完整、全小鼠乳腺的分离及细胞外基质表达及腺体形态学分析
Summary
在这里, 我们提出了一个完整的, 完整的小鼠乳腺分离的协议, 以研究细胞外基质 (ECM) 的表达和导管形态学。小鼠 #4 腹腺从8-10 周大的雌性产妇小鼠中提取, 固定在中性缓冲福尔马林中, 用免疫组织化学方法对 ECM 蛋白进行切片和染色。
Abstract
本程序的目的是从雌性产妇小鼠中获取 #4 腹乳腺, 以评估 ECM 表达和导管结构。在这里, 一个小的口袋下面的皮肤是创建使用梅奥剪刀, 允许分离的腺体内皮下组织的基础腹膜。3.5x 手术微放大镜的使用, 辅助了腺体的可视化。该毛皮被倒置和固定回来, 允许鉴定完整的乳房脂肪垫。每一个 #4 的腹腺都是通过滑动解剖刀刀片在皮下层和腺体之间进行了坦率的解剖。立即收获后, 腺体被放置在10% 中性缓冲福尔马林随后组织处理。切除整个腺体是有利的, 因为它主要消除了风险, 排除重要的组织范围之间的相互作用导管上皮细胞和其他微细胞的人口, 可能会错过的部分活检。该方法的缺点之一是使用固定组织的序列切片, 限制了导管形态发生和蛋白质表达对腺体内离散位置的分析。因此, 3 维 (3D) 的导管结构和蛋白质表达的变化是不容易获得的。总的来说, 该技术适用于需要完整完整的小鼠乳腺进行下游研究, 如发育性导管形态发生或乳腺癌。
Introduction
乳腺癌的特点是有相当程度的组织纤维化1,2,3,4。被称为 ECM, 这个泡沫塑料实体是在不同程度的发现在所有组织和主要由一个复杂的网状纤维和 non-fibrillar 胶原蛋白, 弹力素, 和糖蛋白, 除了各种信号分子, 是隔离在这个矩阵。在稳态条件下, ECM 的沉积和降解受到严格控制。5在乳腺肿瘤发生过程中, ECM 沉积和降解的平衡被破坏。因此, 据报道, 乳腺肿瘤表达了丰富的 ECM 蛋白, 如胶原、纤维连接蛋白和素等。6这些蛋白的异常表达除了增加基质交联的模式外, 还记录了促进乳腺肿瘤的进展、转移和治疗的抵抗力1、3、 4,7,8,9。
为了评估 ECM 成分和导管形态学, 对完整乳腺进行了分离。在这里, 我们使用雌性产妇小鼠缺乏 caveolin-1, 一个完整的膜蛋白已被连接到一个积极的乳腺肿瘤签名10,11,12, 并控制女性产妇 B6鼠.这些组织的组织学处理和染色允许对几种 ECM 蛋白的鉴定以及导管形态学的表征。
整体而言, 完整的乳腺隔离使研究人员有机会研究组织范围内的形态学或细胞变化, 以响应外源或内源性因素。这项技术的缺点与2维 (2D) 组织切片的分析相关联, 而不是3D 的角度, 这将使导管树的复杂形态学产生更完整的图像。鉴于乳腺内细胞细胞和细胞 ECM 相互作用的复杂性, 完整、完整的腺体分离有利于有效分析乳腺各区的导管形态学和蛋白质表达腺.
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种分离完整的小鼠乳腺的技术, 用于下游组织中 ECM 表达和导管形态学的组织学分析。关于导管形态学的分析, 这一方法能够快速研究基于染色组织学切片的导管结构。导管分析的其他方法依赖于染料的注入, 使导管树的可视化, 这些方法在技术上具有挑战性和耗时。
在乳腺癌中, ECM 被报道为异常。1,2,<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者想承认4月诡计和 Dr. 罗杰勃洛为协助与动物尸检和腺隔离, 分别。这项工作的经费是由费城骨科医学中心的长期老化疾病的支持。
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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