Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l’espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.
Abstract
L’obiettivo di questa procedura era raccogliere le ghiandole mammarie addominale #4 da topi femmine nullipare al fine di valutare l’espressione di ECM e architettura duttale. Qui, una piccola tasca sotto la pelle è stata creata utilizzando forbici Mayo, permettendo la separazione delle ghiandole all’interno del tessuto sottocutaneo dal peritoneum sottostante. Visualizzazione delle ghiandole è stata aiutata dall’uso di 3.5 micro lenti di ingrandimento chirurgiche x-R. Il cuoio è stato invertito e frenate permettendo identificazione delle pastiglie grasse mammarie intatte. Ciascuna delle ghiandole addominali #4 senza mezzi termini è stato dissecato facendo scorrere la lama del bisturi lateralmente tra lo strato sottocutaneo e le ghiandole. Immediatamente dopo il raccolto, ghiandole sono state collocate in 10% formalina neutra tamponata per l’elaborazione successiva del tessuto. L’asportazione di intera ghiandola è vantaggioso perché principalmente Elimina il rischio di escludere importanti tutto il tessuto interazioni tra cellule epiteliali duttali e altre popolazioni cellulari microambientali che potrebbero essere perso in una biopsia parziale. Uno svantaggio della metodologia è l’uso delle sezioni di serie dai tessuti fissi che limita l’analisi dell’espressione di morfogenesi e proteica ductal per luoghi discreti all’interno della ghiandola. Come tale, cambiamenti nell’espressione della proteina e architettura duttale in 3 dimensioni (3D) non è facilmente ottenibile. Nel complesso, la tecnica è applicabile agli studi che richiedono tutto intatti murini ghiandole mammarie per le indagini a valle quali inerente allo sviluppo del cancro ductal di morfogenesi o al seno.
Introduction
Cancro al seno è caratterizzato da un notevole grado di fibrosi del tessuto1,2,3,4. Indicato come ECM, questa entità non cellulare è trovata in vari gradi in tutti i tessuti e principalmente è costituita da un complesso reticolo di collageni fibrillari e non fibrillare, elastina e glicoproteine oltre a varie molecole di segnalazione che sono sequestrato in questa matrice. Condizioni omeostatiche, la deposizione e la degradazione dell’ECM è strettamente controllato. 5 durante il tumorigenesis mammario, l’equilibrio della deposizione di ECM e degradazione viene interrotto. Come tale, i tumori del seno sono stati segnalati per esprimere proteine ECM abbondanti come il collagene, fibronectina e tenascin-C tra gli altri. 6 l’espressione anormale di queste proteine oltre ai modelli di maggiore di reticolazione della matrice è stato documentato per promuovere seno tumore progressione, metastasi e terapia resistenza1,3, 4,7,8,9.
Per valutare la composizione di ECM e morfologia duttale, isolamento delle ghiandole mammarie intatti è stato effettuato. Qui, abbiamo usato donna nullipari topi carenti per caveolin-1, una proteina integrale di membrana che è stata collegata a un aggressivo al seno tumore firma10,11,12e controllo donna nullipara B6 topi. Istologica di lavorazione e colorazione di questi tessuti consentito l’identificazione di parecchie proteine ECM insieme a caratterizzazione della morfologia duttale.
Nel complesso, l’isolamento delle ghiandole mammarie interi, intatti offre ai ricercatori l’opportunità di studiare i cambiamenti morfologici o cellulare di tutto il tessuto che si verificano in risposta a fattori esogeni o endogeni. Svantaggi della tecnica sono associati con analisi delle sezioni del tessuto di 2 dimensioni (2D) al contrario di una prospettiva 3D, che produrrebbe un’immagine più completa della complessa morfologia dell’albero duttale. Data la complessità delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM che si svolgono nella ghiandola mammaria, l’isolamento delle ghiandole interi, intatti è vantaggioso per analizzare in modo efficiente ductal morfologia ed espressione della proteina in varie regioni di mammario murino della ghiandola.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel libro, abbiamo descritto una tecnica per isolare le ghiandole mammarie del mouse intatto per le analisi istologiche a valle di espressione di ECM e morfologia duttale. Per quanto riguarda l’analisi della morfologia duttale, questa metodologia consente l’indagine rapida dell’architettura duttale basata al largo di sezioni istologiche macchiate. Altri metodi di analisi ductal si basano sulle iniezioni di coloranti per consentire la visualizzazione dell’albero duttale, metodi che possono essere tecnicamente impegnativo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare aprile Wiles e Dr. Roger Broderson per assistenza con l’autopsia degli animali e l’isolamento della ghiandola, rispettivamente. Finanziamenti per quest’opera è stato sostenuto dai centri di Philadelphia College of Osteopathic Medicine per malattie croniche di invecchiamento.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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