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एक प्राथमिक मानव Trophoblast मॉडल अपरा में Autophagy के विनियमन पर मातृ मोटापा के साथ जुड़े सूजन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Published: September 27, 2017 doi: 10.3791/56484
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत मानव अपरा villous प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए cytotrophoblasts के अलगाव के बाद ऊतक के नमूने के लिए एक प्रोटोकॉल है । मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में TNFα recapitulates सूजन के साथ trophoblasts के उपचार और मातृ मोटापे के साथ अपरा में सूजन द्वारा विनियमित आणविक लक्ष्यों की खोज की सुविधा ।

Abstract

मातृ मोटापा प्रतिकूल प्रसवकालीन परिणामों की संभावना है कि समझौता अपरा समारोह है कि करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता द्वारा मध्यस्थता कर रहे है के एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है, भाग में, autophagy के dysregulation । मोटापे और गर्भावस्था दोनों के साथ जुड़े भड़काऊ प्रक्रियाओं से विनियमित किया जा सकता है मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से अपरा में autophagy नियामकों की अभिव्यक्ति में ंयायपालिका परिवर्तन । यहां वर्णित villous ऊतक और प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए शब्द मानव अपरा से villous cytotrophoblasts के अलगाव के नमूने के लिए एक प्रोटोकॉल है । यह ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) के साथ दुबला गर्भधारण से प्राथमिक trophoblasts का इलाज करके मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में भड़काऊ वातावरण अनुकरण के लिए एक विधि के द्वारा पीछा किया है, एक भड़काऊ cytokine कि मोटापे में और ऊंचा है गर्भावस्था. प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के माध्यम से यहां वर्णित है, यह पाया है कि exogenous TNFα के लिए जोखिम फ़ैसला की अभिव्यक्ति, autophagy का एक नकारात्मक नियामक, दुबला गर्भधारण से trophoblasts में महिला भ्रूण के साथ नियंत्रित करता है । जबकि मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में जैविक कारकों की एक किस्म trophoblasts में महत्वपूर्ण रास्ते मिलाना करने की क्षमता बनाए रखने के लिए, इस पूर्व vivo प्रणाली अभिव्यक्ति पैटर्न vivo में मनाया तो निर्धारित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है मातृ-मोटापे के साथ मानव अपरा में TNFα सिगनल का सीधा परिणाम है. अंततः, इस दृष्टिकोण से बाहर autophagy और अंय महत्वपूर्ण सेलुलर रास्ते पर मातृ मोटापा के साथ जुड़े सूजन के विनियामक और आणविक प्रभाव को पार्स करने का अवसर देता है कि प्रभाव की क्षमता है trophoblasts में अपरा लिहितो.

Introduction

मोटापा एक भड़काऊ राज्य क्रोनिक कम ग्रेड सूजन की विशेषता है, अतिरिक्त वसा ऊतक और पोषक तत्वों की उपलब्धता से उपजी है । मोटापा में, भड़काऊ साइटोकिंस चयापचय ऊतकों में ऊंचा कर रहे हैं और साथ ही प्रणालीबद्ध संचलन में । सबूत के एक मजबूत शरीर से पता चला है कि TNFα काफी इंसुलिन प्रतिरोध और चयापचय रोग में निहितार्थ के साथ मोटापे की सेटिंग में ऊंचा है1. TNFα के सक्रियकरण भी इस तरह के कैंसर और प्रतिरक्षा के रूप में शर्तों में रोगजनन रोग के लिए योगदान देता है, यह एक आकर्षक चिकित्सकीय लक्ष्य2बना रही है ।

मोटापे में सूजन गर्भावस्था से जटिल है, यह भी एक भड़काऊ राज्य3,4. इसमें पहले दिखाया गया है कि महिला भ्रूण के साथ गर्भधारण में मातृ adiposity के साथ अपरा TNFα कंटेंट बढ़ जाता है । इसके अलावा, TNFα उपचार मादा लेकिन नहीं पुरुष trophoblast कोशिकाओं में mitochondrial श्वसन रोकता है, सुझाव है कि TNFα एक यौन अपरा तरीके से dimorphic चयापचय को विनियमित करने में शामिल है5. मातृ मोटापा गर्भावस्था के दौरान जटिलताओं की एक किस्म की वृद्धि हुई घटना के साथ जुड़ा हुआ है, मृतशिशु सहित, पुरुष भ्रूण के साथ सबसे अतिसंवेदनशील जा रहा है3,6,7,8 . मातृ-भ्रूण अंतरफलक में अपनी प्रमुख भूमिका के कारण, भड़काऊ संकेत के जवाब में मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में अपरा की कार्यात्मक क्षमता में परिवर्तन मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण के परिणामों मध्यस्थता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं ।

Cytotrophoblasts और syncytiotrophoblasts नाल के villous ऊतक में अंत-स्रावी संकेत और पोषक तत्वों और मां और विकासशील भ्रूण के बीच ऑक्सीजन विनिमय के लिए महत्वपूर्ण हैं9. villous cytotrophoblasts के कार्यात्मक क्षमता में व्यवधान (इसके बाद trophoblasts के रूप में निर्दिष्ट) भ्रूण स्वास्थ्य और विकास ख़तरे में डालना हो सकता है । इस प्रोटोकॉल villous ऊतक के मानव शब्द अपरा से दूर chorionic और बेसल प्लेट प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए trophoblasts के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया के साथ साथ विदारक द्वारा नमूने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । इस प्रोटोकॉल स्थापित villous ऊतक के एंजाइमी पाचन को शामिल तरीके से extracellular मैट्रिक्स से कोशिकाओं को जारी करने के लिए अंतर घनत्व केंद्रापसारक के बाद trophoblasts को अलग करने के लिए10से व्युत्पंन है, 11,12. इस प्रोटोकॉल विवरण एक दृष्टिकोण है जो में दुबला गर्भधारण से अपरा से प्राथमिक trophoblasts संस्कृति मीडिया TNFα के साथ पूरक के लिए मातृ मोटापे से जुड़े भड़काऊ वातावरण के एक घटक अनुकरण के साथ इलाज कर रहे हैं । अंत में, पश्चिमी सोख्ता द्वारा जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के बाद TNFα-स्वास्थ्यकर्मी trophoblasts से कुल कोशिका lysates संचयन के लिए एक सरल प्रक्रिया बताई गई है.

हालांकि इस मॉडल अपनी संपूर्णता में utero वातावरण में obesogenic दोहराऊंगा नहीं करता है, यह एक नियंत्रित प्रणाली है कि एक बाहर TNFα के व्यक्तिगत योगदान को पार्स करने की अनुमति देता है प्रदान करता है ' trophoblasts प्रतिक्रिया में मध्यस्थता सूजन मातृ मोटापा । इस मॉडल दोनों को खोजने के लिए या आणविक लक्ष्यों की पुष्टि सीधे trophoblasts में संकेत TNFα द्वारा विनियमित अवसर के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक अगर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन का परीक्षण करने की अनुमति देता है का मौका मातृ के साथ अपरा में vivo में मनाया मोटापा TNFα-मध्यस्थता सूजन का एक परिणाम हो सकता है ।

