Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Простой подход к побудить Экспериментальный аутоиммунный неврит мышей C57BL/6 для оценки функциональных и патологического

doi: 10.3791/56455 Published: November 9, 2017

Summary

В настоящем докладе излагается простой подход к успешно побудить экспериментальной аутоиммунных неврит (EAN) с использованием миелиновый белок ноль (P0)180-199 пептида в сочетании с полного адъюванта Фройнд и коклюша токсин. Мы представляем современные парадигмы способны точно оценить степень функциональной дефицита и невропатологии, которые происходят в этом EAN.

Abstract

Экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN) представляет собой хорошо оценили экспериментальный модель аутоиммунных периферийных демиелинизирующих заболеваний. МАКПТ болезни индуцируется иммунизация мышей с нейрогенной пептиды направлять нападение воспалительных сторону компонентов периферической нервной системы (ПНС). Последние достижения позволили индукции EAN в строке мыши относительно устойчивые C57BL/6, используя миелиновый белок ноль (P0)106-125 или P0180-199 пептиды доставлены в адъювант в сочетании с инъекции токсина коклюша. Способность вызывать EAN в штамм C57BL/6 позволяет для использования многочисленных генетических инструментов, которые существуют на этом фоне мыши и таким образом позволяет сложные исследования патогенеза заболевания и допроса механистический действий Роман терапии в комбинация с трансгенных подходов. В этом исследовании мы демонстрируем простой подход к успешно побудить EAN, используя P0180-199 пептида в мышей C57BL/6. Мы также наметить протокол для оценки функциональных дефициты, которые происходят в этой модели, в сопровождении массив патологического функций. Таким образом эта модель является мощным Экспериментальная модель для изучения патогенеза человека периферийных демиелинизирующих нейропатии и определить эффективность потенциальных терапий, которые направлены на содействие миелина ремонта и защиты от повреждения нерва в аутоиммунных неврит.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Периферические нейропатии может быть генетическое происхождение или приобретенные, с приобретенных невропатий, имеющих либо метаболических, ишемическая, воспалительных, или токсических выделений. Эти заболевания целесообразно также классифицируются как аксональное или demyelinative происхождение. Наиболее распространенных приобретенных демиелинизирующих периферической нейропатии, острые воспалительные демиелинизирующих полиневропатии (МАУП, также известный как синдром Гийена-Барре, GBS) и хронические воспалительные полиневропатии демиелинизирующих (ХВДП)1, 2 , 3 , 4; патогенетически оба характеризуются аутоиммунные реакции, направленной против Миелиновые оболочки, вызывая демиелинизации периферических нервов. При этих заболеваниях активированные Т-клетки пересечь барьер крови нерва и генерировать иммунной реакции в рамках ПНС. Активация макрофагов в нерв затем вызывает демиелинизации либо непосредственно через фагоцитарной атаки, или косвенно через секретируемые медиаторы воспаления, что приводит к клинической инвалидов как паралич и сенсорные дисфункции5. В то время как demyelinated аксоны сохраняют способность быть remyelinated после демиелинизации, remyelination часто задерживается или неполными, что приводит восприимчивости голый аксоны необратимый ущерб, который является основной причиной постоянного клинического инвалидности. В настоящее время наиболее эффективных методов лечения иммуномодулирующих, но несмотря на их эффективность во многих случаях восстановление часто является медленным и ~ 25% пациентов будут испытывать остаточный функциональные дефициты, которые значительно уменьшить их качество жизни6, 7.

