Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.
Abstract
El objetivo de este procedimiento era el #4 abdominal las glándulas mamarias de ratones femeninos nulíparas la cosecha con el fin de evaluar la expresión de ECM y arquitectura ductal. Aquí, un pequeño bolsillo debajo de la piel fue creado usando las tijeras de Mayo, permitiendo la separación de las glándulas en el tejido subcutáneo desde el peritoneo subyacente. Visualización de las glándulas fue ayudado por el uso de 3.5 lupas micro quirúrgicas x-R. La piel fue invertida y cubrió atrás que permite identificación de las almohadillas de grasa mamarias intactas. Cada una de las glándulas abdominales #4 fue disecada sin rodeos deslizando lateralmente la hoja de bisturí entre las glándulas y la capa subcutánea. Inmediatamente después de la cosecha, las glándulas se colocaron en 10% formalina tamponada neutra para el procesamiento posterior del tejido. Supresión de la glándula entera es ventajosa ya que sobre todo elimina el riesgo de excluir interacciones importantes de todo el tejido entre las células epiteliales ductales y otras poblaciones celulares microambiental que podrían perderse en una biopsia parcial. Uno de los inconvenientes de la metodología es el uso de secciones seriadas de tejidos fijadas que limita el análisis de expresión proteína y morfogénesis ductal a lugares discretos dentro de la glándula. Como tal, cambios en la expresión de proteína y arquitectura ductal en 3 dimensiones (3D) no es fácilmente obtenible. En general, la técnica es aplicable a los estudios que requiere todo intactas glándulas mamarias murinas para investigaciones posteriores tales como desarrollo cáncer ductal de morfogénesis o mama.
Introduction
El cáncer de mama se caracteriza por un grado considerable de tejido fibrosis1,2,3,4. Conocido como ECM, esta entidad no celular se encuentra en diferentes grados en todos los tejidos y se compone principalmente de una compleja red de colágenos fibrilares y no fibrilares, elastina y glicoproteínas además varias moléculas de señalización que son secuestrado en esta matriz. En condiciones homeostáticas, la deposición y la degradación de la ECM se controla bien. 5 durante la tumorogénesis de mama, se perturba el equilibrio de la deposición del ECM y la degradación. Así, tumores de mama se han divulgado para expresar proteínas ECM abundantes tales como colágenos, fibronectina y Tenascina-C entre otros. 6 la expresión anormal de estas proteínas además de más patrones de entrecruzamiento de la matriz se ha documentado para promover mama tumor metástasis, terapia y evolución resistencia1,3, 4,7,8,9.
Evaluar la composición del ECM y la morfología ductal, se realizó aislamiento de glándulas mamarias intactas. Aquí hemos utilizado mujeres nulíparas ratones deficientes de caveolina-1, una proteína integral de membrana que se ha ligado a una agresiva mama tumor firma10,11,12, controlar mujeres nulíparas B6 ratones. Procesamiento histológico y la coloración de estos tejidos permiten la identificación de varias proteínas de la ECM junto con la caracterización de la morfología ductal.
En general, el aislamiento de las glándulas mamarias enteros, intactos da a investigadores la oportunidad de investigar todo el tejido celulares o morfológicos cambios que ocurren en respuesta a factores exógenos o endógenos. Inconvenientes de la técnica están relacionadas con el análisis de secciones de tejido de 2 dimensiones (2D) en contraposición a una perspectiva 3D, que daría una imagen más completa de la morfología compleja del árbol ductal. Dada la complejidad de las interacciones célula-célula y célula-ECM que se producen en la glándula mamaria, el aislamiento de glándulas enteras, intactas es ventajoso para analizar eficientemente ductal expresión morfología y de la proteína en varias regiones de la mamario murino glándula.
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Protocol
con sujetos animales en este protocolo los procedimientos fueron revisados y aprobados por la institucional Animal cuidado y uso de la Facultad de medicina osteopática de Filadelfia y todas las técnicas se llevaron a cabo bajo estrictas directrices éticas.
1. obtención de muestra y procesamiento
- seleccionar tema animal apropiado y el lugar en una cámara de CO 2. Para este experimento, usar 8-10 semanas viejo mujer B6 nulíparas. CG-Cav1tmMIs J y C57BI/6J.
