Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.
Abstract
O objetivo deste procedimento foi colher as glândulas mamárias abdominal de #4 dos ratos fêmeas nulíparas a fim de avaliar a expressão de ECM e arquitetura ductal. Aqui, um pequeno bolso abaixo da pele foi criado com uma tesoura de Mayo, permitindo a separação das glândulas dentro do tecido subcutâneo do peritônio subjacente. Visualização das glândulas foi auxiliada pelo uso de 3.5 lupas micro cirúrgicas x-R. O pelt foi invertido e preso de volta que permite identificação das almofadas de gordura mamárias do intactas. Cada uma das glândulas abdominais #4 sem rodeios foi dissecada deslizando a lâmina de bisturi lateralmente entre a camada subcutânea e as glândulas. Imediatamente após a colheita, as glândulas foram colocadas em neutro formol a 10% tamponada para processamento subsequente do tecido. Excisão da glândula inteira é vantajosa porque principalmente elimina o risco de excluir importantes interações de todo o tecido entre as células epiteliais Ductais e outras populações celulares microenvironmental que podem ser perdidas em uma biópsia parcial. Uma desvantagem da metodologia é o uso de seções seriais de tecidos fixos que limita as análises de expressão ductal de morfogênese e proteína para locais discretos dentro da glândula. Como tal, mudanças na expressão de arquitetura e proteína ductal em 3 dimensões (3D) não é prontamente obteníveis. Em geral, a técnica é aplicável a estudos exigindo toda intactas murino as glândulas mamárias para investigações a jusante, tais como câncer de peito ou morfogênese ductal do desenvolvimento.
Introduction
Câncer de mama é caracterizado por um grau substancial de tecido fibrose1,2,3,4. Conhecido como o ECM, esta entidade não celular encontra-se em diferentes graus em todos os tecidos e é composta principalmente de uma malha complexa de fibrillar e não-fibrillar colágenos, elastina e glicoproteínas, além de várias moléculas de sinalização que estão isolado nesta matriz. Sob condições homeostáticas, a deposição e a degradação de ECM é rigidamente controlado. 5 durante a tumorigênese da mama, o equilíbrio da deposição de ECM e degradação é interrompido. Como tal, tumores de mama têm sido relatados para expressar proteínas abundantes de ECM como colágenos, fibronectina e tenascin-C, entre outros. 6 a expressão anormal destas proteínas além de padrões de aumento de reticulação de matriz tem sido documentada para promover mama tumor progressão, metástase e terapia resistência1,3, 4,7,8,9.
Para avaliar a composição de ECM e morfologia ductal, realizou-se o isolamento de intactas as glândulas mamárias. Aqui, usamos fêmeas nulíparas camundongos deficientes para caveolin-1, uma proteína integral de membrana que tem sido associada a um agressivo tumor assinatura10,11,12de mama e controlar fêmeas nulíparas B6 ratos. Processamento histológico e coloração desses tecidos permitiu a identificação de várias proteínas de ECM, juntamente com a caracterização da morfologia ductal.
No geral, o isolamento de todo, intactos glândulas mamárias dá pesquisadores a oportunidade de investigar mudanças morfológicas ou celulares todo o tecido que ocorrem em resposta a fatores exógenos ou endógenos. Desvantagens da técnica são associadas com as análises de 2 secções de tecido de dimensão (2D) em oposição a uma perspectiva 3D, o que renderia uma imagem mais completa da morfologia complexa da árvore ductal. Dada a complexidade das interações célula-célula e célula-ECM que ocorrem na glândula mamária, o isolamento das glândulas inteira, intactas é vantajoso para analisar eficientemente ductal expressão morfologia e proteínas em várias regiões da mamária o murino glândula.
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Protocol
procedimentos envolvendo assuntos animais neste protocolo foram revistos e aprovados pelo Comité de utilização da faculdade de Medicina Osteopática de Filadélfia e institucional Cuidado Animal e todas as técnicas foram conduzidas sob rigorosas as diretrizes éticas.
