Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكول لعزل الماوس كله، سليمة الغدد الثديية للتحقيق في المصفوفة خارج الخلية (ECM) التعبير ومورفولوجيا الأقنية. الغدد البطن الماوس #4 استخرجت من الفئران موتهم الإناث 8-10 الأسبوع القديمة، ثابتة في الفورمالين مخزنة محايدة ومقطوع والملون باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري للبروتينات إدارة المحتوى في المؤسسة.
Abstract
وكان الهدف من هذا الإجراء لحصاد الغدد الثديية البطن #4 من الإناث من الفئران موتهم من أجل تقييم التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة، والهندسة المعمارية الأقنية. وهنا جيب صغير تحت الجلد تم إنشاؤه باستخدام مقص مايو كلينيك، السماح بفصل الغدد داخل الأنسجة تحت الجلد من الصفاق الكامنة. وساعد في التصور الغدد باستخدام 3.5 x-R الجراحية الصغرى الصفائحي. قذف كان مقلوب ويعلق مرة أخرى تحديد السماح لمنصات الدهون الثديية سليمة. وكان تشريح كل الغدد البطن #4 صراحة بانزلاق شفرة المبضع أفقياً بين طبقة تحت الجلد والغدد. فورا بعد الحصاد، ووضعت الغدد في 10% فورمالين مخزنة محايدة لمعالجة الأنسجة اللاحقة. استئصال غدة كامل مفيد لأنه يقضي على الدرجة الأولى خطر استبعاد هامة على مستوى الأنسجة التفاعلات بين الخلايا الظهارية الأقنية وغيرهم من السكان الخلوية ميكرونفيرونمينتال التي يمكن أن تضيع في خزعة جزئية. عيب واحد من المنهجية هو استخدام مقاطع المسلسل من الأنسجة الثابتة مما يحد من تحليلات للأقنية التعبير morphogenesis والبروتين إلى مواقع منفصلة داخل الغدة. على هذا النحو، تغييرات في التعبير الهندسة المعمارية والبروتين الأقنية في 3 الأبعاد (3D) لا يسهل الحصول عليها. عموما، الأسلوب المطبق للدراسات التي تتطلب الغدد الثديية موريني أسرة سليمة للتحقيقات المصب مثل سرطان الثدي أو morphogenesis الأقنية التنموية.
Introduction
سرطان الثدي يتسم بدرجة كبيرة من أنسجة التليف1،2،،من34. يشار إلى إدارة المحتوى في المؤسسة، هذا الكيان غير الخلوية توجد بدرجات متفاوتة في جميع الأنسجة وتتكون أساسا من ميشوورك معقدة من كولاجينس فيبريلار وغير فيبريلار، الايلاستين، وجليكوبروتينس بالإضافة إلى جزيئات مختلفة مما يشير إلى أن المحتبسة في هذه المصفوفة. تحت شروط التماثل الساكن، ترسب وتدهور لإدارة المحتوى في المؤسسة مراقبة شديدة. 5 خلال tumorigenesis الثدي، هو تعطل توازن الترسيب إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور. على هذا النحو، أبلغ عن أورام الثدي للتعبير عن البروتينات ECM وفيرة مثل collagens وفيبرونيكتين وتيناسسين-جيم بين أمور أخرى. 6 وقد تم توثيق التعبير غير طبيعي لهذه البروتينات بالإضافة إلى زيادة أنماط crosslinking مصفوفة لتعزيز الثدي ورم التقدم وورم خبيث والعلاج المقاومة1،3، 47،،،من89.
وأجرى تقييم مورفولوجيا الأقنية وتشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة، العزلة الغدد الثديية سليمة. هنا، استخدمنا الإناث الفئران موتهم قاصرة كافيولين 1، وبروتين غشائي لا يتجزأ الذي ارتبط عدوانية الثدي ورم توقيع10،،من1112، والتحكم B6 موتهم الإناث الفئران. تجهيز غذائها وتلطيخ هذه الأنسجة يسمح بتحديد عدة بروتينات ECM جنبا إلى جنب مع توصيف مورفولوجيا الأقنية.
وعموما، يعطي عزلة كاملة، سليمة من الغدد الثديية الباحثين الفرصة للتحقيق على مستوى الأنسجة المورفولوجية أو الخلوية التغيرات التي تحدث استجابة لعوامل خارجية أو داخلية. عيوب تقنية ترتبط بتحليلات لأقسام الأنسجة البعد (2D) 2 بدلاً من منظور ثلاثي الأبعاد، مما يفضي إلى صورة أكثر اكتمالا مورفولوجية معقدة من شجرة الأقنية. نظراً للطابع المعقد لخلية خلية والخلية-ECM التفاعلات التي تحدث في الغدة الثديية، عزل الغدد سليمة كاملة، ومفيدة لتحليل كفاءة الأقنية مورفولوجيا والبروتين التعبير في مختلف المناطق من الفاري الثديية غدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان في هذا البروتوكول تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لكلية فيلادلفيا للطب التقويمي وأجريت جميع التقنيات تحت صارمة مبادئ توجيهية أخلاقية.
