטי, אוסטרליה מחקר טרשת (MSRA) בתחילת הקריירה עמית. JLF נתמך על ידי הבתר MSRA. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומיים האוסטרלי, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) פרויקט הענק #APP1058647 ל- JX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R.
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G.
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