1. amostra de aquisição e processamento de
- selecione assunto animal apropriado e coloque em uma câmara de 2 CO. Para este experimento, usar a semana de 8-10 velho fêmeas nulíparas B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6-j.
- Vez no fluxo de gás de 30-40%. Uma vez que o animal está visivelmente inconsciente após cerca de 2 min, abra a válvula de gás à pressão completa um adicional 5 min.
Nota: Confirme a morte de animais, observando sinais visíveis de respiração (por exemplo, o movimento do tórax) durante um período de 10 min após a cessação do CO 2 entrega. Se o animal ainda está vivo, podem ser colocado em câmara de CO 2. Deslocamento cervical também pode ser utilizado, embora não seja recomendável como sangue pode acumular-se em torno de glândulas mamárias, interferindo com a dissecção e resultados. - Após o sacrifício, pino carcaça em posição supina e saturar com etanol a 70%.
- Beliscar a pele logo acima do púbis usando fórceps e nick com pequena tesoura cirúrgica. Girando a tesoura, corte a pele ao longo da linha mediana ventral que movendo caudal ao craniana.
- Com uma tesoura maior ou com uma pinça hemostática, sem rodeios dissecar a fáscia subcutânea bilateralmente, com cuidado para não perfurar o peritoneu. Corte ao longo das margens horizontais em ambas as extremidades distais da incisão.
- Pino de peles retalhos abrir e borrife novamente com etanol a 70%.
Nota: Embora permitida a utilização de etanol a 70% melhor distinção visual entre a glândula e o tecido subcutâneo, tenha cuidado para evitar a secagem do tecido como resultado da utilização desta solução. Para evitar a secagem, retire a glândula em um período de tempo não deve exceder 4 min. Como uma alternativa ao etanol a 70%, o investigador também pode substituir uma reserva geral isolada, como a PBS 1x, para evitar a dessecação do tecido. - Localizar as glândulas mamárias de interesse, deslize uma lâmina de bisturi #4 ao longo do interior dos flaps de pele, corte da glândula mamária e adiposo cutâneo associado livre da derme.
Nota: 3.5 x lupas cirúrgicas micro pode ajudar na visualização mais fácil das glândulas. - Imediatamente submergir glândula recém isolada em tubo cônico contendo o volume de solução de 10:1-tecido de formol tamponado neutro a 10% por 24-48 h.
Nota: Dependendo da intenção do estudo, muitos fixadores alternativos podem ser usadas como paraformaldeído, etanol para estudos genômicos e comercialmente disponível RNA preservando buffers de. - Seguem protocolos institucionais para a incorporação de parafina, enviar amostras a um fornecedor para transformação, incorporação e corte/montagem de slide. Secção de tecidos em 5 µm.
Nota: Devido ao excesso adiposa circundante glândula, considere remover 100-200 µm de tecido antes do corte e coloração.
2. Coloração do tecido
- Immunohistochemistry
- slides de lugar para ser manchado no bloco térmico fixado em 58 ˚ c por 1h derreter parafina.
Cuidado: Derretimento da cera de parafina pode fugir de slide. Acompanhar de perto ou coloque compressa sob slide para capturar cera escoamento.
Nota: Este passo não é essencial e pode ser ignorado. Se os resultados não são tão esperado, adicionar este passo atrás pode melhorar os resultados.
Slides de incubar - em um slide jar contendo xileno 100% por 30 min, garantindo a completa submersão. Repetir uma vez.
Nota: neste ponto, inspeção visual deve ser realizada para garantir que cortes histologicos são livres de tecido adiposo e parafina. Se adicional de tecido adiposo ou cera é evidente, o slide deve ser re-submersa em xilol. Tenha cuidado para minimizar a exposição adicionada ao xileno, pois isso pode causar encolhimento do tecido. - Tecidos de hidratar num frasco slide contendo 100% de etanol de 10 min. repetem uma vez.