1-نموذج الشراء والتجهيز
- حدد موضوع الحيوانات المناسبة والمكان إلى غرفة 2 CO. لهذه التجربة، استخدم الأسبوع 8-10 B6 موتهم الإناث القديمة. Cg-Cav1tmMIs/ي و C57BI/6J-
- بدوره على تدفق الغاز بنسبة 30-40%. بمجرد أن الحيوان ظاهر وعيه بعد حوالي 2 دقيقة، فتح صمام الغاز للضغط الكامل لأدنى 5 إضافية
ملاحظة: تأكيد وفاة الحيوان عن طريق مراقبة علامات مرئية للتنفس (مثل حركة الصدر) لمدة 10 دقائق بعد وقف تسليم 2 CO. إذا كان الحيوان لا يزال حيا، فإنه قد توضع مرة أخرى في الدائرة 2 CO. كما يمكن استخدام التفكك عنق الرحم على الرغم من أن ليس من المستحسن كما قد تراكم الدم حول الغدد الثديية التدخل مع تشريح والنتائج- - عقب التضحية، دبوس الذبيحة في موقف ضعيف وتشبع مع الإيثانول 70%-
- قرصه بلت فقط فوق العانة استخدام الملقط ونك مع مقص الجراحية الصغيرة. تناوب المقص، قص بلت على طول خط الوسط البطني تتحرك والذيلية للجمجمة.
- مع مقص أكبر أو هيموستات، صراحة تشريح اللفافة تحت الجلد على الصعيد الثنائي، استخدام الحذر لا إلى ثقب الصفاق. قص على امتداد الحواف الأفقية في كلا طرفي القاصي الشق. فتح اللوحات
- دبوس قذف والرش مرة أخرى مع الإيثانول 70%-
ملاحظة: على الرغم من أن يسمح باستخدام الإيثانول 70% التمييز المرئي أفضل بين الغدة والأنسجة تحت الجلد المحيطة، كن حذراً لتجنب تجفيف الأنسجة نتيجة لاستخدام هذا الحل. لتفادي التجفيف، إزالة الغدة في غضون فترة زمنية لا أن يتجاوز 4 دقيقة. كبديل إلى إيثانول 70%، قد المحقق أيضا استبدال مخزن مؤقت عزل عامة، مثل برنامج تلفزيوني 1 x، لتجنب جفاف الأنسجة. - تحديد أماكن الغدد الثديية من الفائدة، شريحة شفرة المبضع #4 على طول داخل اللوحات بلت، قطع الغدة الثديية والدهنية الجلدية المرتبطة بها خالية من الأدمة-
ملاحظة: 3.5 × الموازين الجراحية الصغرى قد تساعد في التصور أسهل في الغدد. - تغرق فورا غدة المعزولة حديثا في الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على حجم الحل 10:1-الأنسجة من 10% فورمالين مخزنة محايدة ل h. 24-48
ملاحظة: اعتماداً على الغرض دراسة، المصفف بديلة كثيرة يمكن استخدام مثل بارافورمالدهيد، الإيثانول للدراسات الجينية، والجيش الملكي النيبالي المتاحة تجارياً الحفاظ على المخازن المؤقتة. - اتباع بروتوكولات المؤسسية لتضمين البارافين وإرسال عينات إلى بائع للتجهيز، والتضمين، وتقطيع الشرائح المتصاعدة. قسم الأنسجة في 5 ميكرومتر.
ملاحظة: بسبب الغدة المحيطة الدهنية الزائدة، النظر في إزالة 100-200 ميكرون من الأنسجة قبل تمزيقها وتلطيخ.
2. الأنسجة ستينينج
- إيمونوهيستوتشيميستري
- مكان الشرائح تكون الملون على كتلة الحرارة المحددة في ˚C 58 ح 1 لإذابة البارافين.
تنبيه: انصهار شمع البارافين قد تشغيل إيقاف الشريحة. ترصد عن كثب أو وضع القضاء تحت الشريحة لالتقاط الشمع الجريان السطحي.
ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية وقد يتم تخطي. إذا كانت النتائج ليس كما كان متوقعا، مضيفاً هذا خطوة إلى الوراء قد يحسن النتائج.
جرة - إينكوباتي الشرائح في شريحة تحتوي على زيلين نفط 100% لضمان غمر كاملة و 30 دقيقة. كرر مرة واحدة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، التفتيش البصري ينبغي إجراء لضمان أن أقسام الأنسجة أحرار في الأنسجة الدهنية والكيروسين. إذا كانت الأنسجة الدهنية إضافية أو الشمع واضح، ينبغي إعادة غمر الشريحة في زيلين نفط. توخي الحذر لتقليل التعرض المضافة إلى زيلين نفط كهذا يمكن أن يسبب انكماش الأنسجة. - ترطيب الأنسجة في جرة شريحة التي تحتوي على الإيثانول 100% للحد الأدنى 10 كرر مرة واحدة.
- نقل الشرائح إلى جرة شريحة التي تحتوي على الإيثانول 95% للحد الأدنى 10 كرر مرة واحدة.