- Vuelta en el flujo de gas a 30-40%. Una vez que el animal está visiblemente inconsciente después de unos 2 minutos, abra la válvula de gas a la presión total para un adicional 5 min
Nota: Confirman muerte de animales mediante la observación de signos visibles de la respiración (e.g. movimiento del pecho) por un período de 10 minutos después de la cesación de la entrega de CO 2. Si el animal todavía está vivo, se puede colocar en la cámara de CO 2. Dislocación cervical también puede utilizarse aunque no se recomienda como la sangre se puede acumular alrededor de las glándulas mamarias, interfiriendo con la disección y los resultados. - Después de sacrificio, perno canal en una posición supina y sature con etanol al 70%.
- Pellizcar la piel justo sobre el pubis con pinzas y nick con pequeñas tijeras quirúrgicas. Girando las tijeras, cortar la piel a lo largo de la línea media ventral en movimiento caudal a craneal.
- Con tijeras grandes o una pinza hemostática, sin rodeos disecar la fascia subcutánea bilateral, con precaución de no para perforar el peritoneo. Corte a lo largo de los márgenes horizontales en ambos extremos distales de la incisión. Las aletas
- pin la piel abrir y rociar nuevamente con etanol al 70%.
Nota: Aunque mejor distinción visual entre la glándula y el tejido subcutáneo circundante permite el uso de etanol al 70%, tenga cuidado para evitar la sequedad de los tejidos como resultado de uso de esta solución. Para evitar que se sequen, extirpar la glándula en un marco de tiempo no debe exceder los 4 minutos. Como alternativa a etanol al 70%, el investigador también puede sustituir un búfer de aislamiento general, tales como PBS 1 x, para evitar la desecación del tejido. - Localización de las glándulas mamarias de interés, deslice una hoja de bisturí #4 a lo largo de la parte interior de las aletas de la piel, cortar la glándula mamaria y asociado adiposo cutáneo de la dermis.
Nota: 3.5 x lupas quirúrgicas micro puede ayudar en la mejor visualización de las glándulas. - Inmediatamente sumerja la glándula recientemente aislada en tubo cónico que contiene el volumen de la solución del 10:1-tejido de formalina tamponada neutra 10% por 24-48 h.
Nota: Dependiendo de la intención del estudio, muchos fijadores alternativos pueden utilizarse como paraformaldehido, etanol para estudios de genómica y ARN comercialmente disponible preservar reservas. - Seguir protocolos institucionales para la inclusión en parafina, enviar muestras a un proveedor para el procesamiento, inclusión y rebanar/montaje de la diapositiva. Sección de los tejidos de 5 μm.
Nota: Debido al exceso de la glándula circundante adiposa, considerar retirar 100-200 μm del tejido antes de corte y coloración.
2. Tinción de tejidos
- inmunohistoquímica
- Coloque los portaobjetos teñido en el bloque de calor situado a 58 ° c por 1 h derretir parafina.
PRECAUCIÓN: Derretir la cera de parafina puede funcionar apagado. Vigilar de cerca o lugar para limpiar bajo diapositiva capturar cera escurrimiento.
Nota: Este paso no es esencial y puede omitirse. Si los resultados no son como esperaba, añadiendo este paso atrás puede mejorar los resultados. - Incubar los portaobjetos en una diapositiva de la jarra que contiene xileno 100% durante 30 minutos asegura la inmersión completa. Repetir una vez.
Nota: en este punto, la inspección visual debe realizarse para asegurar que las secciones de tejido libres de tejido adiposo y parafina. Si el tejido adiposo adicional o cera es evidente, la diapositiva debe volver a sumergir en xileno. Tenga cuidado para minimizar la exposición agregada a xileno como esto puede causar la contracción del tejido. - Rehidratar los tejidos en un tarro de la diapositiva que contiene etanol al 100% durante 10 minutos repetición una vez.
- Mover diapositivas a un frasco de la diapositiva que contiene etanol al 95% durante 10 minutos repetición una vez.