- Mover slides para um frasco de slide contendo etanol a 95% durante 10 min. repetem uma vez.
- Mover slides um slide frasco contendo 75% de etanol por 5 min.
- Mover slides um slide frasco contendo 50% de etanol por 5 min.
- Solução de citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0) em uma chapa quente ou um microondas de ferver e despeje em uma jarra de Coplin.
Cuidado: Cuidadosamente monitorar solução ao aquecimento e tomar cuidado para evitar ferver sobre. O recipiente será muito quente. Use proteção para evitar queimaduras. - Lentamente lugar slides em Coplin jar, garantindo a completa submersão e incubam a 100 ° C por 10 min recuperar os resumos. Retire e seque cuidadosamente slides.
- Desenhar uma barreira em torno do tecido com um marcador hidrofóbico. Adicionar suficiente bloqueador de enzima endógena (peróxido de hidrogênio e azida de sódio, disponível comercialmente) para cobrir o tecido e incubar durante 10 min.
- Slides de submergir em 1 fosfato x tampão salino (PBS) durante 10 min.
- Adicionar soro suficiente burro de 10% em PBS 1x para cobrir o tecido e incubar por 1h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
Nota: O experimento pode ser pausado aqui armazenando os slides na câmara umidificada a 4 ° C durante a noite. Enquanto o soro burro foi encontrado para produzir óptimos resultados de coloração, o investigador pode desejar testar diferentes soros como albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra ou soro de cavalo para determinar os resultados ideais. Se usando BSA, o investigador deve preparar este fresco antes da utilização. - Decantar excesso bloqueador de slides e adicione anticorpo primário corretamente diluído em 1% de soro diretamente para slides, garantindo que o tecido é uniformemente coberto em solução. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
Nota: Este passo pode ser continuado por períodos mais longos de tempo com câmara húmida armazenada em 4 ° C. Certifique-se de incluir slides adequado controlo negativo (por exemplo, um slide com nenhum anticorpo primário, conhecido antígeno negativo tecido, etc.) neste passo. - Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH 2 O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.
- Decantar excesso PBS e adicionar suficiente rótulo de peroxidase de rábano para cobrir o tecido e incube por 30 min em uma câmara umidificada.
Nota: Neste passo, o investigador poderá proceder à fluorescente coloração usando anticorpos secundarios conjugados fluorescente. Se isto for desejado, os próximos passos descritos devem ser modificados em conformidade. - Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH 2 O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.
- Fazer diaminobenzidina (DAB) mais solução de cromogénio, de acordo com a proporção sugerida do fabricante e misture por vórtice.
Nota: Muitos kits pré-fabricados são comercialmente disponíveis além de um usado neste protocolo. - Decantar excesso de buffer de slides e adicione 2-3 gotas (10-50 µ l) de cromogénio mancha diretamente para os tecidos e incube durante 5 min em câmara úmida. Lavar cuidadosamente slides por fluxo cerca de 1 mL diH, 2 O sobre tecido.
Cuidado: DAB-cromogénio é altamente tóxico. Evitar contato direto da mancha com fluxo de pele e cobrar fora de resíduos perigosos.
- slides de lugar para ser manchado no bloco térmico fixado em 58 ˚ c por 1h derreter parafina.
- Hematoxilina e eosina (H & E)
- após o enxágue final após incubação de cromogénio, submergir slides em hematoxilina de Harris para slides de 2 a 2,5 min. enxaguar delicadamente sob água da torneira por 1-2 min.
Nota: tenha cuidado para evitar jacto directo de água sobre tecidos. - Submergir desliza para 2-3 s em solução de diferenciação (0,25 mL de ácido clorídrico em 100 mL de etanol a 70%). Enxágue desliza suavemente sob água da torneira para cerca de 1-2 min.
- Submergir slides em agente azul (4,5 mg de carbonato de cálcio em 100 mL de água de torneira, pH ajustado para 9,4) para 60 slides de enxaguamento s. em etanol a 95% por 30 s.