यहां वर्णित दृष्टिकोण मानव trophoblasts में autophagy के विनियमन पर TNFα-मध्यस्थता सूजन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया था । पुरुष भ्रूण प्रदर्शन के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से Trophoblasts बाधित autophagic कारोबार, या autophagosome परिपक्वता13। एक प्रोटीन फ़ैसला कहा जाता है (भागो डोमेन प्रोटीन Beclin1-बातचीत और cysteine संपंन युक्त), जो lysosomes और देर endosomes के लिए स्थानीय है, हाल ही में autophagic कारोबार की प्रक्रिया में एक "ब्रेक" के रूप में वर्णित है क्योंकि यह एक नकारात्मक के रूप में कार्य autophagosome परिपक्वता14,15के नियामक । वास्तव में, फ़ैसला एक प्रोटीन का एक दुर्लभ उदाहरण है जो autophagy को नियंत्रित करता है, जो इसे एक मूल्यवान चिकित्सीय लक्ष्य बनाता है । बहुत कम जानकारी के लिए निर्णय के pathophysiological महत्व के बारे में उपलब्ध है, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में अपनी भूमिकाओं के लिए छोड़कर माइक्रोबियल16,17 और cardiomyocyte संरक्षण18। प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, यह पाया है कि फ़ैसला महिला प्राथमिक trophoblasts में TNFα की बढ़ती सांद्रता के साथ उपचार के जवाब में अनियमित है २५० स्नातकोत्तर/ फ़ैसला के विनियमन कैसे महिला भ्रूण गर्भधारण में पुरुषों की तुलना में बेहतर मातृ मोटापे के साथ किराया में एक भूमिका निभा सकता है । Recapitulating सूजन मातृ मोटापा के साथ जुड़े पूर्व vivo मानव trophoblasts को उजागर द्वारा exogenous TNFα में महत्वपूर्ण रास्ते के विनियमन पर मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी पर्यावरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है trophoblasts और एक्सटेंशन द्वारा, अपरा फ़ंक्शन ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > अपरा विश्वविद्यालय अस्पताल में श्रम और प्रसव इकाई से एकत्र किए गए एक प्रोटोकॉल ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय के पोर्टलैंड, ओरेगन में संस्थागत समीक्षा बोर्ड, से सूचित सहमति से अनुमोदित के तहत मरीजों को.

< p class = "jove_title" > 1. अपरा टिशू का कलेक्शन

  1. वडा
    नोट: सभी उपकरण है कि मुठभेड़ों ऊतक बाँझ होना चाहिए ।
    1. ६० मिनट के लिए autoclaving द्वारा विदारक उपकरण का बंध्याकरण १२१ & #176; ग.
    2. व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें: लैब कोट/गाउन/हाथ ढाल या काले चश्मे के साथ, दस्ताने, और मुखौटा ।
    3. पानी स्नान पर बारी और ३७ को सेट & #176; ग.
    4. गर्म २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों, प्रत्येक युक्त 25 मिलीलीटर पूरा मीडिया (Iscove & #39; s संशोधित Dulbecco & #39; s माध्यम पूरक के साथ 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, Table 3 ) in a ३७ & #176; C जल स्नान.
    5. रोगी की सहमति के साथ, एक अपरा तुरंत सीजेरियन सेक्शन द्वारा प्रसव के बाद प्राप्त ।
    6. अपरा से परिचित हो जाते हैं । गर्भनाल भ्रूण पक्ष (chorionic प्लेट) पर डाला जाता है और रक्त वाहिकाओं गर्भनाल सम्मिलन साइट से बाहर radiating देखा जा सकता है । विपरीत पक्ष मातृ पक्ष, या बेसल प्लेट है । यह decidua और संरचनाओं कि पोत पेड़ होते हैं, cotyledons बुलाया शामिल हैं ।
  2. sample of Villous ऊतक
    नोट: Villous ऊतक अपरा से जितनी जल्दी हो सके प्रसव के बाद, अधिमानतः 30 मिनट या उससे कम में नमूना लिया जाना चाहिए ।
    1. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ chorionic थाली के साथ, उत्पाद 2-3 पूर्ण मोटाई वर्गों (लगभग २.५ सेमी x २.५ सेमी आकार में) 2-3 सेमी में अपरा की परिधि से यादृच्छिक पर, संदंश और कैंची का प्रयोग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
      नोट: अपरा के उन भागों से बचें जो असामान्य दिखाई देते हैं (अर्थात सफ़ेद calcifications).
    2. chorionic और बेसल प्लेट और किसी भी बड़े रक्त वाहिकाओं दूर ट्रिम कर दीजिए ।
    3. जगह परिणामी villous ऊतक (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b , लगभग ८०-१२० जी कुल) गर्म पूरा मीडिया में और नमूना के 30 मिनट के भीतर trophoblast अलगाव शुरू.
      नोट: कुछ बहाव परख और आवेदन वितरण, नमूना, और trophoblast अलगाव के बीच विलंबता अवधि की लंबाई से प्रभावित हैं । यह संभव के रूप में कम और अलगाव के बीच लगातार के रूप में इन अवधि रखने के लिए सबसे अच्छा है ।
    4. चरणों में वर्णित तकनीकों का उपयोग करना 1.2.1-1.2.2, villous ऊतक के 5 यादृच्छिक 1 सेमी x 1 सेमी खंड अपरा (केंद्र सहित) भर से ।
    5. 4-5 छोटे टुकड़ों में प्रत्येक 1 सेमी x 1 सेमी villous ऊतक के नमूने में कटौती (लगभग 30 मिलीग्राम प्रत्येक), 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में जगह है, और तरल एन 2 में फ्लैश फ्रीज । स्टोर पर-८० & #176; ग में प्रयोग के लिए बाद में िरा.
< p class = "jove_title" > 2. अलगाव से Trophoblasts Villous ऊतक