- Mover diapositivas una diapositiva tarro que contiene 75% de etanol por 5 min
- Mover diapositivas una diapositiva tarro contiene 50% de etanol por 5 min
- Solución de citrato de sodio 10 mM (pH 6.0) en una placa caliente o un microondas y verter en la jarra de Coplin.
PRECAUCIÓN: Cuidadosamente monitorear la solución mientras que calefacción y evite hervir sobre. Recipiente estará muy caliente. Use protección para evitar quemaduras. - Lentamente Coloque las muestras en recipiente jar, asegurar la inmersión completa e incuban a 100 ° C durante 10 minutos recuperar epitopos. Retire y seque cuidadosamente diapositivas.
- Dibujar una barrera alrededor de tejido con un marcador hidrofóbico. Añadir suficiente bloqueador de la enzima endógena (peróxido de hidrógeno y de azida de sodio, disponible comercialmente) para cubrir el tejido e incubar durante 10 minutos
- Sumerja los portaobjetos en fosfato x 1 tampón salino (PBS) durante 10 minutos
- Añadir suficiente suero de burro de 10% en PBS 1 x para cubrir el tejido e incubar 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
Nota: El experimento puede hacer una pausa aquí por guardar las diapositivas en la cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Mientras que burro suero fue encontrado para obtener óptimos resultados de tinción, el investigador puede desear probar diferentes sueros como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra o caballo suero para determinar resultados óptimos. Si utiliza BSA, el investigador debe preparar esta fresca antes del uso. - Decantar el exceso bloqueador de diapositivas y añadir anticuerpo primario correctamente diluido en 1% de suero directamente a asegurar que el tejido está cubierto uniformemente en la solución de las diapositivas. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
Nota: Este paso puede continuarse durante períodos de tiempo más largo con cámara húmeda almacenada a 4 ° C. Asegúrese de incluir diapositivas de adecuado control negativo (p. ej. una diapositiva con ningún anticuerpo primario conocido tejido antígeno negativo, etc.) en este paso. - Cuidadosamente lavar portaobjetos por fluir aproximadamente 1 mL de diH 2 O sobre tejido e incubar en 1 cambio de 1 x PBS por 5 min
- PBS exceso de decantar y añadir suficiente etiqueta de peroxidasa de rábano picante para cubrir el tejido e incubar por 30 min en una cámara humidificada.
Nota: En este paso, el investigador puede proceder a la tinción utilizando anticuerpos secundarios conjugados fluorescencia fluorescente. Si esto se desea, los siguientes pasos se describe deben modificarse en consecuencia. - Cuidadosamente lavar portaobjetos por fluir aproximadamente 1 mL de diH 2 O sobre tejido e incubar en 1 cambio de 1 x PBS por 5 min
- Diaminobenzidina (DAB) más solución de cromógeno según la proporción sugerida del fabricante y mezclar por vortex.
Nota: Muchos kits preparados están comercialmente disponibles aparte de la que se utiliza en el presente Protocolo. - Decantar exceso de búfer de diapositivas y añadir 2-3 gotas (10-50 μL) de cromógeno mancha directamente a los tejidos y Incubar por 5 min en cámara húmeda. Lavar cuidadosamente las diapositivas por que fluye alrededor de 1 mL diH 2 O sobre tejido.
PRECAUCIÓN: Cromógeno DAB es altamente tóxico. Evitar el contacto directo de mancha con piel y recoge el flujo apagado en residuos peligrosos.
- Coloque los portaobjetos teñido en el bloque de calor situado a 58 ° c por 1 h derretir parafina.
- Hematoxilina y eosina (H & E)
- después de enjuague final después de la incubación del cromógeno, sumerja los portaobjetos en hematoxilina de Harris para diapositivas de 2-2.5 minutos enjuague suavemente con agua del grifo durante 1-2 minutos
Nota: tenga cuidado para evitar el chorro directo de agua en los tejidos. - Sumerja las diapositivas para 2-3 s en diferenciación solución 0,25 mL de ácido clorhídrico en 100 mL de etanol al 70%. Enjuague los portaobjetos suavemente con agua del grifo durante unos 1-2 minutos
- Sumergir diapositivas en agente azul (4.5 mg carbonato de calcio en 100 mL de agua, pH ajustado a 9.4) para 60 portaobjetos enjuague s. en etanol al 95% para 30 s.