- Slides de submergir em alcoólica eosina Y para 2-3 min.
- Desidratar o tecido em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.
- Desidratando tecido em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.
- Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela.
Nota: Se um método de coloração diferente foi eleito, uma mídia de montagem diferente poderá ser necessária. Por exemplo, se o investigador escolheu um anticorpo secundário conjugado fluorescente, um monte de aquoso seria mais ideal. - Permitir slides definir a noite à temperatura ambiente.
- após o enxágue final após incubação de cromogénio, submergir slides em hematoxilina de Harris para slides de 2 a 2,5 min. enxaguar delicadamente sob água da torneira por 1-2 min.
- Coloração de Picrosirius vermelho (PSR)
- selecione slides para ser manchado e seguir o protocolo de imuno-histoquímica através do passo 6 (embeber de 50% de etanol).
- Slides de submergir no PSR macular durante 1 h.
- Submergir slides em 0,5% de ácido acético para s 1-2, duas vezes para diferenciar mancha.
- Desidratar tecidos em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.
- Desidratando tecidos em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.
- Clara slides submergindo brevemente em 100% de xilol para sobre 3-4 s.
- Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela.
3. Análise da amostra
- Análise Ductal
- selecione lâminas coradas para α-SMA. Usando um microscópio óptico equipado com um câmera montada objetivo, coletar imagens representativas na ampliação de 20 X.
- Usando o ImageJ (NIH), distinguir e contar os dutos em cada imagem. Estas podem ser enumeradas manualmente ou se pode atribuir uma pontuação numérica às condutas individuais. Para atribuir uma pontuação numérica, abra o ImageJ e selecione Plugins. Em seguida selecione a analisar e escolher o contador de célula do menu drop-down. Clique em Initialize então destacar tipo 1 para começar a etiquetar dutos. Ao terminar, selecione resultados para exibir a contagem ductal.
Nota: tenha cuidado para verificar estruturas são ductal e não vascular. - Em ' conjunto de medição ' opções, verifique ' perímetro ' e ' área ".
- Usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhar uma linha ao redor de cada duto no compartimento do mioepiteliais (visibilidade auxiliada pela mancha de α-SMA). Selecione ' medida ' e gravar o perímetro e área.
- Novamente usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhe uma linha ao longo da parte apical do epitélio ductal no interior do lúmen. Selecione ' medida ' e gravar o perímetro e área.
- Subtrair do perímetro do compartimento luminal do perímetro do compartimento mioepiteliais para obter a circunferência do epitélio ductal. Subtrair da área do compartimento luminal da área do compartimento para obter a área do epitélio ductal mioepiteliais.
- Análise imuno-histoquímica
- Upload de imagens brightfield para um software analítico, como o ImageJ ou FIJI Suite.
Nota: Este protocolo descreve as etapas para coloração análise usando o ImageJ e o plugin de ferramentas IHC. - Abrir o Toolbox de IHC no menu Plugin. Na " selecionar modelo " caixa de combinação que abre, selecione o apropriado mancha (ou seja, H-DAB, PSR, etc.). Selecione o " cor " opção para isolar a mancha. Isto irá abrir uma janela de resultado.
Nota: Este método é apropriado se uma proteína de interesse situa-se nos espaços extracelulares ou citosol, ou está vinculada a membrana plasmática. Se a proteína de interesse é nuclear, selecionando " núcleos " solicitará o plugin para analisar a imagem para núcleos positivamente manchadas. - Usar o deslize de seletor de cor para garantir um isolamento adequado da mancha sem fundo de inclusão ou exclusão de mancha excessiva.
Nota: Se o modo automático é incapaz de detectar a mancha ou não resulte em imagens aceitáveis, desenhe um quadrado de região de interesse (ROI) sobre um identificados manchado a região. Na janela de ferramentas de IHC, selecione " trem " para direcionar o plugin para o destino apropriado. - Converter a imagem de 16 bits. Vá para imagem → tipo → 16bit.