EAN-широко используемых животных модель демиелинизирующих периферической нейропатии, которая предоставила ценную информацию в патогенезе и средства для оценки роман терапевтических агентов4. Эта модель может быть наведено в различных видов, таких как кролики, крыс, мышей и морских свинок и индуцированный иммунизации с нейрогенной антигены. Однако в конечном счете успешное индукции EAN зависит соответствующий иммунный ответ для болезни происходят. Учитывая видов (и Межамери-species/штамм) изменения в иммунной функции, были разработаны несколько комбинаций антигенов и адъювантов успешно побудить EAN. С точки зрения мышиных генетических инструменты C57BL/6 является наиболее широко используемым; Однако традиционные P2 белка пептидные 57-81 (P257-81), что приводит к болезни в подверженных SJL мыши штамм8 неспособен незаконным патогенеза, ведущих к функциональные дефициты в штамм C57BL/6. К счастью, сенсибилизации парадигмы с помощью P0106-125 или P0180-199 пептиды, доставлены в адъювант в сочетании с вдуванием коклюша токсин может преодолеть этот барьер, позволяя сложных генетических инструменты для использования в мышиных EAN модель.

Здесь представлен простой метод для индукции EAN мышей C57BL/6. Кроме того предоставляется подробный всеобъемлющий подход для оценки функциональных и патологического недостатки, связанные с болезнью. P0-180-199 пептид9 был выбран предпочтение P057-81 альтернативных10. P0180199 модель была описана производить менее тяжелые клинические признаки, по сравнению с57-81 альтернативных P010и поэтому вероятен выдержать введение потенциально пагубное генетических возмущений, оправиться от хирургических процедур (например, осмотических насосов имплантация) и поддается беговая дорожка походка функции тестирования4. Однако беговая дорожка походка функция тестов и гистологической протоколы, описанные здесь могут легко применяться при изучении болезни в варианте57-81 индуцированной P0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

все описанные здесь процедуры были одобрены Флори института неврологии и психического здоровья (центр Мельбурна мозга) Комитета по этике животных и следуйте Австралийский кодекс практики для использования животных для науки Целей.

1. МАКПТ индукции

Примечание: EAN может быть успешно вызван в самцов мышей C57BL/6, в возрасте 6-8 недель. Протокол индукции занимает 9 дней в общей сложности. День 0 относится к дню первого иммунизации. Для этого протокола, инъекции были проведены под наркозом (см. шаг 1.1.2 ниже).

  1. На день -1:
    1. подготовить коклюша токсин (см. Таблицу материалы) раствор 1,6 мкг/мл, с использованием стерильных 0,1 М мыши изотонический фосфат буфер солевой раствор (MT-PBS).
    2. Анестезии с изофлюрановая:
        ,
      1. Поместите курсор мыши (C57BL/6, миастения, 6-8 недель) в зале анестезии и отрегулировать поток кислорода до 1 Л/мин
      2. Включите изофлюрановая испарителем, настроить его в 2,5% для анестезии и монитор дыхания и ждать за 2 мин, или до первичных рефлексов (роговицы и задние конечности) больше не реагируют
    3. Удалить мыши из камеры для анестезии и управлять 250 мкл раствора выше коклюша токсин через инъекцию внутрибрюшинного (и.п.), с помощью 0,5 мл шприца с иглой 30 1/2 G.
    4. Подготовить инъекционные посевным материалом для иммунизации:
      1. подготовить решение A с помощью 2 мг/мл раствора P0 180-199 пептида (с > 98% чистоты, последовательность S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) в 0,9% физиологического раствора.
      2. Подготовить Решение B с использованием 20 мг/мл раствора микобактерии туберкулеза (см. Таблицу материалы) в Фройнд ' s полный адъювантной (FCA, состоящий из: 15% mannide monoolate + 85% парафинового масла и 0,5 мг/мл из высушенной убитых и сушеные butyricum M микобактерии).
      3. Сделать окончательный посевным материалом для инъекций, объединить части равного объема решения A и B в било шарик и смешайте их с максимальной скоростью за 1 мин при комнатной температуре.
        Примечание: Решения A и B можно держать как запас и хранить при 4 ° C для максимум один месяц, но комбинированные посевные окончательный необходимо свежеприготовленные на день инъекции мыши.
  2. На день 0, управлять 50 мкл посевным материалом (подготовка, описанные в шаге 1.1.4) в мышь через подкожные инъекции иглой 23 G.
    Примечание: Инъекции могут быть размещены между лопатками, или задних конечностей и хвост на тыльной поверхности хвостового.
  3. На 1 день сделать решение коклюша токсин 1,2 мкг/мл (в MT-PBS) и управлять 250 мкл в мышь через инъекции и.п., с помощью 0,5 мл шприца с иглой 30 1/2 G.
  4. На 3 день, повторите шаг 1.3 выше.
    Примечание: Фондовая решения A и B можно сделать и хранить при 4 ° c для более одного месяца. Однако, окончательное инъекционные посевным материалом, производится путем объединения запасов решения A и B, должно быть сделано в день инъекции.
  5. На 8-й день, управлять 50 мкл посевным материалом (подготовка, описанные в шаге 1.1.4) в мышь через подкожные инъекции (см. шаг 1.2 выше), в том же месте инъекции как шаг 1.2 (для каждого животного)