  1. तयारी
    नोट: बाँझ उपकरण का उपयोग करें और एक लामिना प्रवाह हुड में कोशिकाओं को शामिल प्रक्रियाओं प्रदर्शन.
    1. गल चार जमे हुए घनत्व ढाल ( तालिका 1 , आवश्यक आपूर्ति की तालिका देखें, रिएजेंट, और उपकरण, अनुपूरक सामग्री) पर 4 & #176; C अपरा आने से पहले रात ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, घनत्व ढाल अलगाव के दिन पर किया जा सकता है ।
    2. मोड़ पर केंद्रापसारक और सेट करने के लिए 20 & #176; C.
      नोट: सभी केंद्रापसारक कदम अधिकतम त्वरण और मंदी पर है जब तक अंयथा निर्दिष्ट ।
    3. तैयार 1x HEPES-बफ़र्ड नमक समाधान (HBSS) के साथ पूरक Ca + 2 और मिलीग्राम + 2 ( तालिका 3 ).
    4. उष्ण trypsin ते ३७ & #176; ग.
    5. पतला DNase को लगभग २७२० kilounits/एमएल में बाँझ पूरक HBSS.
      6. नवजात बछड़ा सीरम (एनसीएस) का
    6. गर्म ५० मिलीलीटर से ३७ & #176; C.
    7. गर्म पूरा मीडिया को ३७ & #176; ग.
    8. उष्ण जमने मीडिया (९०% FBS, 10% DMSO, Table 3 ) से ३७ & #176; C.
      सावधानी: DMSO विषाक्त है और दस्ताने के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    9. तैयार पाचन बफर ( तालिका 2 और 3 ) पूरक HBSS के ३०८ मिलीलीटर, Trypsin के ५० मिलीलीटर (३७५१.७ BAEE इकाइयों/एमएल), और DNase (३७९.४ kilounits/एमएल) के ०.५ मिलीलीटर एक बाँझ बोतल में मिश्रण से ।
      नोट: अनुमानित समय villous ऊतक से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है 7 h.
  2. प्रसंस्करण Villous ऊतक
    1. कुल्ला Villous ऊतक के प्रत्येक टुकड़ा में एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ भरा । दोहराएं और अतिरिक्त रक्त निकाल दिया जाता है जब तक आवश्यक के रूप में पंजाबियों की जगह (पंजाबियों कुल्ला हल्के लाल या गुलाबी हो जाएगा जब ऊतक अच्छी तरह से कुल्ला किया है) ।
    2. एक बाँझ पेट्री पकवान में villous ऊतक जगह है और धीरे से एक खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग कर जहाजों से नरम villous ऊतक परिमार्जन से संभव के रूप में कई रक्त वाहिकाओं के रूप में हटा दें.
    3. पतले परिणामी villous ऊतक कैंची का उपयोग कर कीमा.
  3. Villous टिशू पाचन और Trophoblasts
    1. के कच्चे अलगाव की गणना की Villous के विशिष्ट गतिविधि के आधार पर परिकलित मात्रा के अनुसार पाचन समाधान के साथ एक बाँझ बोतल कीमा बनाया हुआ trypsin ऊतक हस्तांतरण और DNase (१६५ एमएल, टेबल 2 ).
    2. में ३५ मिनट के बाद एक ३७ & #176; सी जल स्नान प्रति मिनट ७० क्रांतियों पर मिलाते हुए के साथ (rpm), अपनी तरफ पाचन बोतल झुकाव और ऊतक के अपच टुकड़े बोतल के नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं । ध्यान से एक सीरम पिपेट के साथ supernatant आकर्षित, बसे ऊतक से परहेज ।
    3. supernatant के माध्यम से एक १०० & #181; मीटर सेल छलनी समान रूप से ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के बीच ।
      नोट: समय बचाने के लिए, यह पाचन समाधान (११० मिलीलीटर, तालिका 2) को जोड़ने के द्वारा दूसरा पाचन शुरू करने के लिए सलाह दी जाती है शेष बसे ऊतक और कदम 2.3.2 में वर्णित के रूप में शुरू करने की मशीन ।
    4. धीरे एक सीरम पिपेट से ट्यूब के नीचे से तिरस्कृत द्वारा तनावपूर्ण supernatant नीचे एनसीएस के 3-5 मिलीलीटर परत । तनावपूर्ण supernatant (युक्त trophoblasts) और एनसीएस के बीच एक meniscus (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ) दिखाई जानी चाहिए.
    5. केंद्रापसारक supernatants पर एनसीएस पर 15 मिनट के लिए १,२५० x g पर 20 & #176; C. परिणामस्वरूप गोली निचले सबसे परत trophoblast कोशिकाओं (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ) युक्त एक सफेद परत के बाद में लाल रक्त कोशिकाओं को शामिल किया जाएगा.
    6. दोहराने कदम 2.3.2- -6 द्वितीय और तीसरे डाइजेस्ट के प्रत्येक के लिए (जोड़ने ११० मिलीलीटर और ८३.५ एम, क्रमशः, पाचन समाधान के ऊतकों की बोतल के लिए, तालिका 2 ).
    7. एक बार सभी supernatantsed किया गया है, गर्म पूरा मीडिया के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली reसस्पेंड, और फिर एक साथ निलंबन पूल ।
    8. २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के बीच समान रूप से सेल निलंबन विभाजन और 15 मिनट के लिए १,२५० x g पर 20 & #176; C.
    9. धीरे supernatant निकालें और गर्म compl के 6 मिलीलीटर में सेल छर्रों के प्रत्येक reसस्पेंडन इट् मिडिया.
  4. घनत्व केंद्रापसारक
    1. चार घनत्व ढाल के बीच समान रूप से सेल निलंबन विभाजित (3 मिलीलीटर प्रत्येक) धीरे से और ध्यान से एक स्थानांतरण प्लास्टिक के साथ घनत्व ढाल के शीर्ष पर सेल निलंबन layering.
    2. 20 मिनट के लिए १,२५० x g पर घनत्व ढाल केंद्रापसारक 20 & #176 में ंयूनतम त्वरण और मंदी के साथ; सी । यह तलछटी कोशिकाओं ( तालिका 4 ) के भेद बैंड का उत्पादन करना चाहिए.
    3. धीरे और ध्यान से (३५ & #160;-५०% डीजीएम) के बीच trophoblast कोशिकाओं युक्त अपारदर्शी बैंड (ओं) के बीच तक घनत्व ढाल मीडिया (डीजीएम) के शीर्ष परतों को हटा ( तालिका 4 ) तक पहुँच गया है.
    4. २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में trophoblast बैंड हस्तांतरण और गर्म पूरा मीडिया के साथ भरें ।
    5. धीरे ट्यूब पलटना 3-6 बार मिश्रण करने के लिए और केंद्रापसारक पर १,२५० x 15 मिनट के लिए जी 20 में & #176; C.
    6. supernatant निकालें और गर्म पूरा मीडिया के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली reसस्पेंड । सेल निलंबन का मिश्रण है और एक hemocytometer और Trypan नीले (या पसंदीदा सेल गिनती विधि) का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती.
  5. मतगणना कक्ष एक Hemocytometer
    1. के साथ एक pipetting सीरम के साथ ऊपर और नीचे प्लास्टिक द्वारा सेल निलंबन मिश्रण या धीरे ट्यूब कई बार पलटने से.
    2. सेल सस्पेंशन और Trypan ब्लू के बराबर भागों गठबंधन (यानी 20 & #181; एल प्रत्येक) एक अलग ट्यूब में और धीरे मिश्रण.
      3. कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए
    3. मशीन ।
    4. लिएर तिरस्कृत 15-20 & #181; सेल के एल-Trypan coverslip और hemocytometer के बीच में नीले मिश्रण और कोशिकाओं केशिका कार्रवाई से ग्रिड भर में फैलाना करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    5. गणना व्यवहार्य कोशिकाओं (मृत कोशिकाओं गहरे नीले दाग हो जाएगा) चार 4 x 4 में से प्रत्येक में एक टैली काउंटर के साथ चक्र । कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए गिनती की एक प्रणाली को रोजगार एक बार से अधिक गिना नहीं कर रहे हैं (यानी कि नीचे या बाईं सीमाओं को छूने कोशिकाओं गिनती नहीं है).
      नोट: प्रत्येक 4 x 4 चक्र के बीच ५०-१५० कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए । बहुत कम या बहुत अधिक कक्ष कक्ष संख्या का एक से अधिक या अनुमान लगाने के लिए लीड कर सकते हैं ।
    6. औसत कुल सेल 4 x 4 चक्रों में से प्रत्येक से गिना जाता है, द्वारा गुणा 10 4 , और फिर कमजोर पड़ने कारक द्वारा गुणा (सेल निलंबन Trypan नीले) प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए.
    7. कुल सेल की उपज की गणना करने के लिए सेल निलंबन की कुल मात्रा के द्वारा प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या गुणा ।
      नोट: लगभग १००,०००,००० कोशिकाओं villous ऊतक के 80-120 ग्राम के साथ शुरू अलगाव से उम्मीद कर रहे हैं.
  6. चढ़ाना कोशिकाओं
    1. प्लेट ३,०००,००० कोशिकाओं को अच्छी तरह से (३.३ x 10 5 कोशिकाओं प्रति cm 2 ) में एक 6 अच्छी तरह से थाली (प्रति अच्छी प्रकार से निलंबन के 2 मिलीलीटर) और धीरे से आगे और पीछे और पक्ष के पक्ष को समान रूप से कोशिकाओं को वितरित ।
      नोट: Trophoblasts ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेटें ठीक से पालन करने की आवश्यकता है । syncytialization को बढ़ावा देने के लिए कक्षों की एक monolayer आवश्यक है.
    2. लगभग 30 मिनट के लिए लामिना प्रवाह हुड में मढ़वाया कोशिकाओं को छोड़ कोशिकाओं को समान रूप से वितरित, बसने की अनुमति है, और मशीन में रखने से पहले कुओं के नीचे का पालन शुरू करते हैं ।
      3. ७२ ज (दैनिक मीडिया में परिवर्तन के साथ) के लिए
    3. संस्कृति कोशिकाओं में एक ३७ & #176; सी मशीन के साथ 5% सह 2 और ९५% आर्द्रता.
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत trophoblasts की जांच 10-20x संस्कृति के हर 24 ज । Trophoblasts मत पैदा और गद्यांश नहीं किया जा सकता । के पाठ्यक्रम पर ७२ ज ऑफ कल्चर, गोल किसा trophoblasts फ्यूज बनाने के लिए एक syncytium (< मजबूत वर्ग = "xfig" > फिगर 3 ए और बी ).
  7. ठंड कोशिकाओं
    1. गोली अप्रयुक्त कोशिकाओं के द्वारा १,२५० x g पर 10 मिनट के लिए 20 & #176; C.
    2. महाप्राण गोली से संभव के रूप में ज्यादा मीडिया के रूप में.
    3. ठंड मीडिया में गोली reसस्पेंड ( तालिका 3 ).
    4. फ्रीज aliquots पर-८० & #176; C एक फ्रीजिंग कंटेनर में १००% isopropanol से भरा । जमे हुए aliquots को लिक्विड एन 2 के लिए अगले दिन लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए ट्रांसफर करें ।
      नोट: कक्षों को जमने के बाद कल्चरित किया जा सकता है.
  8. गल कोशिकाओं
    1. एक ३७ में जमे हुए कोशिकाओं और गल की एक aliquot निकालें & #176; ग जल स्नान करते समय घूमता रहे. पानी के नहाने से aliquot को निकाल दें बस इससे पहले कि यह पूरी तरह से एक तरल करने के लिए गल गया है ।
    2. तुरंत गल चुके कोशिकाओं को 15 एमएल वाले शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर कर दें । पहले धीमी गति से शुरू, आंतरायिक मिश्रण के साथ पूरा मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. पलटना ट्यूब कई बार मिश्रण करने के लिए.
    4. केंद्रापसारक पर २०० x g के लिए 10 मिनट में 20 & #176; ग.
    5. महाप्राण supernatant और गर्म पूरा मीडिया के 2-5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    6. पहले वर्णित के रूप में कोशिकाओं और प्लेट गिनती ।
< p class = "jove_title" > 3. TNF & #945 के साथ प्राथमिक Trophoblasts का उपचार;, सेल Lysates का संग्रह, और पश्चिमी सोख्ता