- Limite a imagem. Vá para imagem → ajustar → Auto limiar.
- Definir a escala de medição de imagem desenhando uma linha ROI directamente por cima da barra de escala da imagem, em seguida, atribuir o comprimento. Para definir a barra de escala, vá para Analyze → definir escala. O número de pixels pela unidade desejada de comprimento (por exemplo, 120 pixels por 50 µm) de entrada.
- Medir a área resultante e quer dizer valor cinza. Vá para Analyze → definir medidas e recolher a medição clicando Analyze → medida.
- Upload de imagens brightfield para um software analítico, como o ImageJ ou FIJI Suite.
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Representative Results
Ratos fêmeas têm 5 pares de glândulas mamárias. Especificamente, há um par de glândulas do colo do útero (#1), dois pares de glândulas torácicas (#2 e #3), um par de glândulas abdominais (#4) e 1 par de glândulas inguinais (#5) (Figura 1A). Aqui, isolamos as glândulas #4 como eles são facilmente identificáveis. Em algumas circunstâncias, ambos #4 e #5 glândulas foram isoladas juntos como distinção entre os dois era difícil. Para isolar intactos #4 abdominal, glândulas mamárias, de peles foi fixado e cuidadosamente separada do peritônio subjacente, revelando a localização das glândulas #4, indicado por uma seta (Figura 1B). #4 glândulas foram cuidadosamente extirpadas e inspecionadas para a presença de qualquer tecido subcutâneo ou muscular residual. Embora estes não eram identificáveis em nossas glândulas isoladas (Figura 1C), notamos substancialmente mais tecido subcutâneo em glândulas manchadas de fibronectina dos blocos de tecido em que o tecido não tinha sido removido antes da corte (por exemplo, superficial) (Figura 1D) contra as glândulas em que 100-200 µm do tecido do tecido do bloco tinha sido removido antes da corte (por exemplo, profunda) (Figura 1E). Para obter uma melhor compreensão da fibrose do tecido na glândula mamária em resposta a fatores exógenos ou endógenos, o investigador pode desejar comparar fibrose em superficial contra cortes profundos da glândula. Para outras análises, pode ser vantajoso para o investigador à seção do bloco de tecido ao meio antes de prosseguir para corte de tecido e coloração se substancial subcutânea e/ou tecido muscular está presente após dissecação da glândula.
Após o isolamento, as glândulas foram fixadas em formol tamponado a 10% neutro, processadas e seccionadas para coloração. As etapas usadas para analisar a expressão de colágeno, além de outras proteínas de interesse são representadas na Figura 2A. Amostras representativas do colágeno de proteínas ECM, fibronectina e tenascin-C são mostradas na Figura 2B. Flechas em cada uma das imagens mostram a presença de dutos nestes tecidos (Figura 2B).
Para quantificar as características morfológicas das condutas, é importante tratar os cortes histológicos com cuidado como manuseio inadequado pode resultar em tecidos danificados e condutas que não são mensuráveis. Exemplos de manipulação imprópria podem estar executando buffers ou água diretamente sobre os tecidos, usando amortecedores a uma temperatura inadequada ou deixando amostras de tecido em buffers duras como citrato de sódio e ácido acético por um longo período de tempo do que o especificado no protocolo. Um exemplo de uma secção de tecido em que o tecido dano ocorreu é mostrado na Figura 3. Aqui, extensos danos no tecido podem ser facilmente observado como pontos de ruptura nos ductos(Figura 3). Uma seção como esta