- نقل الشرائح شريحة جرة تحتوي على 75% إيثانول للحد الأدنى 5
- نقل الشرائح شريحة جرة تحتوي على 50 ٪ إيثانول للحد الأدنى 5
- غلى الحل سترات الصوديوم 10 ملم (pH 6.0) في لوحة الساخن أو فرن ميكروويف، وتصب في جرة كوبلين.
تنبيه: بعناية رصد الحل أثناء تدفئة والحرص على تجنب يغلي أكثر. سوف تكون حاوية حار جداً. استخدام الحماية لتجنب الحروق. - ببطء مكان الشرائح إلى كوبلين جرة، ضمان غمر كاملة، واحتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لاسترداد [ابيتوبس]. إزالة والجاف بعناية للشرائح.
- رسم حاجزاً حول الأنسجة مع علامة مسعور. إضافة مانع إنزيم الذاتية ما يكفي (بيروكسيد الهيدروجين وأزيد الصوديوم، متاح تجارياً) لتغطية الأنسجة واحتضانها للحد الأدنى 10
- الشرائح سوبميرجي في 1 x الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للحد الأدنى 10
- إضافة مصل كافية حمار 10% في 1 x برنامج تلفزيوني لتغطية الأنسجة واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في قاعة هوميديفيد-
ملاحظة: هذه التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً هنا عن طريق تخزين الشرائح في قاعة هوميديفيد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بينما وجد حمار المصل تسفر عن نتائج المصبوغة مثلى، قد يرغب المحقق اختبار الأمصال المختلفة مثل ألبومين المصل البقري (BSA) أو مصل الماعز أو مصل الحصان لتحديد النتائج المثلى. إذا كان استخدام جيش صرب البوسنة، المحقق ينبغي إعداد هذا الطازجة قبل الاستخدام. - صب مانع الزائدة من الشرائح وإضافة جسم الابتدائي المخفف بشكل صحيح في المصل 1% مباشرة إلى الشرائح ضمان أن الأنسجة مغطى بالتساوي في الحل. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في دائرة هوميديفيد.
ملاحظة: قد تابع هذه الخطوة للمدد الزمنية أطول مع الدائرة الرطبة المخزنة في 4 ° جيم تأكد من أن تضمين الشرائح سيطرته السلبية (مثل شريحة مع لا جسم الأولية، يعرف سالب مستضد الأنسجة، إلخ) في هذه الخطوة. - تغسل شرائح بتدفق حوالي 1 مل من diH 2 س على الأنسجة بعناية واحتضان في تغيير 1 في برنامج تلفزيوني x 1 للحد الأدنى 5
- صب برنامج تلفزيوني الزائدة وإضافة تسمية البيروكسيديز الفجل ما يكفي لتغطية الأنسجة واحتضان لمدة 30 دقيقة في قاعة هوميديفيد-
ملاحظة: لعل المحقق في هذه الخطوة، المضي قدما في فلوري التلوين باستخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق فلوريسسينتلي. إذا كان هذا هو المطلوب، يجب أن يتم تعديل وصف الخطوات التالية تبعاً لذلك. - تغسل شرائح بتدفق حوالي 1 مل من diH 2 س على الأنسجة بعناية واحتضان في تغيير 1 في برنامج تلفزيوني x 1 للحد الأدنى 5
- جعل ديامينوبينزيديني (DAB) بالإضافة إلى حل chromogen وفقا لنسبة اقترحت الشركة المصنعة، ومزيج من دوامة.
ملاحظة: العديد من مجموعات جاهزة متوفرة تجارياً وبصرف النظر عن تلك المستخدمة في هذا البروتوكول- - الزائدة صب المخزن المؤقت من الشرائح وإضافة 2-3 قطرات (10-50 ميليلتر) من وصمة chromogen مباشرة للأنسجة و احتضان لمدة 5 دقائق في غرفة رطبة. غسل الشرائح بتدفق حوالي 1 مل diH 2 س بعناية أكثر الأنسجة.
تنبيه: الدأب-تشروموجين شديدة السمية. تجنب الاتصال المباشر من وصمة عار مع تدفق الجلد وجمع قبالة في النفايات الخطرة-
- مكان الشرائح تكون الملون على كتلة الحرارة المحددة في ˚C 58 ح 1 لإذابة البارافين.
- الهيماتوكسيلين وويوزين (ح & ه)
- بعد الشطف النهائي بعد حضانة chromogen، غمر شرائح توضع هاريس لشرائح شطف دقيقة 2-2.5 بلطف تحت ماء الصنبور للحد الأدنى 1-2
ملاحظة: الحرص على تجنب jet المباشر من الماء على الأنسجة. - Submerge الشرائح ل s 2-3 في تمايز الحل (0.25 مل حمض الهيدروكلوريك في 100 مل إيثانول 70%). شطف الشرائح بلطف تحت ماء الصنبور لحوالي 1-2 دقيقة
- تغرق الشرائح في عامل الأزرق (4.5 ملغ كربونات الكالسيوم في 100 مل ماء الصنبور، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 9.4) لشرائح شطف س 60 في الإيثانول 95% ل 30 س.