  1. वडा
    1. वार्म पूरा मिडिया को ३७ & #176; ग.
    2. Make a 10 & #181; जी/एमएल स्टॉक ऑफ TNF & #945; में पूरा मीडिया और स्टोर पर-20 & #176; C जब तक उपयोग के लिए तैयार है.
    3. कर 1 & #181; छ/मब काम के शेयर TNF & #945; जब कोशिकाओं के इलाज के लिए तैयार पूरा मीडिया में । धारावाहिक पतला TNF & #945; वर्किंग स्टॉक को 10 4 pg/एमएल, 10 3 pg/एमएल, ५०० pg/एमएल, २५० pg/एमएल, और १२५ स्नातकोत्तर/
      NOTE: The TNF & #945; एकाग्रता 10 4 pg/एमएल मामूली साइटोटोक्सिक है । TNF & #945 का समायोजन; सांद्रता का परीक्षण वांछित बहाव अनुप्रयोगों के विशेष पर निर्भर करेगा ।
  2. TNF & #945 के साथ कोशिकाओं का इलाज; संस्कृति के 24 ज के बाद
    1. , कोशिकाओं से कल्चर मीडिया को महाप्राण है और TNF & #945 की 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित; 6-well प्लेट्स पर अच्छी तरह से पूरक मीडिया (उपचार और वाहन के अनुसार कम से कम दो कुओं नियंत्रण).
    2. के बाद 24 ज के TNF & #945;-एक्सपोजर (४८ संस्कृति के ज), TNF & #945 की जगह; पूरक मीडिया पूरा मीडिया के साथ.
  3. कटाई कोशिकाओं और कुल प्रोटीन
    1. के बाद संस्कृति के ७२ ज (24 ज अतीत को हटाने के TNF & #945;), महाप्राण मीडिया, धीरे कमरे के तापमान के साथ कोशिकाओं को कुल्ला पंजाब, और जोड़ ८० & #181, बर्फ शीत Radioimmunoprecipitation परख के एल बफर (RIPA) युक्त नए सिरे से जोड़ा चिढ़ाने और फॉस्फेट अवरोधकों ( तालिका 3 ) सीधे प्रत्येक अच्छी तरह से ।
    2. एक सेल खुरचनी के साथ प्लेट से कोशिकाओं को हटा दें । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण, उपचार समूहों के भीतर कुओं पूलिंग ।
    3. लाइसे के लिए उच्च पर ट्यूबों भंवर द्वारा कोशिकाओं को 15 एस के कम से तीन अंतराल के लिए
    4. पर कोशिकाओं की मशीन 4 & #176; सी के लिए कमाल के साथ 15 min.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, के बाद कदम 3.3.3., कोशिकाओं बर्फ पर ट्यूब, भंवर, या ऊपर pipetting और क्या झाड़ द्वारा आंतरायिक आंदोलन के साथ 15 मिनट के लिए किया जा सकता हैwn
    5. दोहराएँ चरण 3.3.3.
    6. 5 मिनट के लिए 4 में १०,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक & #176; सी को गोली सेलुलर मलबे.
    7. supernatant (सेलुलर प्रोटीन युक्त) को एक नया १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब और स्टोर पर-८० & #176; C.
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और बाद में फिर से शुरू किया । कई फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए सेलुलर प्रोटीन के नमूनों के अनेक aliquots बनाने की सलाह दी जाती है ।
    8. एक पसंदीदा विधि द्वारा कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, जैसे एक bicinchoninic एसिड परख (बीसीए, आवश्यक आपूर्ति की तालिका देखें, रिएजेंट, और उपकरण, अनुपूरक सामग्री).
  4. एसडीएस-पेज और वेस्टर्न सोख्ता के लिए फ़ैसला या प् याज का प्रोटीन
    नोट: का पालन करें पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश एक पसंदीदा प्रयोगशाला प्रणाली का उपयोग कर.
    1. लोड के बीच 20-40 & #181; कुल प्रोटीन का g नमूना बफर ( Table 3 ) प्रति कुआं पर एक 12% acrylamide जेल । एसडीएस द्वारा अलग प्रोटीन-पृष्ठ चल बफर में ( तालिका 3 ).
    2. भीगी-प्रोटीन्स को जेल से एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली के अनुसार ट्रांसफर करें निर्माता & #39; एस ट्रांसफर बफर में निर्देश ( Table 3 ).
    3. Tris में 5% मिल्क पाउडर में झिल्ली की मशीन-०.१% के बीच 20 (TBST, टेबल 3 ) के साथ खारा बफर के साथ कमरे के तापमान पर 1 ज.
    4. एक फ़ैसला प्राथमिक एंटीबॉडी में झिल्ली गर्मी (आवश्यक आपूर्ति की तालिका देखें, रिएजेंट, और उपकरण, अनुपूरक सामग्री) में 1:500 पर 1% दूध पाउडर में रात भर TBST में 4 & #176; सी के साथ कमाल.
    5. धीरे TBST में झिल्ली 3 x 5 मिनट धोने और टीबीएस में 1 x 5 मिनट के साथ कमरे के तापमान पर कमाल का ।
    6. 1:2000-1:5000 माध्यमिक एंटीबॉडी में झिल्ली गर्मी (एचआरपी-लिंक्ड या पसंदीदा दिखाई संयुग्म, आवश्यक आपूर्ति की तालिका देखें, रिएजेंट, और उपकरण, अनुपूरक सामग्री) में 5% दूध पाउडर के लिए TBST में कमरे के तापमान पर कम से 1 ज के साथ कमाल.
    7. चरण 3.4.5 में उल्लिखित वाशिंग प्रक्रिया को दोहराने और एक इमेजिंग प्रणाली पर एक उपयुक्त दृश्य (यानी chemiluminescent) सब्सट्रेट के साथ दाग कल्पना.
    8. चरण 3.4.5 में उल्लिखित वाशिंग प्रक्रिया को दोहराएँ और & #946 के लिए झिल्ली की जांच;-actin या एक पसंदीदा लोडिंग नियंत्रण के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश.
      9. पसंदीदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर
    9. , (बैंड तीव्रता) अवशोषक के मैनुअल ठहराव द्वारा फ़ैसला की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, पृष्ठभूमि अवशोषण के घटाव, और इसी लोडिंग नियंत्रण बैंड तीव्रता के लिए सामांयीकरण । सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त के रूप में प्रोटीन के स्तर में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिवर्तन के लिए परीक्षण करने के लिए ।