2. Клиническая забил

  1. выполняют клинических скоринга ежедневно начиная день 0.
  2. Дать каждой мыши счетом 0, 1, 2, 3 или 4 согласно опубликованных критериев 4. Приведены в таблице 1 для EAN клинических скоринга.
    Примечание: Для обеспечения согласованности, следует приложить Оценка мыши в то же время ежедневно же исследователь.

3. Моторные функции оценки

Примечание: Мотор производительности проводится параллельно с клинической забил же когорты животных. Моторную функцию оценки аппарат должен подключаться к компьютеру что походка функция визуализации системы (см. Таблицу материалы) установил. Рекомендуется также, что все мыши следует оценивать следует привыкли к выполняемой задачи до EAN индукции. Для этого, практика работает (2 тестовых запусков на мышь) выполняются три дня до болезни индукции (день -3).

  1. Включите аппарат оценки двигательной функции и переключатель на кнопке света.
  2. Загривок мыши твердо и чернила ее ноги, опустив его на контейнер с красными чернилами удерживая ее хвост.
    Примечание: Этот шаг необходим для штамма C57BL/6, но может быть пропущен, если используется мышь штамма с белым пальто цвета.
  3. Поместите курсор мыши в отсеке пешеходной и беговой дорожки скорость на 15 см/s.
  4. Повернуть на беговую дорожку и нажмите " запись " кнопку для захвата работает движения мыши, используя функцию походки, визуализации системы (см. Таблицу материалы).
  5. Использовать таймер и измерить каждый работает для 36 s. После 36 s, остановить запись и остановить беговая дорожка.
    Примечание: Мышей, которые не может успешно завершить выполняющееся задание для этого 36 интервала s, считаются провалились.
  6. Сохранить видео файл в указанной папке.
  7. Повторите вышеуказанные шаги для каждой мыши необходимо оценить. Протестировать мышей с той же запущенные задачи каждые 3 дня.
  8. Анализ редактировать видео файлов, с помощью программного обеспечения для параметров функции походки (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Подробности о том, как анализировать различные моторные параметры варьируются среди программного обеспечения так пожалуйста, обратитесь к производителю ' s инструкция перед анализом. Для получения гистологического свидетельства аксональное и повреждение миелина через иммуногистохимия или электронной микроскопии, животных тканей могут быть приняты на любой стадии пост моторную функцию оценки в зависимости от конкретных целей исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

P0180-199 пептид индуцированной EAN приводит мышей C57BL/6 монофазные болезни с клинической оценкой начала от 6 дней поста первого иммунизации (dpi) и максимальная оценка тяжести наблюдается от 25 ДОИ следуют некоторые клиническая оценка улучшение от 40 dpi Продолжительность (рис. 1)4,9. С точки зрения функции походки мышей начинают неудачу в простой выполняющаяся задача 6 ДОИ в кратчайшие сроки и 35 dpi мыши имеют мало возможностей для завершения простой беговой дорожке запуск задачи и не улучшится в управлении способность даже на 55 dpi4 (рис. 1). Мышей индуцированных с EAN, в их способности выполнять выполняющаяся задача со временем постепенно сократилось. Запуск задачи неудачи наблюдается в 80% мышей, но помимо этого, Задние конечности походки, расширение в беговая дорожка является ключевой функциональной дефицит, что не удалось решить с длительностью заболевания4.