- Sumerja los portaobjetos en eosina alcohólica Y para 2-3 min.
- Deshidratar el tejido en 2 cambios de etanol al 95% durante 1 minuto.
- Tejido de deshidratar en 1 cambio de etanol al 100% durante 1 minuto
- Diapositivas secas cuidadosamente con una toallita libre de pelusas. Aplicar 1 gota (aproximadamente 100-200 μL) sintéticas, no-acuosas, medios y aplicar cubreobjetos de montaje a base de resina.
Nota: Si se eligió un método de tinción diferente, un medio de montaje diferentes puede ser necesario. Por ejemplo, si el investigador eligió un anticuerpo secundario conjugado fluorescente, un montaje acuoso sería lo más ideal. - Permite diapositivas fijar un día para otro a temperatura ambiente.
- después de enjuague final después de la incubación del cromógeno, sumerja los portaobjetos en hematoxilina de Harris para diapositivas de 2-2.5 minutos enjuague suavemente con agua del grifo durante 1-2 minutos
- Rojo Picrosirio (PSR) tinción
- seleccionar las diapositivas a mancharse y seguir protocolo de inmunohistoquímica hasta el paso 6 (baño de etanol al 50%).
- Sumerja los portaobjetos en PSR manchan por 1 h.
- Sumergir las muestras en ácido acético al 0.5% para 1-2 s, dos veces para diferenciar mancha.
- Deshidratar los tejidos en 2 cambios de etanol al 95% durante 1 minuto.
- Deshidratar los tejidos en 1 cambio de etanol al 100% durante 1 minuto
- Claro diapositivas sumergiendo brevemente en xileno 100% de sobre 3-4 s.
- Diapositivas secas cuidadosamente con una toallita libre de pelusas. Aplicar 1 gota (aproximadamente 100-200 μL) sintéticas, no-acuosas, medios y aplicar cubreobjetos de montaje a base de resina.
3. Análisis de la muestra
- Análisis Ductal
- seleccionar diapositivas mancharon para α-SMA. Utilizando un microscopio de luz con un objetivo montado en cámara, recoger imágenes representativas con 20 aumentos.
- Utilizar ImageJ (NIH), distinguir y contar los conductos en cada imagen. Estos se pueden enumerar manualmente o se puede asignar una puntuación numérica a conductos individuales. Para asignar una calificación numérica, abra ImageJ y seleccione Plugins. A continuación seleccione Analyze y elija celda contador en el menú desplegable. Haga clic en inicializar luego resalte tipo 1 para conductos de etiquetado. Cuando haya terminado, seleccione resultados para ver la cuenta ductal.
Nota: tenga cuidado para verificar las estructuras ductales y vascular no. - En ' medida establecer ' opciones, compruebe ' perímetro ' y ' área de ".
- Usando la herramienta de polígono a mano alzada, dibujar una línea alrededor de cada tubo en el compartimento mioepiteliales (visibilidad ayudado por la mancha de α-SMA). Seleccione ' medida ' y registrar el perímetro y área.
- Otra vez con la herramienta de polígono a mano alzada, dibujar una línea a lo largo de la parte apical del epitelio ductal en el interior del lumen. Seleccione ' medida ' y registrar el perímetro y área.
- Restar del perímetro del compartimiento luminal del perímetro del compartimiento mioepiteliales para obtener la circunferencia del epitelio ductal. Restar el área del compartimiento luminal de la zona del compartimiento del mioepiteliales para obtener el área del epitelio ductal de.
- Análisis de inmunohistoquímica
- subir imágenes trasmitida a un software de análisis, como el ImageJ o FIJI Suite.
Nota: Este protocolo describe los pasos para la tinción de análisis con ImageJ y el plugin de herramientas de IHC. - Abrir la caja de herramientas de la IHC en el menú del Plugin. En el " seleccionar modelo " desplegable que se abre, seleccione mancha apropiada (es decir, H-DAB, PSR, etc.). Seleccione la " Color " opción para aislar la mancha. Se abrirá una ventana de resultados.