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Representative Results

दुबला से शब्द मानव अपरा (पूर्व गर्भावस्था बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) & #60; 25) सीधी गर्भधारण महिला वंश ले जाने के साथ माताओं और एकत्र किया गया सीजेरियन सेक्शन (कोई श्रम) द्वारा प्रसव के 15 मिनट के भीतर नमूना । अपरा calcifications और ठेठ विकास के अभाव के लिए जांच की गई: नाल नाल और झिल्ली हटा दिया, आकार में गोल के साथ 300-600 जी के बीच वजन, 15-25 सेमी के बीच में व्यास, और गर्भनाल के बीच में डाला अपरा. Villous ऊतक 2-3 के नमूने में बेसल और chorionic प्लेटों से दूर अपरा (चित्रा 1) भर में, प्राथमिक trophoblast अलगाव के लिए शुरू सामग्री के रूप में Villous ऊतक के लगभग १०० जी उपज था । नमूने villous ऊतक के 20 मिनट के भीतर, प्राथमिक trophoblasts को अलग करने की प्रक्रिया के रूप में यहां वर्णित शुरू किया गया था, ०.८-1 x 10 के बीच उपज8 व्यवहार्य कोशिकाओं । कोशिकाओं 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में 3 x 106 के घनत्व पर वरीयता प्राप्त (३.३ एक्स 105 कोशिकाओं के प्रति सेमी2) थे । संस्कृति के 24 ज के बाद, कोशिकाओं लगाव और उचित trophoblast आकृति विज्ञान के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जांच की गई (व्यक्तिगत दौर कोशिकाओं) की पुष्टि की गई । संस्कृति मीडिया पूरी तरह से 125-104 स्नातकोत्तर के बीच TNFα की सांद्रता की एक श्रृंखला युक्त मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया गया था कि कम से कम दो कुओं एकाग्रता और वाहन नियंत्रण के प्रति शामिल थे (केवल मीडिया पूरा) ।

चौबीस घंटे के बाद TNFα-उपचार (संस्कृति के ४८ ज), सभी TNFα मीडिया पूरी तरह से मीडिया के साथ बदल रहे थे । 103 स्नातकोत्तर/एमएल में या नीचे सांद्रता पर TNFα के साथ उपचार के कारण कोई प्रशंसनीय सेल मृत्यु नहीं मनाया गया । 104 स्नातकोत्तर/एमएल TNFα के साथ उपचार मामूली साइटोटोक्सिक था और इस TNFα एकाग्रता के साइटोटोक्सिक प्रभाव के बाद मीडिया स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) परख (डेटा नहीं दिखाया) द्वारा सबूत के रूप में बदल गया था कायम नहीं किया । संस्कृति के ७२ ज में, कोशिकाओं syncytialization के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जांच की गई । syncytialization और fibroblast संदूषण के लिए Immunocytochemistry ने trophoblasts (चित्र 3) के अपेक्षाकृत शुद्ध अलगाव का पता चला । सेलुलर lysates यहां वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार काटा गया था, 3-8 µ g/तैयारी के अनुसार कुल प्रोटीन के µ एल के बीच उपज के रूप में एक बीसीए परख द्वारा निर्धारित (डेटा नहीं दिखाया गया है) । महिला trophoblasts से सेल lysates में पश्चिमी दाग विश्लेषण TNFα के साथ इलाज किया TNFα की सांद्रता के जवाब में फ़ैसला अभिव्यक्ति के एक ऊपर के ऊपर २५० स्नातकोत्तर/एमएल और downregulation सांद्रता पर फ़ैसला अभिव्यक्ति के बाद TNFα अधिक से अधिक दिखाया २५० स्नातकोत्तर/एमएल (चित्रा 4a और बी, 104 स्नातकोत्तर/साइटोटोक्सिक प्रभाव के आधार पर विश्लेषण से बाहर रखा/ इसी तरह, फ़ैसला गौरतलब है कि फ्लैश में विनियमित-जमे हुए villous ऊतक बायोप्सी के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से अधिक महिला भ्रूण के साथ दुबला नियंत्रण की तुलना में पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा सबूत (चित्र 4c और D, n = 6 प्रति बीएमआई कक्षा, ANOVA, P & #60; ०.०५) अपरा ।

एकाग्रता (%) ९०% डीजीएम (एमएल) 1x HBSS (एमएल) परत मोटाई (एमएल)
4x ग्रैडिएंट 4x ग्रैडिएंट कुल ३४.५ एमएल
७० 14 4 ४.५
६० 8 4 3
५५ ७.३३ ४.६७ 3
५० ३.३४ २.६७ 3
४५ 6 6 3 (१३.५ एमएल मार्क)
४० ५.३३ ६.६७ 3
३५ ४.६७ ७.३३ 3 (१९.५ एमएल मार्क)
30 8 16 6
20 २.६७ ९.३३ 3
10 १.३३ १०.६७ 3

तालिका 1. प्राथमिक Trophoblasts के घनत्व केंद्रापसारक के लिए घनत्व ढाल बनाने के लिए निर्दिष्टीकरण ।
बाएं से दाएं, स्तंभ एक घनत्व ढाल मीडिया को निर्दिष्ट करता है (डीजीएम, आवश्यक आपूर्ति की मेज देख, रिएजेंट, और उपकरण, अनुपूरक सामग्री) एकाग्रता HBSS में डीजीएम के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की । स्तंभ दो डीजीएम की मात्रा निर्दिष्ट करता है जबकि कॉलम तीन डीजीएम समाधान के उचित प्रतिशत बनाने के लिए आवश्यक HBSS की मात्रा को निर्दिष्ट करता है. स्तंभ चार ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए खंड को निर्दिष्ट करता है ढाल बनाने के लिए, सबसे घने परत के साथ शुरुआत ।

Trypsin HBSS DNase
पाचन (कुल गतिविधि; BAEE इकाइयां) वॉल्यूम (ml) (कुल गतिविधि; Kunits) कुल मात्रा
/digestion
1 ६१९०३७ (२३.०१ एमएल) १४१.७६ एमएल ६२५९४ (०.२३० एमएल) १६५ एमएल
2 ४१२६९१ (१५.३४ एमएल) ९४.५१ एमएल ४१७२९ (०.१५४ एमएल) ११० एमएल
3 ३१३२७० (११.६५ एमएल) ७१.७४ एमएल ३१६७६ (०.११६ एमएल) ८३.५ एमएल
कुल १३४५००० (५० एमएल) ३०८ एमएल १३६००० (०.५ एमएल) ३५८.५ एमएल

तालिका 2. DNase और Trypsin की विशिष्ट गतिविधि के आधार पर प्राथमिक Trophoblast अलगाव के लिए पाचन समाधान की तैयारी के लिए विनिर्देशों ।
बाएं से दाएं, पहला स्तंभ डाइजेस्टओं की संख्या निर्दिष्ट करता है, दूसरा स्तंभ पाचन के प्रति आवश्यक trypsin गतिविधि निर्दिष्ट करता है, तीसरा स्तंभ उपयुक्त पाचन के लिए जोड़े जाने के लिए अनुपूरक HBSS की कुल मात्रा को निर्दिष्ट करता है, चौथा कॉलम पाचन प्रति आवश्यक DNase गतिविधि निर्दिष्ट करता है, और अंतिम स्तंभ के पाचन की मात्रा को निर्दिष्ट करता है समाधानउपयुक्त पाचन के लिए अपरा ऊतक के लिए जोड़ा गया ।