não pode ser usada para análises de estruturas Ductais. Um exemplo de uma amostra de tecido intacto, onde as condutas são mensuráveis e quantificáveis é mostrado na Figura 3B. Aqui, os dutos não são apenas caracterizada por estroma circundante manchadas de fibronectina, mas também são caracterizadas pela presença de uma densa população de células epiteliais que revestem o lúmen dos ductos (Figura 3B). É importante notar que durante o desenvolvimento, a glândula mamária do mouse contém um único ducto no nascimento do qual brotam ramos secundários laterais, formando uma árvore ductal mais complicada que sofre uma série de ramificação e regressão com cada ciclo estral 13. embora não tomámos em consideração o ciclo estral dos animais nesses experimentos, o investigador pode desejar fazê-lo a fim de obter informações sobre números Ductais independentes do ciclo estral. O investigador de um protocolo é referido por Caligioni14 , em que fase do ciclo estral pode ser visivelmente determinado. No que respeita à quantificação dos dutos, a presença de várias estruturas Ductais nestes cortes histológicos não é indicativa de vários dutos exclusivos, mas é bastante indicativa de uma árvore ductal mais desenvolvida, resultantes de consequência ductal. Para enumerar os dutos, um pode usar um software de análise de imagem tais como ImageJ (NIH) para atribuir um número a condutas individuais em uma seção de tecido. O investigador poderá enumerar condutas como alterações nos números Ductais, que podem ser indicativos de anormalidades do desenvolvimento ou de uma condição patológica. Em relação ao nosso estudo, podemos acreditar que o aumento do número de dutos, um resultado de consequência ductal, está relacionado à perda de caveolin-1, que pode conduzir a aberrante expressão de fatores de crescimento tais como fator de crescimento de insulina 1 (IGF-1), um conhecido mediador do mouse ductal crescimento 15.
Além da presença dos ductos intactos, vários dutos contêm ramos, indicados pelas setas em uma seção de fibronectina-manchado (Figura 3C). Para efeitos desta análise, estes ramos Ductais não devem ser considerados como uma estrutura ductal separada. Durante a avaliação e medição de dutos, é importante distinguir condutas de estruturas vasculares. Estruturas vasculares podem não apenas ser identificadas pela presença de uma monocamada endotelial do lúmen do forro, mas também pela presença de indicativo de um nuclear, eosinofílica estruturas de glóbulos vermelhos (RBC) dentro do lúmen (Figura 3-D). Embora a presença de estruturas eosinofílicas dentro lúmens indica RBC e sugere a vasculatura, o deslocamento de RBC durante a coleta de glândula ao longo de cortes de tecido é possível. É aconselhável confirmar estruturas vasculares usando o marcador endotelial CD31. Um exemplo de uma seção histológica manchado com CD31 é mostrado (Figura 3-D). A fim de quantificar a área e circunferência ductal, vetores no ImageJ (NIH) podem ser atribuídos a delinear a fronteira mioepiteliais (circunferência) e a borda luminal na secção de tecido α-SMA-manchado. Α-SMA, um marcador de células musculares lisas, utilizou-se como mancha das células mioepiteliais que linha de dutos. A imagem mostrada, a linha vermelha mostra a fronteira mioepiteliais enquanto a linha azul mostra a borda luminal (Figura 3E). A região entre os compartimentos do estroma e luminal, mostrado no esquema, é a área ocupada pelo total do estroma tecido mais as células epiteliais Ductais (Figura 3E).