- الشرائح سوبميرجي في الكحولية ويوزين Y للحد الأدنى 2-3
- يذوي الأنسجة في التغييرات 2 من الإيثانول 95% لكل 1 دقيقة.
- الأنسجة ديهيدراتي في 1 تغيير الإيثانول 100% للحد الأدنى 1
- الشرائح الجافة بعناية مع مسح خالية من الوبر. تطبيق قطره 1 (حوالي 100-200 ميليلتر) الاصطناعية، غير المائية، وتركيب وسائط الشرائح وتطبيق ساترة على أساس راتنج.
ملاحظة: إذا تم انتخاب طريقة المصبوغة مختلفة، قد تكون وسائل الإعلام المختلفة تصاعد المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كان اختيار المحقق جسم ثانوي مترافق فلوري، سيكون جبل مائي أكثر مثالية. - السماح للشرائح لتعيين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة-
- بعد الشطف النهائي بعد حضانة chromogen، غمر شرائح توضع هاريس لشرائح شطف دقيقة 2-2.5 بلطف تحت ماء الصنبور للحد الأدنى 1-2
- ستاينينج بيكروسيريوس الأحمر (PSR)
- حدد الشرائح تكون الملون واتباع بروتوكول إيمونوهيستوتشيميستري من خلال الخطوة 6 (النقع الإيثانول 50%).
- الشرائح سوبميرجي في PSR وصمة عار حاء – 1
- تغرق الشرائح في 0.5% حمض الخليك ل s 1-2، ومرتين للتفريق وصمة عار.
- يذوي الأنسجة في التغييرات 2 من الإيثانول 95% لكل 1 دقيقة.
- الأنسجة ديهيدراتي في 1 تغيير الإيثانول 100% للحد الأدنى 1
- مسح الشرائح بغمر بإيجاز في زيلين نفط 100% لحول 3-4 س.
- الشرائح الجافة بعناية مع مسح خالية من الوبر. تطبيق قطره 1 (حوالي 100-200 ميليلتر) الاصطناعية، غير المائية، وتركيب وسائط الشرائح وتطبيق ساترة على أساس راتنج.
3. نموذج تحليل
- تحليل الأقنية
- حدد الشرائح الملون ل α-SMA. استخدام مجهر خفيفة المزودة بكاميرا محمولة هدفا، وجمع الصور التمثيلية في 20 X التكبير- تميز
- استخدام إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة)، وعدد القنوات في كل صورة. يمكن تعداد هذه يدوياً أو أحد قد تعيين نقاط عددية للقنوات الفردية. لتعيين نقاط عددية وفتح إيماجيج وحدد الوظائف الإضافية. بعد ذلك حدد تحليل واختيار "العداد خلية" من القائمة المنسدلة. انقر فوق تهيئة، ثم تسليط الضوء على نوع 1 لبدء وضع العلامات القنوات. عند الانتهاء، قم بتحديد النتائج لعرض عدد الأقنية.
ملاحظة: العناية للتحقق من هياكل الأقنية والأوعية الدموية لا. - في ' "تعيين القياس" ' الخيارات، راجع ' محيط ' و ' منطقة "-
- باستخدام أداة المضلع مرفوعة، رسم خط حول كل مجرى الهواء في حجرة myoepithelial (الرؤية بمساعدة α-SMA وصمة عار). حدد ' التدبير ' وتسجيل المحيط والمساحة-
- مرة أخرى باستخدام أداة المضلع مرفوعة، رسم خط على طول الجانب قمي من ظهارة الأقنية داخل داخل التجويف. حدد ' التدبير ' وتسجيل المحيط والمساحة- طرح
- في محيط المقصورة لومينال من المحيط المقصورة myoepithelial بغية الحصول على محيط ظهارة الأقنية. طرح منطقة المقصورة لومينال من منطقة حجرة ميوبيثيليال للحصول على مجال ظهارة الأقنية.
- التحليل إيمونوهيستوتشيميستري
- تحميل الصور برايتفيلد لبرامج تحليلية، مثل إيماجيج أو جناح فيجي-
ملاحظة: هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات لتلطيخ التحليل باستخدام إيماجيج والمساعد "الأدوات المدينة"- - فتح "مربع الأدوات المدينة" من قائمة البرنامج المساعد. في " "حدد نموذج" " مربع التحرير والسرد أن يفتح، حدد المناسبة وصمة عار (أي ح-الدأب، PSR، إلخ). حدد " اللون " الخيار لعزل وصمة عار. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة نتيجة.
ملاحظة: هذا الأسلوب مناسبة إذا كان وتين فائدة يقع في الأماكن خارج الخلية أو سيتوسوليك، أو مرتبط بغشاء البلازما. تحديد إذا كان بروتين الفائدة النووية، " نوى " سيطلب البرنامج المساعد لتحليل صورة إيجابية الملون الأنوية. - استخدام "الشريحة منتقي الألوان" لضمان العزل السليم من وصمة عار دون خلفية إدراج أو استبعاد وصمة عار المفرطة.