Есть несколько ключевых особенностей патологического в P0180-199 индуцированной EAN: ущерб Миелиновые оболочки; аксон стресса; и увеличение узел ширина и повреждение paranodal структур. Изучение полутонкая разделы взяты из седалищного нервов показывает области демиелинизации (Рисунок 2Б, стрелки) по сравнению с седалищного нервов от соответствует возрасту здоровых элементов (рис. 2A). Важно отметить, что можно получить от изображений, полученных от секции полутонкая седалищного нерва, отображаемого при высокой мощности с световой микроскопии4G-коэффициенты. Однако, высокой мощности передачи электронной микроскопии (ТЕА) образы требуются для идентификации конкретного патологического функции, такие как dysmyelinaton, повреждение миелина ламель, и признаки аксона подчеркнуть как митохондриальных отек (disarrangement и искажение макул и частичной или полной cristolysis) (рис. 2 c2D). В соответствии с ультраструктурных доказательств аксона стресса (рис. 2 c-2D), модель EAN180-199 индуцированной P0 также отображает острый аксональное повреждение, свидетельствуют резко повышенные β-амилоида прекурсоров выражение протеина (APP) в седалищного нервов (рис. 3A). Это не наблюдается в тканях соответствует возрасту здорового управления (рис. 3A). Патологического изменения на узлы и paranodes были хорошо задокументированы в ГБС; в частности, Аман вариант11,12. В нашей модели мышиных EAN, мы определяем, что расширение узлов и нарушения paranode имеются дополнительные патологического от P0180-199 индуцированной EAN (рис. 3B).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение EAN индукции парадигмы, клиническая оценка оценки и работает потенциала во время EAN. (A) Обзор EAN индукции протокола мышей C57BL/6, начиная с 6-8 недель возраста, с схемы (B) ожидаемых клинической оценки и (C) время работы во время болезни курс (см. ссылку4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: мышей с ЕАН отображения миелина потеря, повреждение миелина и признаки стресса аксоны. (A) A яркие поле изображение (100 крат) взяты из полутонкая разделы седалищного нервов от соответствует возрасту здорового управления. (B) светлые области изображения (до 100 крат) взяты из полутонкая разделы седалищного нервов от мышей, индуцированной с ЕАН на 55 дней пост первого иммунизации (dpi). Районах, не имеющих миелина, окруженный тонко Миелинизированные аксоны (стрелок) указывают remyelination; Это не наблюдалось в ткани, полученные от возраста согласованной здоровых элементов (см). (C) A представитель электронной микроскопии изображение (до 5000 X) принято fromsciatic нервы от группы B, демонстрируя миелина патологии (открытые стрелка) и аксон стресса (площадь привязки указывающее опухшие митохондрий в 55 dpi). (.D) образ ТЕА высокой мощности (ограничивающий прямоугольник в C) демонстрируя опухшие митохондрий, которые свидетельствуют о аксона стресс (стрел), но это соответствует возрасту здоровых элементов управления (данные не показаны). Масштаб баров = 10 мкм (A, B) и 500 Нм (C, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Axon стресс и узловой патологии является особенностью P0180-199 индуцированной EAN. (A) одной плоскости конфокальный снимки (40 кратном) через седалищного нервов в 55 dpi. Ткани от мышей EAN Показать резко повышенных выражение APP совместно локализованы с β-III тубулин (маркер нейронов) указанием признаки аксональное стресса. (B) высокая мощность Z-прогнозы (100 крат) из paranodes, окрашенных с антитело против Caspr в разделах седалищного нерва. В узлах от МАКПТ мышей это увеличение расстояния между соседними paranodes, указывающее узел расширения. Кроме того, можно наблюдать в EAN мышей узловой патологии такие нарушения в структуре paranode, но отсутствует от соответствует возрасту здорового контроля. Масштаб баров = 10 мкм (A) и 5 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Оценка Критерии Примечания и комментарии критерии оценки
0 Нормальные мыши
1 Менее живой или взмыленных Это оценивается в ответ на нормальной обработки, мышей обычно первые признаки снижения активности от день 5 пост иммунизации в
2 Хвост парез или Хвост парез оценивается хвост ход испытания (стряхивая хвост).
Парез конечностей мягкая Парез конечностей мягкая относится к мыши перетащите их живот на земле при ходьбе на плоской поверхности
3 Хвост парез + парез мягкая конечности или Мягкая атаксии оценивается как любой сложности в обычной ходьбе
Хвост парез + мягкая атаксия или
Парез мягкая конечности + мягкая атаксии
4 Тяжелые атаксии Тяжелая атаксии идентифицируется по нетипичным назад пешком, в сочетании с парез конечностей, парез мягкий конечности или хвост парез