Figura 1 : Isolamento de todo, intactos de glândulas mamárias para análise histológica. (A) após o sacrifício de animais, o pelt foi removido cuidadosamente e preso de volta para expor as glândulas mamárias, localizadas entre a derme e peritônio. O diagrama mostra as posições relativas da cervical (#1), torácica (# s 2 e 3), (#4) abdominal e inguinal (#5) glândulas. (B) o #4 glândulas abdominais, mostrado no animal dissecado e indicado pelas setas vermelhas, foram isoladas. (C) exemplo representativo das glândulas abdominais #4, isolado de um rato de B6 fêmea nulíparas. (D) tecido subcutâneo substancial das glândulas em que tecido não tinha sido removido do bloco de parafina antes da corte (por exemplo, superficial) era aparente após a coloração para a ECM proteína fibronectina. (E) Considerably menos tecido subcutâneo e fibronectina mais manchado do estroma tecido foram observados de glândulas em que 100-200 µm de tecido tinha foi retirado do bloco de parafina antes da corte (por exemplo, profundo). Histológicos são de amostras representativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: histológicos de processamento e coloração. (A) representação esquemática dos passos utilizados para o processamento histológico. Uma série diferente de passos foi utilizada para análises de expressão de colágeno. (B) imagens representativas do colágeno de proteínas ECM, fibronectina e tenascin-C das glândulas de fêmeas nulíparas caveolin-1 animais deficientes. Setas para colágeno, fibronectina e tenascin-C indicam o estroma denso revestimento dos dutos. PSR: Picrosirius vermelho. FN: fibronectina. 10-c: tenascin-C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análises de arquitetura ductal. (A) uma fibronectina manchada seção ilustra dano tecidual extensa. Isto é marcado pela presença de quebras nas estruturas Ductais (setas). (B) uma fibronectina manchada seção ilustra a presença de estruturas Ductais intactas, marcadas pela presença de lumens, rodeado por uma ou mais camadas de células epiteliais e uma estroma circundante. As setas indicam estruturas individuais Ductais. (C) uma imagem manchada de fibronectina destaca a presença de ramos Ductais, que são indicadas com setas. Note a continuidade destes com o lúmen de maior estrutura ductal. (D) estruturas vasculares (setas vermelhas), caracterizadas por uma única camada de células e a presença de um-nucleated eosinofílicas estruturas indicativas das células vermelhas do sangue, são frequentemente observadas em proximidade com os dutos (seta preta). Ampliação baixa é mostrada na imagem à esquerda e uma imagem de alta ampliação correspondente é mostrada à direita. Estas imagens foram coradas com H & E e tenascin-C. CD31 foi usado como um marcador positivo para as células endoteliais que revestem as estruturas vasculares. É mostrado uma grande estrutura vascular na qual CD31 células positivas são visíveis forro do lúmen do vaso. Ampliação baixa é mostrada na imagem à esquerda e uma imagem de alta ampliação correspondente é mostrada à direita. (E) circunferência Ductal foi medida em uma imagem de α-SMA-manchado usando um vetor (mostrado em vermelho) para delinear o compartimento mioepiteliais enquanto área ductal foi medida utilizando um vetor (mostrado em azul) para delinear o compartimento luminal. A região entre os compartimentos do estroma e luminal foi classificada como área ductal. Barra de escala = 50 µm. esquema de uma estrutura ductal, destacando as áreas de onde foram medidos o perímetro e a área. 10-c: tenascin-C. A seção histológica em figura E foi modificada de: C Thompson et al . 16 por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No artigo, descrevemos uma técnica para isolar as glândulas mamárias rato intacta para análise histológica a jusante de expressão ECM e morfologia ductal. No que diz respeito a análises da morfologia ductal, esta metodologia permite a rápida investigação de arquitetura ductal baseada fora de cortes histológicos corados. Outros métodos de análises Ductais dependem de injeções de corantes para permitir a visualização da árvore ductal, métodos que podem ser tecnicamente desafiador e demorado.
No câncer de mama, o ECM tem sido relatado para ser anormal. 1 , 2 , 6 , 9 especificamente, mudanças nos padrões de abundância e/ou cross-linking de ECM foram relatadas para influenciar o tumor progressão, metástase e terapia resistência3,4,6,7 ,8,9. Além disso, as alterações no meio de ECM também foram relatadas para alterar a célula epitelial ductal morfologia e proliferação17, podendo levar a uma situação que favorece a iniciação do tumor. Enquanto utilizamos um modelo animal de caveolin-1 deficiente para avaliar alterações na expressão de ECM e morfologia ductal após perda de caveolin-1, um pode aplicar esta metodologia em qualquer modelo do rato. Para avaliar os padrões de expressão de ECM e arquitetura ductal, descrevemos uma técnica para isolar toda, intactas as glândulas mamárias para análise histológica a jusante. Resultados desta metodologia robustas análises de expressão de ECM e morfologia glandular. Encontramos essa expressão ECM analisando, fibronectina, especialmente, das seções em que 100-200 µm de tecido superficial foi removido antes da corte e coloração rendeu uma imagem mais completa da fibrose glandular. Além disso, nós encontramos que utilizar soro burro em oposição a BSA produziu melhores amostras histológicas de qualidade em que mancha não específica foi substancialmente reduzida.