HBSS (Ca के साथ पूरक+ 2 और मिलीग्राम+ 2) नमूना बफ़र
10% 10x HBSS ९०% 4x Laemmli डाई
१.२६ मिमी CaCl2 (anhyd.) 10% 2-Mercaptoethanol
०.८० मिमी MgSO4 (anhyd.)
२०.७७ मिमी HEPES
10N NaOH के साथ ७.४ को पीएच
1 करने के लिए मात्रा बनाओ बाँझ ddH2O के साथ L
एक बाँझ बोतल में बाँझ फिल्टर
पूरा मीडिया बफ़र चल रहा है
11% v/v IMDM निकालें 25 एमएम Tris आधार
10% v/v FBS जोड़ें १९० मिमी Glycine
1% १०,००० u/ml पेनिसिलिन/Streptomycin (१०० u/ml अंतिम) जोड़ें ०.१% एसडीएस
८.३ को पीएच
ठंड मीडिया
९०% v/v FBS स्थानांतरण बफ़र
10% v/v DMSO 25 एमएम Tris
१९० मिमी Glycine
पाचन बफर 20% मेथनॉल
५० एमएल Trypsin (२६,९०० BAEE यूनिट्स/ ८.३ को पीएच
०.५ एमएल DNAse (२७२,००० K इकाइयों/
पूरक HBSS में ३५८.५ मिलीलीटर लाने के लिए टीबीएस
20 एमएम Tris
RIPA बफर १५० मिमी NaCl
25 एमएम Tris-एचसीएल ७.६ को पीएच
5 मिमी EDTA
१५० मिमी NaCl TBST
०.१% एसडीएस टीबीएस के साथ ०.१% के बीच 20
०.५% सोडियम deoxycholate
1% ट्राइटन एक्स-१००
फॉस्फेट के प्रति 10 मिलीलीटर RIPA बफर के 1 गोली/

तालिका 3. पश्चिमी सोख्ता के बाद प्राथमिक Trophoblasts के अलगाव और संस्कृति के लिए आवश्यक समाधान ।

% डीजीएम एमएल मार्क कक्ष प्रकार
10 31.5-34.5 मलबे
20 28.5-31.5
30 22.5-28.5
३५ 19.5-22.5 Trophoblasts
४० 16.5-19.5
४५ 13.5-16.5
५० 10.5-13.5 लिम्फोसाइटों
५५ 7.5-10.5
६० 4.5-7.5 लाल रक्त कोशिकाओं
७० ४.५ के नीचे

तालिका 4. घनत्व केंद्रापसारक द्वारा Trophoblasts के अवसादन ।
बाएं से दाएं, पहला स्तंभ, डीजीएम (तालिका 1) का प्रतिशत निर्दिष्ट करता है, दूसरा स्तंभ उस एमएल चिह्न को निर्दिष्ट करता है जहां डीजीएम का प्रतिशत ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर पाया जाता है, और तीसरा स्तंभ निर्दिष्ट करता है कि किस कक्ष में किस प्रकार पर तलछट ५० एमएल शंकु ट्यूब पर डीजीएम और एमएल मार्क के इसी प्रतिशत । ५०-३५% डीजीएम के बीच Trophoblasts तलछट, अलग अपारदर्शी बैंड बनाने । इस रेंज के ऊपर या नीचे डीजीएम इकट्ठा सेलुलर मलबे और ऐसे लिम्फोसाइटों के रूप में अन्य कोशिका प्रकार के संदूषण में परिणाम होगा.

Figure 1
चित्र 1. Villous ऊतक शब्द मानव अपरा से Chorionic और बेसल प्लेटों को हटा कर अलग किया जाता है ।
chorionic प्लेट (भ्रूण पक्ष) ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ एक) , एक पूर्ण मोटाई नमूना अपरा से एक्साइज है । ख) villous ऊतक का एक नमूना chorionic और बेसल प्लेटों को हटाकर प्राप्त किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. एक Multilayered सेल गोली में नवजात बछड़ा सीरम परिणाम पर पाचन समाधान में कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
a) नवजात बछड़ा सीरम (एनसीएस) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डाइजेस्ट समाधान में सेल निलंबन के नीचे स्तरित है । (क) एक multilayered सेल गोली में परिणाम () के ख) केंद्रापसारक । नीचे सबसे परत लाल रंग में गहरी है और लाल रक्त कोशिकाओं के होते हैं । ऊपर की परत में trophoblasts शामिल है और सफेद या रंग में निखार है । ऊपर trophoblast परत एनसीएस द्वारा पीछा किया जाता है पाचन समाधान (supernatant) ट्यूब के शीर्ष करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. प्राथमिक मानव Trophoblast संस्कृतियों में Syncytialization और Fibroblast सामग्री का Immunocytological विश्लेषण ।
संस्कृति के 24 ज के बाद cytotrophoblasts में Cytokeratin-7 (लाल) की एक) प्रतिनिधि छवि । ख) Cytokeratin की प्रतिनिधि छवि-7 (syncytiotrophoblasts में लाल) के बाद संस्कृति के ७२ ज कोशिकाओं है कि जुड़े हुए है की multinucleated जनता से पता चलता है । ( ग) संस्कृति के ७२ ज के बाद syncytiotrophoblasts में Vimentin (लाल) की प्रतिनिधि छवि । छवियों DAPI (नीला) परमाणु counterstain के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर प्राप्त कर रहे थे । 10x आवर्धन पर visualized । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4 चित्र 4. TNFα के जवाब में फ़ैसला अभिव्यक्ति का विनियमन-महिला Trophoblasts में उपचार और दुबला बनाम मादा भ्रूण के साथ मोटापे से ग्रस्त से Villous ऊतक में अंतर्जात फ़ैसला अभिव्यक्ति ।
एक महिला भ्रूण ले जाने के साथ स्वस्थ गर्भधारण के साथ दुबला माताओं से शब्द अपरा से प्राथमिक trophoblasts अलग और १२५, २५०, ५००, 103, और 104 स्नातकोत्तर/एमएल TNFα (या वाहन नियंत्रण) के साथ इलाज किया गया । A) महिला trophoblast में फ़ैसला के लिए प्रतिनिधि पश्चिमी दाग TNFα के साथ इलाज किया lysates । β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । ख) TNFα-महिला trophoblasts में उपचार के जवाब में फ़ैसला अभिव्यक्ति पश्चिमी दाग से मात्रा और β-actin को सामान्यीकृत किया गया । मान TNFα एकाग्रता ± एसई n = 3 अपरा में प्रति फ़ैसला अभिव्यक्ति मतलब कर रहे हैं । ग) पूरे ऊतक lysates में फ़ैसला के लिए पश्चिमी दाग महिला भ्रूण (F1-F12) के साथ दुबला बनाम मोटे गर्भधारण से villous ऊतक के फ्लैश जमे हुए बायोप्सी से । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज एक (LDHA) एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । घ) (ग) से पश्चिमी दाग में फ़ैसला अभिव्यक्ति मात्रा और LDHA को सामान्यीकृत किया गया । मान रहे है मतलब फ़ैसला अभिव्यक्ति प्रति बीएमआई वर्गीकरण ± एसई में n = 6 प्रति बीएमआई वर्ग (ANOVA, * P & #60; ०.०५) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अपरा, भ्रूण के विकास को विनियमित करने के लिए जिंमेदार है, मोटापे से ग्रस्त पर्यावरण6में समारोह समझौता प्रदर्शन । trophoblasts के उच्च चयापचय की मांग के बावजूद, मातृ मोटापा प्रदर्शन बेकार mitochondrial श्वसन6,19के साथ अपरा । अपरा चयापचय में परिवर्तन जटिलताओं और प्रतिकूल भ्रूण मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण3,6,7में मनाया परिणामों की वृद्धि हुई घटनाओं के लिए योगदान कर सकते हैं । Autophagy मातृ-मोटापा के साथ अपरा में भी समझौता किया जाता है । पुरुष भ्रूण के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से अपरा autophagosomes13के संचय के द्वारा सबूत के रूप में बेकार autophagic फ्लक्स दिखाते हैं । इष्टतम autophagic प्रवाह को बनाए रखना सेलुलर homeostasis और मातृ मोटापा के साथ अपरा में दोषपूर्ण autophagy के लिए महत्वपूर्ण है प्रतिकूल मोटापे से संबंधित परिणामों मध्यस्थता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।