Nota: Este método es apropiado si una proteína de interés se encuentra en los espacios extracelulares o citosólicas, o está ligada a la membrana plasmática. Si la proteína de interés es nuclear, seleccionar " núcleos " pedirá el plugin para analizar la imagen de núcleos teñidos positivamente. - Utilizar el deslice el selector de Color para asegurar el aislamiento adecuado de la mancha sin fondo inclusión o exclusión de tinción excesiva.
Nota: Si el modo automático es incapaz de detectar el tinte o no produce imágenes aceptables, dibujar un cuadrado de región de interés (ROI) más identificada manchado región. En la ventana Toolbox de IHC, seleccione " tren " para dirigir el plugin en el destino correspondiente. - Convertir la imagen a 16 bits. Ir a imagen → tipo → 16 bit.
- Umbral de la imagen. Ir a imagen → ajuste → Auto umbral.
- Establecer la escala de medición de la imagen dibujando una línea de retorno de la inversión directamente sobre la barra de escala en la imagen entonces asignar la longitud. Para establecer la barra de escala, vaya a análisis → escala conjunto. El número de píxeles por la unidad de longitud (por ejemplo 120 píxeles por 50 μm) deseada de entrada.
- Medir el área resultante y valor de gris medio. Ir a la analizar → establecer medidas y recoger la medición haciendo clic en analizar → medida.
- subir imágenes trasmitida a un software de análisis, como el ImageJ o FIJI Suite.
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Representative Results
Ratones hembras tienen 5 pares de glándulas mamarias. En concreto, hay un par de glándulas cervicales (#1), dos pares de glándulas torácicas (#2 y #3), un par de glándulas abdominales (#4) y 1 par de glándulas inguinales (#5) (figura 1A). Aquí, se aislaron las glándulas #4 ya que son fácilmente identificables. En algunas circunstancias, las glándulas #4 y #5 se aislaron juntos como distinción entre los dos fue difícil. Para aislar intacto #4 abdominal glándulas mamarias, la piel se cubrió y cuidadosamente se separa el peritoneo subyacente, revelando la localización de las glándulas de #4, indicada por una flecha (figura 1B). Las glándulas #4 cuidadosamente fueron suprimidas y examinadas para la presencia de cualquier tejido subcutáneo o muscular residual. Aunque estos no eran identificables en nuestras glándulas aisladas (figura 1C), nota substancialmente más tejido subcutáneo glándulas teñido de fibronectina de bloques de tejido en el que tejido no había sido quitado antes de seccionamiento (p. ej. superficial) (figura 1D) versus las glándulas en que 100-200 μm del tejido del tejido bloque había sido quitado antes de seccionamiento (por ejemplo, profundidad) (figura 1E). Para obtener una mejor comprensión de la fibrosis de tejido en la glándula mamaria en respuesta a factores exógenos o endógenos, el investigador puede desear comparar fibrosis en superficiales versus cortes profundos de la glándula. Para otros análisis, puede ser ventajosa para el investigador a la sección del bloque de tejido por la mitad antes de proceder al corte del tejido coloración si sustancial subcutáneo y tejido muscular está presente después de la disección de la glándula.
Tras aislamiento, glándulas fueron fijadas en formalina tamponada neutra 10%, procesadas y seccionadas para tinción. Los pasos utilizados para analizar la expresión de colágeno además de otras proteínas de interés se muestran en la figura 2A. Muestras representativas de la colágeno de proteínas ECM, la fibronectina y la Tenascina-C se muestran en la figura 2B. Las flechas en cada una de las imágenes muestran la presencia de conductos en estos tejidos (figura 2B).