ملاحظة: إذا كان غير قادر على الكشف عن وصمة عار أو لا ينتج صوراً مقبولة، رسم مربع المنطقة الفائدة (ROI) أكثر تحديد الوضع التلقائي الملون المنطقة. في إطار "الأدوات المدينة"، حدد " قطار " لتوجيه البرنامج المساعد للهدف المناسب. - تحويل الصورة إلى 16-بت. اذهب إلى الصورة → نوع → 16 بت.
- عتبة الصورة. اذهب إلى الصورة → ضبط → السيارات عتبة.
- تعيين مقياس قياس الصورة من رسم خط دوروا مباشرة فوق شريط المقياس في الصورة ثم تعيين الطول. لتعيين شريط مقياس، انتقل إلى تحليل → "ضبط مقياس". إدخال عدد وحدات البكسل لكل وحدة المرجوة من الطول (مثلاً 120 بكسل لكل 50 ميكرومتر). قياس المنطقة الناتجة عن ذلك
- وتعني القيمة الرمادية. اذهب إلى تحليل → "تعيين قياسات" وجمع القياس بواسطة النقر فوق تحليل → التدبير.
- تحميل الصور برايتفيلد لبرامج تحليلية، مثل إيماجيج أو جناح فيجي-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد الفئران الإناث 5 أزواج من الغدد الثديية. على وجه التحديد، هناك زوج واحد من الغدد عنق الرحم (#1)، اثنين من أزواج من الغدد الصدرية (#2 و #3)، زوج واحد من البطن الغدد (#4)، و 1 زوج من الغدد الاربية (#5) (الشكل 1أ). هنا، نحن معزولة في الغدد #4 كما يمكن تحديدها بسهولة. وفي بعض الظروف، الغدد #4 و #5 عزلت معا كما كان من الصعب التمييز بين الأمرين. لعزل سليمة #4 البطن الغدد الثديية، قذف المثبتة ومفصولة بعناية من الصفاق الكامنة، كشف موقع الغدد #4 يتبين من سهم (الشكل 1ب). بعناية الغدد #4 اقتطعت وتفتيشها لوجود أي بقايا من أنسجة تحت الجلد أو العضلات. على الرغم من أن هذه لم تكن قابلة للتحديد في أعمالنا الغدد معزولة (الشكل 1ج)، نلاحظ النسيج تحت الجلد أكبر بكثير في الغدد فيبرونيكتين الملون من كتل الأنسجة التي أزيلت الأنسجة لا قبل تمزيقها (مثلاً سطحية) (الشكل 1د) مقابل الغدد التي 100-200 ميكرون من الأنسجة من الأنسجة في كتلة قد أزيلت قبل تقطيع (مثل العميق) (الشكل 1ﻫ). للحصول على فهم أفضل لتليف الأنسجة في الغدة الثديية استجابة لعوامل خارجية أو داخلية، ولعل المحقق مقارنة التليف في سطحية مقابل إجراء تخفيضات كبيرة للغدة. لتحليلات أخرى، قد يكون من المفيد للمحقق للفرع كتلة الأنسجة في النصف قبل الشروع في تشريح الأنسجة وتلطيخ إذا كبيرة تحت الجلد أو أنسجة العضلات موجودة بعد تشريح الغدة.
بعد العزلة، كانت ثابتة في 10% فورمالين مخزنة محايدة الغدد وتجهيزها ومقطوع لتلطيخ. هي صورت الخطوات المستخدمة لتحليل التعبير الكولاجين بالإضافة إلى البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في الشكل 2A. ويبين الشكل 2بعينات تمثيلية من الكولاجين بروتينات ECM وفيبرونيكتين وتيناسسين-ج. الأسهم في كل من الصور تظهر وجود القنوات في هذه الأنسجة (الشكل 2ب).