समझौता अपरा मातृ मोटापा में प्रदर्शित समारोह के सटीक कारण (ओं) अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे है और भड़काऊ संकेत में अपने मूल हो सकता है । दोनों मोटापा और गर्भावस्था भड़काऊ राज्यों है कि परिसंचारी TNFα1,4,20,21के ऊपर के स्तर की विशेषता है । TNFα autophagy22,23के एक उत्प्रेरक है और मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से अपरा में autophagic प्रवाह में परिवर्तन मध्यस्थता कर सकते हैं । TNFα सामांयतः कोशिकाओं पर सूजन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से2कैंसर के संदर्भ में । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल, संस्कृति में exogenous TNFα के साथ प्राथमिक trophoblasts के उपचार द्वारा अपरा की कार्यात्मक क्षमता पर मोटापे से संबंधित सूजन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण को अनुकूलित करती है ।

इस प्रोटोकॉल चार मुख्य घटक होते हैं: अपरा से villous ऊतक के नमूने, villous ऊतक से प्राथमिक trophoblasts के अलगाव, प्राथमिक trophoblasts की संस्कृति TNFα उपचार के बाद, और कुल सेलुलर lysates के बाद का संग्रह पश्चिमी दाग विश्लेषण ब्याज की एक प्रोटीन (ओं) की अभिव्यक्ति को मापने के लिए । शुद्ध trophoblasts को अलग करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि नाल (चित्रा 1b) के नमूने के दौरान villous ऊतक से chorionic और बेसल प्लेटों को अच्छी तरह से दूर कर रहे हैं । यह भी जरूरी है कि villous ऊतक एक समय पर ढंग से संसाधित है (यानी प्रसव के 30 मिनट के भीतर) । इस प्रोटोकॉल विवरण तीन पाचन कदम, प्रत्येक स्थाई ३५ मिनट के उपयोग के लिए, villous ऊतक के अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स से trophoblasts जारी है । Lengthier पाचक कोशिका सतह प्रोटीन के trypsinization द्वारा हानिकारक कोशिकाओं जोखिम । डाइजेस्टर की संख्या बढ़ाने से व्यवहार्य trophoblasts की अंतिम उपज में वृद्धि नहीं appreciably । हालांकि, समय और पचाने की संख्या कम होने की कोशिका पैदावार में परिणाम होगा (शमौन, Bucher, और Maloyan, अप्रकाशित डेटा) । इस प्रोटोकॉल मज़बूती से लगभग १००,०००,००० कोशिकाओं का उत्पादन ८०-villous ऊतक के १२० ग्राम.

वहां भेद trophoblast बैंड की संख्या में परिवर्तनशीलता अलगाव के बीच घनत्व ढाल पर मनाया जाता है । अंय कोशिका प्रकार से संक्रमण से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सख्ती से बैंड (ओं) घनत्व ढाल (तालिका 4) पर trophoblasts युक्त इकट्ठा । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल पहले से स्थापित तरीकों से अनुकूलित है कि अंय कोशिका प्रकार से कम 5% संदूषण के साथ अपेक्षाकृत शुद्ध trophoblasts की उपज10,11,12। आगे की शुद्धि के लिए सकारात्मक या नकारात्मक चयन से प्राप्त किया जा सकता है24. हालांकि, यह दृष्टिकोण व्यवहार्य trophoblasts की उपज को कम करने के जोखिम को चलाता है । Cytokeratin के Immunocytochemical विश्लेषण-7 प्राथमिक trophoblasts पृथक में यहां प्रस्तुत की प्रक्रिया का उपयोग 24 बनाम संस्कृति समय के ७२ ज की पुष्टि की है कि कोशिकाओं के रूप में syncytialization से गुजरा multinucleated सेल जनता की उपस्थिति का सबूत ७२ एच में, एक trophoblast की उंर में एक बानगी घटना (चित्र 3 ए और बी) । इसके अलावा, प्राथमिक trophoblasts में Vimentin के immunocytochemical विश्लेषण ७२ h के लिए कल्चरित बहुत कुछ दूषित fibroblasts (चित्र 3 c) का पता चला । नियमित प्रयोजनों के लिए, trophoblasts की पवित्रता सरल रूपात्मक मूल्यांकन द्वारा संस्कृति में निगरानी की जा सकती है । संस्कृति समय के 24 ज, दौर व्यक्तिगत cytotrophoblasts संस्कृति पर हावी है । Cytotrophoblasts संस्कृति के ७२ एच के बाद syncytialization से गुजरना, जुड़े कोशिकाओं के झुरमुट में जिसके परिणामस्वरूप । इस संस्कृति में पाया जाने वाला सबसे सामान्य प्रदूषित कोशिका प्रकार fibroblast या endothelial कोशिका है, जो क्रमशः आकार में लम्बी और बहुभुजीय होती है. इन सुविधाओं मोटे तौर पर एक चमकदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निगरानी की जा सकती.

TNFα के साथ प्राथमिक trophoblasts का इलाज एक नियंत्रित प्रणाली है कि एक trophoblasts में महत्वपूर्ण रास्ते के विनियमन पर संकेत TNFα के प्रभाव को मापने के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है । स्वाभाविक रूप से, वहां vivo में मोटापे से ग्रस्त मातृ वातावरण में TNFα के अलावा अंय कारक है कि trophoblast समारोह संग्राहक के लिए जिंमेदार हो सकता है । ये शामिल हैं, लेकिन हार्मोनल संकेतों, hyperlipidemia, और अन्य भड़काऊ कारकों में से एक मेजबान के लिए सीमित नहीं हैं25. विभिंन उपचार के संयोजन और अधिक शारीरिक रूप से सही तरीके से मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी पर्यावरण पूर्व vivo दोहराऊंगा जाएगा । exogenous TNFα की सांद्रता के लिए इस प्रोटोकॉल में trophoblasts के इलाज के लिए अब तक आम तौर पर vivo मेंघूम उन से अधिक थे । सीरम सांद्रता 20 एनजी/एमएल या कुछ भड़काऊ शर्तों में उच्च तक पहुंचने के लिए सूचित किया गया है26। वर्तमान प्रयोगशाला विधियों (यानी पश्चिमी सोख्ता) द्वारा एक औसत दर्जे का जवाब प्राप्त करने के लिए, यह जीन अभिव्यक्ति और ब्याज के रास्ते में परिवर्तन प्रकट करने के लिए TNFα सांद्रता बढ़ाना आवश्यक है. ये प्रतिक्रियाएं vivo में एक हद तक मौजूद हो सकती हैं । हालांकि, वे फिर भी काफी trophoblasts के समारोह प्रभाव सकता है । TNFα के उच्च सांद्रता के लिए trophoblasts उजागर जीन अभिव्यक्ति और मार्ग विश्लेषण में कलाकृतियों के उत्पादन का खतरा है कि साइटोटोक्सिक प्रभाव में निहित हो सकता है चलाता है । उदारवादी cytotoxicity trophoblasts में मनाया गया था 104 स्नातकोत्तर/एमएल TNFα 24 के लिए पूरक मीडिया LDH cytotoxicity परख द्वारा सबूत के रूप में (डेटा दिखाया नहीं) । हालांकि, पर या 10 से नीचे सांद्रता3 स्नातकोत्तर/एमएल TNFα किसी भी प्रशंसनीय सेल मौत का उत्पादन नहीं किया ।