Таблица 1: EAN клиническая оценка парадигмы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В настоящем докладе излагается простой способ заставить EAN используя P0180-199 пептида в мышей C57BL/6, позволяя количественная оценка ключевых патологического и функциональные дефициты мышей, индуцированной с EAN. Собственный протокол индукции EAN, описанный здесь является использование анестезии во время выполнения инъекции иммунизации. Использование изофлюрановая анестезии значительно повышает способность обеспечить, что общий объем посевным материалом вводится подкожно в нужном месте с минимальной ошибки и стресс для животных.

Мыши начнут отображения клинические признаки заболевания от 6 dpi4 с помощью этого метода индукции EAN. Однако заболевания как измеряется клиническая оценка ранее сообщалось происходят от ~ 10 dpi9,10. Хотя эта разница в заболевания определяется клиническая оценка может частично объясняться различные клинические критерии оценки, это более вероятно, объясняется использованием различных адъювантов в посевным материалом для индукции EAN. Этот протокол использует Фройнд полный адъювант, содержащий м. butyricum, который дополняется микобактерий туберкулеза. Другие исследования использовать Фройнд в адъювантной только дополнить микобактерий туберкулеза в вводят посевным материалом, содержащих P0180-199 пептид9,10 для иммунизации.

В этом протоколе, доставку коклюша токсин через и.п. инъекции рекомендуется вместо внутривенно (и.в.) хвост инъекции Вену. Было показано, что режим поставки коклюша не повлияют начала или прогрессирование болезни4, но выбор, чтобы доставить через маршрут и.п., в отличие от вен хвост и.в., мотивируется снижения рисков и попытка уменьшить возможность эксплуатации ошибка. Часто хвост вен и.в. инъекции являются технически более сложным по сравнению с инъекции одинакового объема. Ранее было показано, что использование коклюша токсин в качестве адъюванта необходимо побудить ЕАН при использовании P0180-199 пептид9. Интересно, что предыдущая работа показывает, что вдвое доза коклюша, изложенные в этом методе, достаточно для незаконной EAN, измеряется клиническая оценка, невропатологии и походки, расширение во время беговой дорожке работает4. Однако, уменьшение дозы токсина коклюша используется в ходе EAN индукции существенно влияет на запуск потенциала, и мышей выполняют значительно лучше на беговой дорожке запуск задачи при EAN наведено с половины дозы коклюша, описанные в этом методе 4.

Мотор дефицит наблюдается в этой модели EAN пептид индуцированной180-199 P0 сопровождал и сильным патологического свидетельствами. Ранее было продемонстрировано, что количественная оценка масштабов ущерба миелина достаточно чувствительным, чтобы обнаружить изменения в тяжести заболевания, что в результате сокращения наполовину доза токсина коклюша во время индукции EAN. Здесь определяются другими отличительными чертами EAN аксональное стресс и нарушения структуры узла/paranodal, приводит в набор количественных патологического маркеров для P0180-199 индуцированной EAN. Это позволяет для более осторожных экзаменов невропатология, при оценке процессов болезни, или эффективность новых терапевтических агентов. Возбуждающе эти патологического оценки может быть соотнесена функциональных отсчетов в стремлении обеспечить более глубокое понимание и более глубокому пониманию взаимосвязи между невропатологии и дефицита функции, которые являются особенностью этой модели EAN. Помимо патологического анализов и походка функция теста, занятых в этом исследовании другие функциональные оценки как измерение скорости проводимости нервных предлагаются для того, чтобы полностью захватить функции результаты терапевтических вмешательств с использованием Эта модель.