لتحديد السمات المورفولوجية للقنوات، من المهم أن علاج المقاطع النسيجي بعناية كما قد يؤدي سوء المناولة في الأنسجة التالفة والقنوات التي لا يمكن قياسها. ربما يتم تشغيل أمثلة على سوء التعامل مع المخازن المؤقتة أو المياه مباشرة على الأنسجة، استخدام المخازن المؤقتة في درجة حرارة غير ملائمة أو ترك عينات الأنسجة في مخازن قاسية مثل سترات الصوديوم وحمض الخليك لفترة أطول من الزمن من المحدد في البروتوكول. ويرد مثال على قسم الأنسجة في الأنسجة التي حدث الضرر في الشكل 3ألف. هنا، يمكن ملاحظة أضرارا بالغة للأنسجة سهولة كنقاط الكسر في القنوات (الشكل 3أ). لا يمكن استخدام مقطع مثل هذا لإجراء تحليلات لهياكل الأقنية. ويرد مثال على عينة الأنسجة سليمة حيث القنوات قابلة للقياس وقابلة للقياس في الشكل 3ب. هنا، ليست مجاري تميزت ستروما الملون فيبرونيكتين المحيطة بها، بل تتميز أيضا بوجود السكان كثيفة للخلايا الظهارية بطانة التجويف القنوات (الشكل 3ب). من المهم ملاحظة أن الغدة الثديية الماوس أثناء التطوير، تحتوي على مجرى هواء واحدة عند الولادة من التي تنبت الفروع الثانوية أفقية، تشكل شجرة الأقنية أكثر تعقيداً مما يخضع لسلسلة من التشعب والانحدار مع كل دورة الشبقية 13-على الرغم من أننا قد لا تؤخذ في الاعتبار دورة الشبقية من الحيوانات في هذه التجارب، المحقق قد ترغب في القيام بذلك بغية الحصول على معلومات عن أرقام الأقنية المستقلة دورة الشبقية. المحقق يحيلها إلى بروتوكول كاليجيوني14 يمكن فيها تحديد المرحلة من مراحل الشبقية واضح. فيما يتعلق بالتحديد الكمي للقنوات، وجود هياكل متعددة الأقنية في هذه المقاطع النسيجي ليس مؤشرا لقنوات متعددة فريدة من نوعها، ولكن بدلاً من ذلك يدل على شجرة الأقنية الأكثر نمواً الناتجة عن ثمرة الأقنية. لتعداد القنوات، قد أحد استخدام برمجيات تحليل صورة مثل إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) لتعيين عدد للقنوات الفردية في قسم أنسجة. ولعل المحقق لتعداد القنوات كتعديلات في أرقام الأقنية، مما قد يكون مؤشرا للتشوهات التطورية أو حالة مرضية. فيما يتعلق بدراستنا، نحن نؤمن بزيادة عدد القنوات، نتيجة لثمرة الأقنية، يرتبط بفقدان كافيولين-1 التي قد تدفع التعبير المنحرف لعوامل النمو مثل الأنسولين عامل النمو 1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، وسيط معروف للماوس الأقنية النمو 15.
بالإضافة إلى وجود قنوات سليمة، تتضمن قنوات عدة فروع، يتبين من الأسهم في قسم الملون فيبرونيكتين (الشكل 3ج). غرض هذا التحليل، ينبغي أن لا تعتبر هذه الفروع الأقنية بنية الأقنية منفصلة. أثناء تقييم وقياس القنوات، من المهم التمييز بين القنوات من هياكل الأوعية الدموية. هياكل الأوعية الدموية يمكن ليس فقط تحديد وجود أحادي الطبقة غشائي بطانة التجويف، ولكن أيضا بوجود هياكل اليوزيني الأسلحة النووية، وتشير إلى خلايا الدم الحمراء (RBC) داخل التجويف (الشكل 3د). على الرغم من وجود هياكل اليوزيني داخل لومن يشير إلى ربك وتقترح المفرج، تشريد ربك أثناء جمع الغدة في جميع أنحاء أقسام الأنسجة من الممكن. فمن المستحسن لتأكيد هياكل الأوعية الدموية باستخدام علامة البطانية CD31. يتم عرض مثال لمقطع النسيجي ملطخة CD31 (الشكل 3د). بغية تحديد محيط الأقنية والمنطقة، يمكن تعيين ناقلات في إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) إلى مخطط الحدود ميوبيثيليال (محيط) والحدود لومينال في قسم الأنسجة α-SMA الملون. واستخدم α-SMA، علامة على خلايا العضلات الملساء، كما أنها البقع الخلايا myoepithelial الذي خط أنابيب. في الصورة التي تظهر، يظهر خط أحمر الحدود myoepithelial في حين يظهر الخط الأزرق الحدود لومينال (الشكل 3ه). المنطقة الواقعة بين المقصورات stromal ولومينال، سيظهر في التخطيطي، هي منطقة تحتلها الأنسجة اللحمية الإجمالي بالإضافة إلى الخلايا الظهارية الأقنية (الشكل 3ه).