Para análises de arquitetura ductal, é importante o uso de seções em que os tecidos estão intactos e contenham dutos na qual pontos de ruptura, um resultado de manipulação inadequada de tecido em corte, não são evidentes. Além disso, é importante distinguir corretamente Ductais ramos, outro parâmetro que um investigador pode querer medir e estruturas vasculares que podem ser facilmente identificadas por seu endotélio monocamada e eosinofílicas estruturas dentro do lúmen além de coloração com CD31. Enquanto condutas foram observadas nas seções manchadas de várias proteínas de ECM, o mioepiteliais marcador αSMA e H & E counterstaining, que destacou o componente celular dos ductos, enumeração das condutas e qualquer associados ramos é alcançável com H & E cortes de tecido corados sozinho. Para análises mais detalhadas da morfogênese ductal ou análises da presença de lesões pré-neoplásicas e/ou neoplásicas, um investigador pode desejar utilizar imagem latente confocal para avaliar tecidos vivos ex-vivo . Neste caso, a mesma técnica em que são extirpadas toda glândulas pode ser aplicada com a fixação e tecido eliminadas de etapas de processamento.
Passos críticos neste protocolo incluem o uso de lupas cirúrgicas micro, que não só permitiu a identificação precisa das glândulas abdominais #4, mas além disso, permitida a dissecação da glândula da derme sobrejacente e peritônio subjacente. A exclusão dos músculos e tecidos subcutâneos substanciais reduzida interferência adiposo associado na mancha e histologia. Além disso, para melhor identificar alterações de expressão ECM na glândula, achamos útil para remover 100-200 µm do bloco de tecido, que ajudou a eliminar resíduos de tecido adiposo. Embora toda glândula mamária isolamento fornece informações sobre o tecido grande mudanças na expressão de proteínas do estroma e morfogênese ductal, a técnica descrita é limitada à análise das seções seriais de fixo, parafina incorporado os tecidos. Para estabelecer o grau ao qual na ramificação ductal ocorreram alterações, imagem latente de toda montagem dos tecidos de ex-vivo ao vivo, seria necessário. Aqui, um investigador pode usar Cre-Lox de design conjugações personalizado, condicional repórter fluorescente para estudar as interações proteína específica de glândula ou utilizar um corante para iluminar a árvore ductal antes da imagem18. Além disso, ainda mais análise de proteínas de interesse na totalidade da glândula seria necessário o uso de borrão ocidental ou espectrometria de massa ou outras técnicas de alto rendimento como cross-linking imunoprecipitação (CLIP) ou cromatina imunoprecipitação (ChIP). Nesta instância, glândulas toda iria ser dissecadas, seccionado em pedaços pequenos e transformados em conformidade para as análises a jusante. Além disso, um pode igualmente usar fluorescente de imagem em cortes de tecido. Esta técnica seria o ideal para a análise de várias proteínas e localização co da expressão da proteína no tecido mesmo.
Em resumo, nós descrevemos uma técnica que oferece o isolamento rápido de glândulas mamárias de todo, intactos e fornece mais detalhes sobre o processamento histológico e análises Ductais. Futuras aplicações desta técnica poderiam investigar a expressão ECM e associado as alterações na morfologia ductal no tumor-rolamento animais. Além disso, as análises de orientação do colágeno e diâmetro da fibra, informações que podem ser úteis para a análise de densidade do tecido, podem ser efectuadas no PSR manchado seções.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer abril Wiles e Dr. Roger Broderson para obter assistência com animal necropsia e isolamento de glândula, respectivamente. Financiamento para este trabalho foi apoiado pelo Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers para doenças crônicas do envelhecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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