Para cuantificar las características morfológicas de los conductos, es importante tratar las secciones histológicas con cuidado, como manejo inadecuado puede resultar en tejidos dañados y conductos que no son mensurables. Ejemplos de manipulación inadecuada pueden utilizar tampones o agua directamente sobre los tejidos, utilizando búferes a una temperatura inadecuada o dejando muestras de tejido en ásperos tampones como el citrato de sodio y ácido acético por un largo periodo de tiempo que lo especificado en el protocolo. En la figura 3Ase muestra un ejemplo de una sección de tejido en que tejido se ha producido daño. Aquí, grandes daños en el tejido se pueden observar fácilmente como puntos de rotura en los conductos (figura 3A). Una sección como ésta no puede utilizarse para el análisis de las estructuras ductales. En la figura 3B, se muestra un ejemplo de un espécimen de tejido intacto que los conductos son medibles y cuantificables. Los conductos están aquí, no sólo caracterizado por el tejido conectador circundante teñido de fibronectina, pero también se caracterizan por la presencia de una densa población de células epiteliales que recubren el lumen de los conductos (figura 3B). Es importante señalar que durante el desarrollo, la glándula mamaria de ratón contiene un único conducto en el nacimiento de que broten ramas secundarias laterales, formando un árbol ductal más complicado que se somete a una serie de ramificaciones y regresión con cada ciclo estral 13. aunque no hemos tomado en consideración el ciclo estral de los animales en estos experimentos, el investigador puede hacerlo con el fin de obtener información sobre números ductales independientes del ciclo estral. El investigador se refiere a un protocolo de Caligioni14 en la cual se puede determinar la etapa del ciclo estral visiblemente. Con respecto a la cuantificación de los conductos, la presencia de múltiples estructuras ductales en estas secciones histológicas no es indicativa de múltiples conductos únicos, pero es más bien indicativa de un árbol ductal más desarrollado resultantes de extensión ductal. Para enumerar los conductos, uno puede utilizar un software de análisis de imagen como el ImageJ (NIH) para asignar a un número a conductos individuales en una sección de tejido. El investigador puede desear enumerar los conductos como alteraciones en números ductales, que pueden ser indicativos de anomalías del desarrollo o una condición patológica. Con respecto a nuestro estudio, nos creen que el aumento del número de conductos, consecuencia de la extensión ductal, se relaciona con la pérdida de caveolina-1, que puede conducir a la expresión aberrante de factores de crecimiento como factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1), un mediador conocido de ratón ductal crecimiento 15.
Además de la presencia de conductos intactas, varios conductos contienen ramas, indicados por las flechas en una sección de teñido de fibronectina (figura 3C). Con el propósito de este análisis, estas ramas ductales no deben considerarse como una estructura ductal separada. Mientras que la evaluación y medición de conductos, es importante distinguir los conductos de estructuras vasculares. Estructuras vasculares no sólo se pueden identificar por la presencia de una monocapa endotelial del lumen de la guarnición, pero también por la presencia de indicativo a nuclear, eosinófilo estructuras de células de sangre rojas (RBC) dentro del lumen (figura 3D). Aunque la presencia de estructuras eosinófilas dentro de lúmenes indica RBC y sugiere la vasculatura, el desplazamiento de eritrocitos durante la recogida de la glándula a lo largo de las secciones de tejido es posible. Es recomendable confirmar estructuras vasculares mediante el marcador endotelial CD31. Se muestra un ejemplo de un corte histológico teñido con CD31 (figura 3D). Para cuantificar el área y la circunferencia ductal, vectores en ImageJ (NIH) pueden asignarse para delinear la frontera mioepiteliales (circunferencia) y la frontera luminal en la sección de tejido manchado con α-SMA. Α-SMA, un marcador de células musculares lisas, se utilizó como tiñe las células mioepiteliales que recubren los conductos. En la imagen, la línea roja muestra la frontera mioepiteliales mientras que la línea azul muestra la frontera luminal (figura 3E). La región entre los compartimientos stromal y luminales, que se muestra en el esquema, es el área ocupada por el tejido estromal total además de las células epiteliales ductales (figura 3E).