الشكل 1 : عزلة غدد الثديية كله، سليمة لإجراء تحاليل نسيجية. (أ) عقب التضحية الحيوانية، قذف تمت إزالته بعناية ويعلق مرة أخرى لفضح الغدد الثديية الموجودة بين الأدمة والصفاق. التخطيطي يبين المواضع النسبية لسرطان عنق الرحم (1 #)، الصدر (#/2 و 3)، الاربية (#5) الغدد والبطن (#4). (ب) #4 الغدد البطن، سيظهر في تشريح الحيوان والإشارة إليها بالأسهم الحمراء، كانت معزولة. (ج) مثال #4 البطن الغدد معزولة عن ماوس B6 الإناث موتهم. (د) والنسيج تحت الجلد كبيرة من الغدد التي أزيلت الأنسجة لا من كتلة البارافين قبل تقطيع (مثل سطحية) كان واضحا بعد تلطيخ فيبرونيكتين بروتين ECM. (ه) كونسيديرابly لوحظت أقل النسيج تحت الجلد وأكثر فيبرونيكتين الملون الأنسجة اللحمية من الغدد التي أزيلت 100-200 ميكرون من الأنسجة من كتلة البارافين قبل تقطيع (مثل العميق). تكون المقاطع النسيجي من عينات تمثيلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: هيستولوجيكال تجهيز وتلطيخ. (أ) التمثيل التخطيطي للخطوات المستخدمة لتجهيز غذائها. واستخدمت مجموعة مختلفة من الخطوات لتحليل التعبير الكولاجين. (ب) صور الممثل الكولاجين بروتينات ECM وفيبرونيكتين وتيناسسين-ج من الغدد في أنثى الحيوانات ناقصة كافيولين 1 موتهم. تشير الأسهم للكولاجين وفيبرونيكتين وتيناسسين-جيم إلى ستروما كثيفة تبطين القنوات. PSR: بيكروسيريوس الأحمر. الجبهة الوطنية: فيبرونيكتين. 10-جيم: تيناسسين-جيم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تحليلات للهندسة المعمارية الأقنية. (أ) يوضح فيبرونيكتين الملون المقطع تلف الأنسجة واسعة النطاق. وهذا يتسم بوجود فواصل في هياكل الأقنية (الأسهم). (ب) فيبرونيكتين الملون المقطع يوضح وجود هياكل سليمة الأقنية التي تميزت بوجود لومن محاطة بطبقة واحدة أو أكثر من الخلايا الظهارية ومن ستروما المحيطة بها. تشير الأسهم إلى هياكل الأقنية الفردية. (ج) صورة ملطخة فيبرونيكتين يبرز وجود فروع الأقنية، التي يشار إليها بالأسهم. ملاحظة استمرارية هذه مع التجويف هيكل الأقنية الأكبر. (د) هياكل الأوعية الدموية (الأسهم الحمراء)، تتميز بطبقة واحدة من الخلايا، ووجود هياكل اليوزيني المنبسطة يدل على خلايا الدم الحمراء، كثيرا ما يلاحظ في التقارب مع القنوات (السهم الأسود). تضخم منخفض يظهر في الصورة على اليسار وتظهر صورة تكبير عالية مقابلة على الحق. هذه الصور كانت ملطخة ح & ه، وجيم تيناسسين واستخدمت CD31 كعلامة إيجابية لخلايا بطانية بطانة هياكل الأوعية الدموية. سيظهر هو بنية الأوعية الدموية كبيرة في CD31 التي تكون الخلايا إيجابية مرئية بطانة تجويف السفينة. تضخم منخفض يظهر في الصورة على اليسار وتظهر صورة تكبير عالية مقابلة على الحق. (ه) وتم قياس محيط الأقنية في صورة α-SMA-الملون باستخدام ناقل (هو مبين في الحمراء) لمخطط حجرة myoepithelial في حين تم قياس المجال الأقنية استخدام ناقل (يظهر باللون الأزرق) المخطط التفصيلي لومينال المقصورة. وقد صنفت المنطقة ما بين المقصورات stromal ولومينال منطقة الأقنية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. التخطيطي هيكل الأقنية تسليط الضوء على المجالات التي قيست المحيط والمساحة. 10-جيم: تيناسسين-جيم تم تعديل المقطع النسيجي في "الشكل الإلكتروني" من: "جيم تومبسون" et al. 16 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الورقة، التي وصفناها تقنية لعزل الغدد الثديية الماوس سليمة لإجراء تحاليل نسيجية المصب التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة ومورفولوجيا الأقنية. فيما يتعلق بتحليلات مورفولوجية الأقنية، تمكن هذه المنهجية التحقيق السريع في الأقنية العمارة أساس الخروج من أقسام نسيجية الملون. طرق أخرى لتحليلات الأقنية تعتمد على حقن الأصباغ لتمكين التصور شجرة الأقنية، الأساليب التي قد تكون من الناحية الفنية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً.
الإصابة بسرطان الثدي، أبلغ إدارة المحتوى في المؤسسة أن تكون غير طبيعية. 1 , 2 , 6 , 9 على وجه التحديد، التغيرات في أنماط وفرة و/أو العابرة للربط إدارة المحتوى في المؤسسة قد أبلغ التأثير على الورم التدرج، وورم خبيث والعلاج المقاومة3،،من46،7 ،،من89. وبالإضافة إلى ذلك، وردت أيضا تغييرات في الوسط ECM لتغيير الخلايا الظهارية الأقنية مورفولوجيا وانتشار17، يمكن أن يفضي إلى وضع تحابي بدء الورم. بينما نحن تستخدم نموذج كافيولين 1 حيوانات قاصرة تقييم التغيرات في التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة ومورفولوجيا الأقنية بعد فقدان كافيولين 1، واحد قد يتم تطبيق هذه المنهجية في أي نموذج الماوس. تقييم أنماط التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة، والهندسة المعمارية الأقنية، يصف لنا تقنية لعزل الغدد الثديية كله، سليمة لإجراء تحاليل نسيجية المتلقين للمعلومات. النتائج من هذه المنهجية أسفرت عن تحليلات قوية التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة ومورفولوجيا غدي. وجدنا هذا التعبير تحليل إدارة المحتوى في المؤسسة، لا سيما فيبرونيكتين، من المقاطع التي تمت إزالة 100-200 ميكرون من الأنسجة السطحية قبل تمزيقها وتلطيخ أسفرت عن صورة أكثر اكتمالا لتليف غدي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن استخدام مصل حمار بدلاً من جيش صرب البوسنة أسفرت عن أفضل نوعية عينات نسيجية فيه تلطيخ غير محددة خفضت إلى حد كبير.