छोटे अंतराल पर TNFα सांद्रता का परीक्षण और/या कि यहां वर्णित से कम कर रहे है सबसे अच्छा मात्रा द्वारा पीछा किया जा सकता हैपोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए (qPCR), एक अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुकूल तकनीक । जबकि qPCR विशेष रूप से transcriptional स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के स्तर के लिए परीक्षण, पश्चिमी सोख्ता प्रोटीन उत्पादों है कि संभवतः अपने सेलुलर कार्य (ओं) प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध है के अंतिम स्तर का पता लगाता है । संयोजन के रूप में दोनों विश्लेषणात्मक तकनीकों का प्रयोग जीन अभिव्यक्ति के स्तर के विनियमन पर TNFα उपचार के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से अगर अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन transcriptional का परिणाम है निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, पोस्ट-transcriptional, या पोस्ट-ट्रांसलेशनल रेगुलेशन । भड़काऊ तनाव trophoblast व्यवहार, आकृति विज्ञान, और syncytialization प्रभाव हो सकता है । आणविक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के अलावा रूपात्मक आकलन (यानी immunocytochemistry) सहित trophoblast स्वास्थ्य पर TNFα एक्सपोजर के प्रभाव का एक अधिक व्यापक विश्लेषण प्रदान करेगा । प्रयोगात्मक मांगों के अनुसार परीक्षण और बहाव परख TNFα सांद्रता का समायोजन उचित है ।

प्रोटोकॉल को लागू करने से यहां वर्णित है, TNFα-मध्यस्थता सूजन महिला भ्रूण के साथ दुबला गर्भधारण से मानव trophoblasts में फ़ैसला अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए पाया जाता है. trophoblast lysates में फ़ैसला के लिए पश्चिमी सोख्ता के पास और १४० केडीए (चित्र 4a) की उंमीद आणविक वजन के ऊपर दो अलग बैंड से पता चला । वहां सबूत है सुझाव है कि कम बैंड गैर विशिष्ट है (PD047 विरोधी फ़ैसला pAb, MBL डाटा शीट, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub) । महिलाओं की trophoblasts करने के लिए एकाग्रता के TNFα उपचार के जवाब में फ़ैसला की अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता का प्रदर्शन २५० स्नातकोत्तर/ इस से अधिक सांद्रता, फ़ैसला अभिव्यक्ति स्तर आधारभूत (अनुपचारित नियंत्रण) और यहां तक कि नीचे (चित्रा 4B, n = 3) की ओर वापस कमी आई । यह देखते हुए कि TNFα के साथ दुबला गर्भधारण से इलाज trophoblasts मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में सूजन simulates, इस परिणाम खोजने के पूरक है कि फ़ैसला काफी फ्लैश में विनियमित है-जमे हुए villous ऊतक बायोप्सी से दुबला नियंत्रण की तुलना में महिला भ्रूण के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से अपरा (चित्र 4c और डी, ANOVA, एन = 6 प्रति बीएमआई वर्ग, P & #60; ०.०५).

जबकि autophagic प्रवाह के लिए दुबला नियंत्रण की तुलना में महिला भ्रूण के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से trophoblasts में अलग प्रकट नहीं होता है, पुरुष भ्रूण के साथ मोटापे से ग्रस्त गर्भधारण से trophoblasts गठन और autophagosomes के संचय के सक्रियण का प्रदर्शन 13. फ़ैसला autophagy का एक नेगेटिव रेगुलेटर है, जहां यह autophagosome-lysosome फ्यूजन27को ठप करने का काम करता है । महिला trophoblasts एक क्षतिपूरक या TNFα के खिलाफ सुरक्षात्मक तंत्र-मध्यस्थता सूजन है, जो autophagy22सक्रिय कर सकते हैं, उंहें दुबला बनाए रखने के लिए की स्थापना में autophagic फ्लक्स की अनुमति के खिलाफ के रूप में फ़ैसला की अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते है मातृ मोटापा । अपरा में यह प्रतिक्रिया कैसे महिला भ्रूण मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी वातावरण में पुरुषों की तुलना में बेहतर किराया में एक भूमिका निभा सकता है । TNFα के साथ प्राथमिक मानव trophoblasts के इलाज के माध्यम से मातृ मोटापा पूर्व vivo के साथ जुड़े भड़काऊ वातावरण मॉडलिंग एक मंच में महत्वपूर्ण रास्ते के नियमन पर मोटापे से ग्रस्त अंतर्गर्भाशयी पर्यावरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है trophoblasts । मोटापे से ग्रस्त मातृ पर्यावरण recapitulating के उद्देश्य से नए और मिश्रित उपचार के साथ इस प्रोटोकॉल में संशोधन अपरा समारोह पर मातृ मोटापे के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक रोमांचक अवसर प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उन महिलाओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस अध्ययन के लिए अपनी अपराि दान की । हम भी OHSU में श्रम और प्रसव विभाग और अपरा के संग्रह के समंवय के लिए मातृ और भ्रूण अनुसंधान टीम धंयवाद । हम एरिक वैंग, पीएच. डी., और केली कुओ, समर्थन और प्रयोगात्मक तरीकों और अनुकूलन के साथ मदद के लिए प्रबंध निदेशक के आभारी हैं ।

यह काम NIH HD076259A (am) और अहा GRNT29960007 (am) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X HBSS Gibco 14185-052
CaCl2 (anhyd.) Sigma-Aldrich C1016-100G
MgSO4 (anhyd.) Sigma-Aldrich M7506-500G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
Trypsin Gibco 15090-046
DNAse Worthington Biochemical Corp. LS002139
Protease/Phosphatase inhibitors Thermofisher Scientific 88668
Tris HCl Invitrogen 15506-017
EDTA Invitrogen 15576-028
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
SDS Fisher Scientific BP166-600
Sodium deoxycholate. Fisher Scientific AAJ6228822
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) Gibco 12440-046
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Neonatal Calf Serum (NCS) Gibco 26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
10% Formalin Fisher Scientific 23-427-098
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
TNFα Sigma-Aldrich SRP3177-50UG
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 70013-032
K2EDTA vacutainer blood collection tubes BD 366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM) GE Healthcare 17-0891-01
6 well plates Corning 353046
Cell strainers Fisher Scientific 22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural Fisher Scientific 22363352
Trypan Blue Corning 25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad 1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad 1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber Bio-Rad 1654112
4X Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-100ML
Glycine Bio-Rad 1610718
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ML
Instant Nonfat Dry Milk Carnation
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb Cell Signalling Technology 8465S
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich A2228-100UL
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7074S
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34578

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References

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चिकित्सा अंक १२७ मानव अपरा मातृ मोटापा शोथ ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) villous ऊतक trophoblasts प्राथमिक कोशिका संस्कृति पश्चिमी दाग autophagy फ़ैसला यौन dimorphism
एक प्राथमिक मानव Trophoblast मॉडल अपरा में Autophagy के विनियमन पर मातृ मोटापा के साथ जुड़े सूजन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए
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Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A … More

Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta. J. Vis. Exp. (127), e56484, doi:10.3791/56484 (2017).

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