Figura 1 : Aislamiento de glándulas mamarias enteras, intactas para análisis histológicos. (A) sacrificio de animales, la piel fue quitada cuidadosamente y puestas hacia atrás para exponer la glándula mamaria situada entre la dermis y el peritoneo. El esquema muestra las posiciones relativas de la cervical (#1), torácica (números de 2 y 3), abdominal (#4) y glándulas (#5) inguinales. (B) glándulas abdominales el #4, se muestra en el animal disecado e indicado por las flechas rojas, fueron aisladas. (C) ejemplo de #4 glándulas abdominales aislados de un ratón hembra nulíparas de B6. (D) tejido subcutáneo substancial de glándulas en la cual tejido no había sido quitado desde el bloque de parafina antes de seccionamiento (e.g. superficial) fue evidente después de la coloración para el ECM proteínas fibronectina. (E) Considerably menos tejido subcutáneo y más fibronectina manchado tejido stromal fueron observados de las glándulas en el que había sido quitado 100-200 μm de tejido desde el bloque de parafina antes de seccionamiento (e.g. profunda). Las secciones histológicas son de muestras representativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: histológicas de procesamiento y tinción de. (A) representación esquemática de los pasos utilizados para el procesamiento histológico. Una serie diferente de pasos se utilizó para el análisis de la expresión de colágeno. (B) imágenes representativas del ECM proteínas colágeno, fibronectina y tenascin-C de las glándulas de mujeres nulíparas animales deficientes de caveolina-1. Flechas para colágeno, fibronectina y Tenascina-C indican el estroma denso revestimiento de los conductos. PSR: Picrosirio rojo. FN: fibronectina. 10-C: tenascin-C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: análisis de la arquitectura ductal. (A) una fibronectina manchado sección ilustra el daño tisular extensa. Este se caracteriza por la presencia de roturas en las estructuras ductales (flechas). (B) una fibronectina manchado sección ilustra la presencia de estructuras ductales intactas que están marcadas por la presencia de lúmenes rodeado por una o más capas de células epiteliales y un estroma circundante. Las flechas indican las estructuras ductales individuales. (C) una imagen manchada de fibronectina destaca la presencia de ramas ductales, que se indican con flechas. Tenga en cuenta la continuidad de estos con la luz de la más grande estructura ductal. (D) estructuras vasculares (flechas rojas), caracterizadas por una sola capa de células y la presencia de un-nucleated eosinófilas estructuras indicativas de glóbulos rojos, se observan con frecuencia cerca de los conductos (flecha negra). Ampliación baja se muestra en la imagen de la izquierda y una imagen de alta ampliación correspondiente se muestra a la derecha. Estas imágenes fueron teñidas con H & E y tenascin-C. CD31 fue utilizado como un marcador positivo para las células endoteliales que recubren las estructuras vasculares. Es una gran estructura vascular en que CD31 células positivas son visibles recubren el lumen del vaso. Ampliación baja se muestra en la imagen de la izquierda y una imagen de alta ampliación correspondiente se muestra a la derecha. (E) circunferencia Ductal se midió en una imagen de α-SMA-manchada usando un vector (mostrado en rojo) para delinear el compartimiento mioepiteliales y zona ductal se midió usando un vector (mostrado en azul) para exponer el compartimiento luminal. La región entre los compartimientos stromal y luminales fue clasificada como la zona ductal. Barra de escala = 50 μm. esquema de una estructura ductal, destacando las áreas de la cual se midieron el perímetro y el área. 10-C: tenascin-C. La sección histológica en la figura E fue modificada de: Thompson C et al. 16 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En el papel, hemos descrito una técnica para aislar las glándulas mamarias de ratón intacto para análisis histológicos aguas abajo de ECM expresión y morfología ductal. Con respecto al análisis de la morfología ductal, esta metodología permite la rápida investigación de arquitectura ductal con sede fuera de las secciones histológicas teñidas. Otros métodos de análisis ductales dependen de inyecciones de colorantes para permitir la visualización del árbol ductal, métodos que pueden ser técnicamente difícil y desperdiciador de tiempo.
En cáncer de mama, el ECM ha divulgado para ser anormales. 1 , 2 , 6 , 9 específicamente, cambios en los patrones de abundancia o Cross-linking del ECM se han divulgado para influir tumor metástasis, terapia y evolución resistencia3,4,6,7 ,8,9. Además, cambios en el medio del ECM también se han divulgado para alterar células epiteliales ductales proliferación y morfología17, puede conducir a una situación favoreciendo la iniciación del tumor. Mientras que se utilizó un modelo animal deficiente de caveolina-1 para evaluar los cambios en la expresión de ECM y morfología ductal después de la pérdida de caveolina-1, se puede aplicar esta metodología en cualquier modelo de ratón. Para evaluar los patrones de expresión de ECM y arquitectura ductal, describimos una técnica para aislar glándulas mamarias enteras, intactas para posteriores análisis histológicos. Resultados de esta metodología producido robustos análisis de expresión del ECM y la morfología glandular. Encontramos que analizando la expresión ECM, especialmente de fibronectina, de secciones en la que 100-200 μm de tejido superficial fue quitado antes de corte y coloración rindió una imagen más completa de la fibrosis glandular. Además, hemos encontrado que uso de suero de burro en lugar de BSA rindió mejor muestras histológicas de calidad que tinción inespecífica fue reducido substancialmente.