لتحليل بنية الأقنية، من المهم أن تستخدم المقاطع التي أنسجة سليمة وتحتوي على القنوات الذي تشير فيه الكسر، نتيجة للتعامل مع الأنسجة غير لائق وتمزيقها، ليست واضحة. وعلاوة على ذلك، من المهم أن تميز بشكل صحيح فروع الأقنية ومعلمة أخرى قد ترغب محقق لقياس، وهياكل الأوعية الدموية التي يمكن بسهولة تحديد تلك البطانة أحادي الطبقة وهياكل اليوزيني داخل التجويف بالإضافة إلى تلطيخ مع CD31. بينما القنوات لوحظت في أقسام الملون لمختلف ECM البروتينات وعلامة ميوبيثيليال αSMA ح & ه كونتيرستينينج، التي تسلط الضوء على المكونات الخلوية من القنوات، بتعداد القنوات والفروع المرتبطة بها أي قابلة للتحقيق مع ح & ه أقسام النسيج الملون وحدها. لتحليلات أكثر تفصيلاً للأقنية morphogenesis أو تحليلات لوجود آفات ما قبل الورم و/أو الورم، قد يرغب محقق في استخدام التصوير [كنفوكل] لتقييم الأنسجة الحية السابقين فيفو . في هذه الحالة، يمكن تطبيق التقنية نفسها هي التي اقتطعت الغدد كلها مع التثبيت وخطوات القضاء على معالجة الأنسجة.
وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول استخدام الجراحية الموازين الدقيقة التي ليس فقط تمكين تحديد دقيق الغدد البطن #4، ولكن بالإضافة إلى ذلك يسمح تشريح الغدة من الأدمة السطحية والصفاق الكامنة. استبعاد كبير من الأنسجة تحت الجلد والعضلات خفض التدخل الدهنية المرتبطة في تلطيخ وعلم الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، لتحسين تحديد المحتوى التعبير التغيرات في الغدة، وجدنا أنه من مفيدة لإزالة 100-200 ميكرون من كتلة الأنسجة، مما ساعد على إزالة الأنسجة الدهنية المتبقية. على الرغم من أن عزل كامل الغدة الثديية ويقدم معلومات عن الأنسجة تغييرات واسعة في التعبير البروتين stromal والأقنية morphogenesis، وصف أسلوب يقتصر على تحليل المقاطع المسلسل من ثابت، البارافين مضمن الأنسجة. لتحديد درجة التي حدثت تغيرات في الأقنية المتفرعة، تصوير جبل كامل من الأنسجة السابقين فيفو حية، سيكون من الضروري. هنا، يمكن استخدام محقق لوكس Cre لتصميم الاقتران مراسل الفلورسنت مخصصة، والشرطي لدراسة تفاعلات البروتين محددة الغدة أو استخدام صبغة لإلقاء الضوء على شجرة الأقنية قبل التصوير18. وبالإضافة إلى ذلك، كذلك يستلزم تحليل البروتينات لاهتمامها بأكملها الغدة استخدام لطخة غربية أو الكتلي أو تقنيات أخرى الفائق مثل العابرة للربط إيمونوبريسيبيتيشن (كليب) أو الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة). وفي هذه الحالة، أن تشريح الغدد كلها، مقسمة إلى قطع صغيرة وتجهيزها تبعاً لذلك للتحليلات المتلقين للمعلومات. وبالإضافة إلى ذلك، واحدة يمكن أيضا استخدام التصوير الفلورسنت في أقسام الأنسجة. وسيكون هذا الأسلوب المثالي لتحليل البروتينات والبروتين التعبير التعريب المشارك في نفس الأنسجة متعددة.
وباختصار، نحن تصف أسلوب الذي يوفر عزل السريع الغدد الثديية كله، سليمة ويوفر المزيد من التفاصيل على تجهيز غذائها وتحليلات الأقنية. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية يمكن التحقيق في التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة، ويرتبط بها من تغيرات في مورفولوجيا الأقنية في الحيوانات الحاملة للورم. وعلاوة على ذلك، قد أيضا إجراء تحليلات للتوجه الكولاجين والألياف قطر، المعلومات التي قد تكون مفيدة لتحليل كثافة الأنسجة، على PSR الملون المقاطع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن ينوه وايلز نيسان/أبريل والدكتور روجيه بروديرسون للمساعدة مع نيكروبسي الحيوانية وغده العزلة، على التوالي. التمويل اللازم لهذا العمل وأيد مراكز "فيلادلفيا كلية الطب التقويمي" "اضطرابات مزمنة من الشيخوخة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L.
- Caligioni, C. S.
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
