Summary

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Published: October 30, 2017
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l’isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l’espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.

Abstract

L’obiettivo di questa procedura era raccogliere le ghiandole mammarie addominale #4 da topi femmine nullipare al fine di valutare l’espressione di ECM e architettura duttale. Qui, una piccola tasca sotto la pelle è stata creata utilizzando forbici Mayo, permettendo la separazione delle ghiandole all’interno del tessuto sottocutaneo dal peritoneum sottostante. Visualizzazione delle ghiandole è stata aiutata dall’uso di 3.5 micro lenti di ingrandimento chirurgiche x-R. Il cuoio è stato invertito e frenate permettendo identificazione delle pastiglie grasse mammarie intatte. Ciascuna delle ghiandole addominali #4 senza mezzi termini è stato dissecato facendo scorrere la lama del bisturi lateralmente tra lo strato sottocutaneo e le ghiandole. Immediatamente dopo il raccolto, ghiandole sono state collocate in 10% formalina neutra tamponata per l’elaborazione successiva del tessuto. L’asportazione di intera ghiandola è vantaggioso perché principalmente Elimina il rischio di escludere importanti tutto il tessuto interazioni tra cellule epiteliali duttali e altre popolazioni cellulari microambientali che potrebbero essere perso in una biopsia parziale. Uno svantaggio della metodologia è l’uso delle sezioni di serie dai tessuti fissi che limita l’analisi dell’espressione di morfogenesi e proteica ductal per luoghi discreti all’interno della ghiandola. Come tale, cambiamenti nell’espressione della proteina e architettura duttale in 3 dimensioni (3D) non è facilmente ottenibile. Nel complesso, la tecnica è applicabile agli studi che richiedono tutto intatti murini ghiandole mammarie per le indagini a valle quali inerente allo sviluppo del cancro ductal di morfogenesi o al seno.

Introduction

Cancro al seno è caratterizzato da un notevole grado di fibrosi del tessuto1,2,3,4. Indicato come ECM, questa entità non cellulare è trovata in vari gradi in tutti i tessuti e principalmente è costituita da un complesso reticolo di collageni fibrillari e non fibrillare, elastina e glicoproteine oltre a varie molecole di segnalazione che sono sequestrato in questa matrice. Condizioni omeostatiche, la deposizione e la degradazione dell’ECM è strettamente controllato. 5 durante il tumorigenesis mammario, l’equilibrio della deposizione di ECM e degradazione viene interrotto. Come tale, i tumori del seno sono stati segnalati per esprimere proteine ECM abbondanti come il collagene, fibronectina e tenascin-C tra gli altri. 6 l’espressione anormale di queste proteine oltre ai modelli di maggiore di reticolazione della matrice è stato documentato per promuovere seno tumore progressione, metastasi e terapia resistenza1,3, 4,7,8,9.

Per valutare la composizione di ECM e morfologia duttale, isolamento delle ghiandole mammarie intatti è stato effettuato. Qui, abbiamo usato donna nullipari topi carenti per caveolin-1, una proteina integrale di membrana che è stata collegata a un aggressivo al seno tumore firma10,11,12e controllo donna nullipara B6 topi. Istologica di lavorazione e colorazione di questi tessuti consentito l’identificazione di parecchie proteine ECM insieme a caratterizzazione della morfologia duttale.

Nel complesso, l’isolamento delle ghiandole mammarie interi, intatti offre ai ricercatori l’opportunità di studiare i cambiamenti morfologici o cellulare di tutto il tessuto che si verificano in risposta a fattori esogeni o endogeni. Svantaggi della tecnica sono associati con analisi delle sezioni del tessuto di 2 dimensioni (2D) al contrario di una prospettiva 3D, che produrrebbe un’immagine più completa della complessa morfologia dell’albero duttale. Data la complessità delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM che si svolgono nella ghiandola mammaria, l’isolamento delle ghiandole interi, intatti è vantaggioso per analizzare in modo efficiente ductal morfologia ed espressione della proteina in varie regioni di mammario murino della ghiandola.

Protocol

procedure che coinvolgono animali soggetti in questo protocollo sono stata esaminate e approvate dal comitato di uso del Philadelphia College di medicina osteopatica e istituzionali Animal Care e tutte le tecniche sono state condotte sotto rigoroso linee guida etiche. 1. esempio approvvigionamento e trattamento selezionare appropriato soggetto animale e posto in una camera di CO 2. Per questo esperimento, utilizzare 8-10 settimane vecchio donna nullipara B6. CG-Cav1tmMIs…

Representative Results

I topi femminili hanno 5 paia di ghiandole mammarie. In particolare, c’è una coppia di ghiandole cervicali (#1), due paia di ghiandole toraciche (#2 e #3), una coppia di ghiandole addominali (#4) e 1 paio di ghiandole inguinali (#5) (Figura 1A). Qui, abbiamo isolato le ghiandole #4 come sono facilmente identificabili. In alcune circostanze, sia #4 e #5 ghiandole sono state isolate insieme come distinzione tra i due era difficile. Per isolare…

Discussion

Nel libro, abbiamo descritto una tecnica per isolare le ghiandole mammarie del mouse intatto per le analisi istologiche a valle di espressione di ECM e morfologia duttale. Per quanto riguarda l’analisi della morfologia duttale, questa metodologia consente l’indagine rapida dell’architettura duttale basata al largo di sezioni istologiche macchiate. Altri metodi di analisi ductal si basano sulle iniezioni di coloranti per consentire la visualizzazione dell’albero duttale, metodi che possono essere tecnicamente impegnativo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desidera ringraziare aprile Wiles e Dr. Roger Broderson per assistenza con l’autopsia degli animali e l’isolamento della ghiandola, rispettivamente. Finanziamenti per quest’opera è stato sostenuto dai centri di Philadelphia College of Osteopathic Medicine per malattie croniche di invecchiamento.

Materials

Light Microscope Olympus BX43
Microscope Camera Olympus DP73
Image Analysis Software Olympus cellSens Entry software
NIH ImageJ
3.5x-R Surgical Micro Loupes Rose Micro Solutions Magnification at researcher's preference
Mayo Scissors Medline DYND04035
Staining Rack Fisher Scientific 121
Staining Dish Fisher Scientific 112
Coplin Jars Fisher Scientific 19-4
Glass coverslips Fisher Scientific 12-550-15 Size appropriate for tissue
IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) Dako K400611-2
Picrosirius Red Kit Abcam AB150681
Eosin Y, alcoholic Sigma-Aldrich HT110132
Harris Hematoxylin Sigma-Aldrich HHS16
Donkey Serum EMD Millipore S30
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Xylenes, Reagent Grade Sigma-Aldrich 214736
Ethanol, 200 proof Sigma-Aldrich 792780 suitable for molecular biology
Phosphate Buffered Saline, 1x Gibco 10010023
Sodium Citrate Fisher Scientific S279-500
Calcium Carbonate Sigma-Aldrich 202932
Permanent Mounting Medium Dako S1964
Eukitt's Mounting Medium Sigma-Aldrich 3989
Fibronectin antibody Abcam AB23750
Tenascin-C antibody Abcam AB108930
Alpha Smooth Muscle Actin antibody Abcam AB124964
Dako Envision Dual Link System HRP Dako K4065

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Cite This Article
Thompson, C., Keck, K., Hielscher, A. Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology. J. Vis. Exp. (128), e56512, doi:10.3791/56512 (2017).

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