Para el análisis de la arquitectura ductal, es importante utilizar secciones en que los tejidos están intactos y contienen conductos en que puntos de rotura, consecuencia del manejo inadecuado del tejido y seccionamiento, no son evidentes. Además, es importante distinguir correctamente ramas ductales, otro parámetro que un investigador puede medir y estructuras vasculares que pueden identificarse fácilmente por su endotelio monocapa y estructuras eosinófilas dentro de la luz además de tinción con CD31. Mientras que los conductos se observaron en las secciones manchadas para varias proteínas de la ECM, las mioepiteliales marcador αSMA y H & E contratinción, que destacó el componente celular de los conductos, enumeración de los conductos y las sucursales asociadas es con H & E secciones de tejido manchado solo. Para análisis más detallados de la morfogénesis ductal o análisis de la presencia de lesiones pre-neoplásicas y neoplásicas, un investigador puede desear utilizar la proyección de imagen confocal para evaluar tejidos vivo ex vivo . En este caso, se puede aplicar la misma técnica en la que son suprimidas todo glándulas con la fijación y el tejido eliminados pasos de procesamiento.
Pasos críticos en este protocolo incluyen el uso de lupas quirúrgicas micro que no sólo permitió la identificación precisa de las glándulas abdominales de #4, pero además permite la disección de la glándula de la dermis suprayacente y el peritoneo subyacente. La exclusión de importantes tejidos subcutáneos y músculos reduce interferencia adiposo asociado en la coloración y la histología. Además, para identificar mejor los cambios de expresión de ECM en la glándula, nos pareció útil para eliminar 100-200 μm del bloque de tejido, que ayudó a eliminar tejido adiposo residual. Aunque toda glándula mamaria aislamiento proporciona información sobre el tejido grandes cambios en la expresión de la proteína stromal y morfogénesis ductal, la técnica descrita se limita al análisis de secciones seriadas de fijo, parafina encajados los tejidos. Para establecer el grado al que se han producido cambios en la ramificación ductal, Monte toda la proyección de imagen de tejidos ex-vivo vivo, sería necesario. Aquí, un investigador puede usar Cre-Lox diseño de conjugaciones reportero fluorescente custom, condicionales para estudiar interacciones de proteínas específicas de la glándula o utilizar un tinte para iluminar el árbol ductal antes de la proyección de imagen18. Además, otros análisis de proteínas de interés en la totalidad de la glándula requieren el uso de western blot o espectrometría de masas u otras técnicas de alto rendimiento como el cross-linking inmunoprecipitación (CLIP) o cromatina inmunoprecipitación (ChIP). En este caso, disectadas glándulas enteras, seccionado en trozos pequeños y por consiguiente procesadas para el análisis de aguas abajo. Además, uno también puede usar imágenes fluorescentes en cortes de tejidos. Esta técnica sería ideal para el análisis de múltiples proteínas y co-localización expresión de proteínas en el tejido mismo.
En Resumen, se describe una técnica que ofrece el rápido aislamiento de enteros, intactos de las glándulas mamarias y otros datos sobre procesamiento histológico y análisis ductales. Futuras aplicaciones de esta técnica podrían investigar ECM expresión y cambios asociados en la morfología ductal en animales con tumores. Además, los análisis de orientación colágeno y diámetro de la fibra, información que puede ser útil para el análisis de densidad del tejido, se pueden realizar en PSR secciones manchada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer engaños abril y Dr. Roger Broderson de asistencia con animal necropsia y aislamiento de la glándula, respectivamente. Fondos para este trabajo fue apoyado por los centros de la Philadelphia College of Osteopathic Medicine para trastornos crónicos del envejecimiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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