МАКПТ является мощным и часто используемые Экспериментальная модель для изучения периферических демиелинизации и remyelination, с седалищного нервов и конского хвоста, наиболее часто расследование периферических нервов. Основным преимуществом EAN является, что это приводит к воспроизводимость и количественному моторного дефицита, таким образом позволяя анализ нейропротекции и миелина ремонта с клинической точки зрения. Кроме того повреждение миелина, острый и воспроизводимые таким образом позволяя подробные анализы миелина и аксональное повреждение с точки зрения гистопатологические.

В то время как EAN модель представляет захватывающие экспериментальной означает расследовать демиелинизирующих периферической нейропатии, существуют потенциальные ограничения, а также технические проблемы. Важно оценить характер неоднородности демиелинизирующих периферической невропатии в организме человека, с участием сложное взаимодействие между иммунной системы и ПНС. Текущий задача состоит в том, что без одна модель животных EAN добросовестно может имитировать все ее аспекты. Кроме того есть существенные различия межвидовой и Интер штамм о тяжести заболевания и прогрессирования EAN модели. Например мы обнаружили, что в целом, EAN, индуцированной в C67/B6 мышей является менее серьезным, чем EAN, индуцированной в Льюис крыс (неопубликованные данные). В пределах же штамм есть также гендерные различия. Наши неопубликованные данные показывают, что модель EAN, индуцированной в самцов мышей C57/B6 воспроизводима более чем один, индуцированной в самок мышей, однако, точная причина, лежащие в основе этой гендерные различия является неясным.

В заключение мы сообщили это протокол, позволяющий надежной и быстрой индукции EAN модели в самцов мышей C57/B6. Сочетание клинической скоринга и двигательной функции оценки с патологического исследования обеспечивает стратегическим инструментом для изучения демиелинизирующих периферической невропатии с точки зрения клинической и патологические. Важно отметить, что она способствует будущего исследования механизмов терапии, ориентированные на ремонт миелина периферических нервов, с использованием подходов трансгенные мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов об этой работе.

Acknowledgments

DGG-NHMRC Питер Доэрти и начале карьеры парень рассеянный склероз исследований Австралии (MSRA). JLF поддерживается MSRA докторантура стипендий. Эта работа была поддержана австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) проекта предоставить JX #APP1058647.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin List Biological Laboratories, Inc., CA, USA #181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane Pharmachem, QLD, Australia Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) Difco, MI, USA #231141
Freund's complete adjuvant (FCA) Difco, MI, USA #263910
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services #15710 Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia #11-30-8 Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SL189 Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia SA030 Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium Sakura Finetek, CA, USA #4583
Normal donkey serum Merck Millipore, MA, USA #S30-100 Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100 Sigma Aldrich, MI, USA #90o2-31-1 Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) Invitrogen (Life Technologies), CA, USA S12700 Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA Various Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution Dako (Agilent), CA, USA #S3023 Each laboratory will have their own preference.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles BD #326105
23 g needles BD #305143
Red ink pad Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill) eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch Any timer may be used.
DigiGait 8 Software eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope Zeiss Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd SF41296SP
Cyrostat Leica Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene GeneTex (USA) Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope Zeis LSM780 Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J National Institues of Health Available from www.fiji.sc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69, (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126, (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87, (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76, (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10, (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18, (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39, (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8, (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62, (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64, (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40, (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25, (1), 33-51 (1996).
Простой подход к побудить Экспериментальный аутоиммунный неврит мышей C57BL/6 для оценки функциональных и патологического
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).More

Gonsalvez, D. G., Fletcher, J. L., Yoo, S. W., Wood, R. J., Murray, S. S., Xiao, J. A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (129), e56455, doi:10.3791/56455 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter