Summary
כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.
Abstract
המטרה של הליך זה היה כדי לקצור #4 בטן בלוטות מוגדלות של עכברים nulliparous הנשי כדי להעריך ביטוי ECM ואדריכלות ductal. . הנה, כיס קטן מתחת לעור נוצר באמצעות מספריים מאיו, ומאפשר פרידתה של הבלוטות בתוך רקמת השומן התת עורית הצפק המשמש כבסיס. ויזואליזציה של הבלוטות נעזרה השימוש 3.5 x-R זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי. הפרווה היה. הפוך, נצמיד המאפשר זיהוי של הידיות שומן החלב ללא פגע. אחד של בלוטות בטן #4 היה בוטה מבותרים על-ידי הזזה הלהב האזמל רוחבית בין השכבה התת עורית הבלוטות. מיד לאחר הקציר, בלוטות הונחו בפורמלין במאגר נייטרלי 10% עבור עיבוד רקמות עוקבות. כריתה של בלוטת כולו הוא יתרון, כי זה בעיקר מבטלת את הסיכון של אי-כלילת חשוב רקמות ברוחב אינטראקציה בין תאים אפיתל ductal אוכלוסיות אחרות microenvironmental הסלולר שלא יכול להיות בביופסיה חלקית. חסרון אחד של המתודולוגיה הוא השימוש סעיפים טורי רקמות קבוע אשר מגביל את ניתוח של הביטוי מורפוגנזה וחלבון ductal במיקומים נפרדים בתוך בלוטת. ככזה, שינויים בביטוי חלבונים ואדריכלות ductal 3 מימד (3D) אינה השגה בקלות. בסך הכל, הטכניקה ישימה ללימודים הדורשים עטין מאתר שלם כל החקירות במורד הזרם כגון התפתחותית ductal מורפוגנזה או השד סרטן.
Introduction
סרטן השד מאופיין על ידי מידה ניכרת של רקמות פיברוזיס1,2,3,4. מכונה ECM, הישות-סלולר זו הוא נמצא בדרגות ברקמות כל, מורכבת בעיקר meshwork מורכבים של collagens fibrillar ו- fibrillar, אלסטין glycoproteins בנוסף מולקולות איתות שונים כי הם רע מטריצה זו. בתנאים homeostatic, התצהיר והשפלות של ECM מפוקחת. 5 במהלך tumorigenesis השד, האיזון של התצהיר ECM והשפלה משובשת. ככזה, גידולים בשד דווחו לבטא שופע ECM חלבונים כגון collagens, fibronectin, tenascin-C בין השאר. 6 הביטוי לא תקין של חלבונים אלה בנוסף דפוסים מוגברת של מטריקס crosslinking תועד כדי לקדם את השד הגידול התקדמות, גרורות, טיפול ההתנגדות1,3, 4,-7,-8,-9.
כדי להעריך הרכב ECM ו מורפולוגיה ductal, בוצע בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע. כאן, אנחנו המשמש עכברים nulliparous נקבה לקויה caveolin-1, חלבון ממברנלי אינטגרלי אשר נקשר אגרסיבי השד הגידול החתימה10,11,12, שליטה נשית B6 nulliparous עכברים. צביעה של רקמות אלה ועיבוד היסטולוגית מותר זיהוי חלבונים שונים ECM עם אפיון ductal מורפולוגיה.
בסך הכל, בידודו של בלוטות מוגדלות שלם, שלם נותן חוקרים ההזדמנות לחקור את רקמת מורפולוגיים או הסלולר שינויים המתרחשים כתגובה גורמים אקסוגניים או אנדוגני. החסרונות של הטכניקה משויכות ניתוחים של 2 סעיפים רקמות מימד (2D) לעומת מבט תלת-ממד, אשר יניב תמונה שלמה יותר של המורפולוגיה מורכבים של העץ ductal. לאור המורכבות של אינטראקציות תא התא, התא-ECM המתרחשים בבלוטת החלב, בידודו של בלוטות שלם, תקין יש יתרון לניתוח ביעילות ductal מורפולוגיה וחלבונים ביטוי באזורים שונים מאתר החלב בלוטת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים פרוטוקול זה היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של פילדלפיה אוסטאופתי לרפואה ואת כל הטכניקות נערכו תחת קפדנית מנחים.
1. רכש דגימת ועיבוד
- בחר נושא בעלי חיים המתאימים ומקום לתא 2 CO. עבור ניסוי זה, השתמש בשבוע 8-10 הישן B6 nulliparous הנשי. Cg-Cav1tmMIs/J ו- C57BI/6J.
- הפעל זרימת הגז ל- 30-40%. לאחר החיה בעליל הכרה לאחר כ- 2 דקות, לפתוח את השסתום גז בלחץ מלא עבור 5 דק נוספות
הערה: אשר המוות בבעלי חיים על ידי התבוננות סימנים גלויים של נשימה (למשל תנועת החזה) לתקופה של 10 דקות לאחר הפסקת משלוח 2 CO. אם החיה עדיין בחיים, אפשר למקם אותו בחזרה בבית הבליעה 2 CO. נקע בצוואר הרחם עשוי לשמש גם למרות שזה לא מומלץ כי דם עלולים להצטבר סביב בלוטות החלב מתנגש עם דיסקציה של תוצאות. - בעקבות הקרבה, להצמיד את השלד במצב פרקדן, עיתוני עם אתנול 70%-
- לצבוט את פלט מעל לחיקו באמצעות מלקחיים, ניק עם מספריים כירורגיים קטנים. סיבוב את המספריים, לחתוך הפרווה לאורך הקו האמצעי הגחון נע סימטרית הגולגולת.
- עם מספריים גדולים יותר או עוצר דימום, בוטה לנתח fascia תת עורית דו צדדיים, באמצעות התראה לא ל פנצ׳ר של הצפק. חתך לאורך השוליים האופקיים בשני קצותיו דיסטלי של החתך.
- Pin הפרווה מדפים פתח, לרסס שוב עם אתנול 70%-
הערה: למרות השימוש של 70% אתנול מותרת יותר ויזואלי ההבחנה בין בלוטת הרקמה התת עורית שמסביב, להיות זהירים כדי למנוע ייבוש של הרקמה כתוצאה של פתרון זה. כדי למנוע ייבוש, להסיר את בלוטת בתוך מסגרת זמן שלא יעלה על 4 דקות. כחלופה 70% אתנול, החוקר גם להחליף מאגר ולבודד כלליות, כגון 1 x PBS, כדי להימנע לייבוש רקמות. - באיתור בלוטות החלב של עניין, שקופית להב סכין #4 לאורך החלק הפנימי של המשק פלט, חותכים את בלוטת חלב ואת עורית של אדיפוז המשויך חינם של הדרמיס.
הערה: 3.5 x זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי עשויים לסייע ויזואליזציה קל יותר של הבלוטות. - מיד להטביע בלוטת לאחרונה מבודד צינור חרוטי המכילים 10:1 פתרון-רקמת אחסון של 10% פורמלין במאגר נייטרלי במשך 24-48 ה
הערה: הכוונה של המחקר, כתות ומייצבים אלטרנטיביים רבים עשוי לשמש בהתאם כגון paraformaldehyde, אתנול גנומית מחקרים, RNA זמינים מסחרית שמירה על מאגרי. - בצע פרוטוקולים מוסדיים להטבעת פרפין, לשלוח דוגמאות ליצרן לעיבוד, הטבעה, ושקופית חותך/הרכבה. בסעיף רקמות-5 מיקרומטר.
הערה: עקב עודף אדיפוז בלוטת שמסביב, לשקול הסרת מיקרומטר 100-200 של רקמות לפני חלוקתה, מכתים.
2. רקמת Staining
- אימונוהיסטוכימיה
- המקום שקופיות כדי להיות מוכתם בבלוק חום שוכן בגובה 58 הלעפה תרוטרפמט עבור h 1 להמיס פרפין.
התראה: התכה פרפין עשויה לפעול מחוץ לשקופית. לפקח מקרוב או להציב מנגב תחת שקופיות כדי ללכוד נגר שעווה.
הערה: שלב זה לא הכרחי, אולי ניתן לדלג. ואם התוצאות לא כמצופה, הוספת הזה צעד אחורה עשוי לשפר את התוצאות. - Incubate השקופיות שקופית ג'אר קסילן המכיל 100% למשך 30 דקות הבטחת צלילה מלאה. אני חוזר פעם.
הערה: בשלב זה, בדיקה ויזואלית צריכה להתבצע כדי להבטיח כי קטעי רקמה חופשית של רקמת שומן, פרפין. אם רקמת שומן נוספים או שעווה ניכרת, השקופית צריך להיות מחדש שקועים קסילן. שימוש באזהרה כדי למזער חשיפה נוספת קסילן כמו זה יכול לגרום התכווצות של הרקמות. - נוזלים ברקמות בצנצנת השקופית המכילה 100% אתנול במשך 10 דקות חוזר פעם.
- להעביר את השקופיות צנצנת השקופית שמכילה אתנול 95% במשך 10 דקות חוזר פעם.
- להעביר את השקופיות שקופיות צנצנת המכילה 75% אתנול עבור 5 דק.
- להעביר את השקופיות שקופיות צנצנת המכילה 50% אתנול עבור 5 דק.
- להרתיח הפתרון סודיום ציטרט 10 מ מ (pH 6.0) צלחת חמה או מיקרוגל ויוצקים לתוך צנצנת Coplin.
התראה: לפקח על פתרון תוך חימום ובזהירות לטפל כדי למנוע לרתיחה מעל. מיכל יהיה חם מאוד. השימוש הגנה כדי למנוע כוויות. - לאט המקום מגלשות לתוך Coplin צנצנת, הבטחת צלילה מלא, ו דגירה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחזר epitopes. הסר ויבשה בקפידה שקופיות.
- צייר מחסום מסביב רקמות עם סמן הידרופובי. הוסף מספיק אנזים אנדוגני חוסמי (מימן על-חמצני, אזיד הנתרן, זמינים מסחרית) לכסות את רקמות, תקופת דגירה של 10 דקות
- השקופיות Submerge פוספט x 1 buffered תמיסת מלח (PBS) במשך 10 דקות
- להוסיף סרום מספיק חמור 10% ב- PBS 1 x כדי לכסות את רקמת תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified.
הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון השקופיות בבית הבליעה humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בזמן חמור בסרום נמצאה להניב תוצאות אופטימליות מוכתמים, ייתכן החוקר רוצה לבדוק סרה שונים כגון אלבומין שור (BSA), סרום עז או סרום סוס כדי לקבוע תוצאות אופטימליות. אם משתמש BSA, החוקר צריך להכין טרי זה לפני השימוש. - Decant חוסם עודף משקופיות ולהוסיף נוגדן ראשוני כראוי מדולל בנסיוב 1% ישירות על השקופיות להבטיח כי הרקמה באופן שווה מכוסה פתרון. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified.
הערה: שלב זה עשוי להיות המשך עבור משכי זמן ארוכים עם לח תא המאוחסנים ב-4 ° C. הקפידו לכלול שקופיות שליטה שלילי (כגון שקופית עם אין נוגדן ראשוני, ידוע רקמות אנטיגן-שלילי, וכו ') בשלב זה. - לשטוף את השקופיות מאת זורם בערך 1 מ"ל של לשכפל 2 O על רקמות ובזהירות דגירה בשינוי 1 ל- PBS x 1 עבור 5 דק.
- Decant PBS עודף ולהוסיף תווית peroxidase מספיק חזרת כדי לכסות את רקמת תקופת דגירה של 30 דקות בתוך תא humidified.
הערה: בשלב זה, החוקר הרוצים להמשיך פלורסנט מכתים באמצעות נוגדנים משניים fluorescently מצומדת. אם זה רצוי, השלבים הבאים תיאר צריך להיות שונה בהתאם. - לשטוף את השקופיות מאת זורם בערך 1 מ"ל של לשכפל 2 O על רקמות ובזהירות דגירה בשינוי 1 ל- PBS x 1 עבור 5 דק.
- להפוך diaminobenzidine (DAB) פלוס chromogen פתרון על פי היחס המוצע היצרן ומערבבים על ידי מערבולת.
הערה: הרבה ערכות מוכנות מראש הם זמינים מסחרית מלבד שימוש בפרוטוקול זה. - Decant עודף מאגר משקופיות ולהוסיף 2-3 טיפות (10-50 µL) של chromogen כתם ישירות לרקמות ו תקופת דגירה של 5 דקות בחדר לחים. בזהירות משתלטת השקופיות על-ידי זורמים כ 1 mL לשכפל 2 O רקמות.
התראה: DAB-chromogen הוא רעיל מאוד. להימנע ממגע ישיר של כתם בתזרים העור ומסייעים לאסוף את-פסולת מסוכנת.
- המקום שקופיות כדי להיות מוכתם בבלוק חום שוכן בגובה 58 הלעפה תרוטרפמט עבור h 1 להמיס פרפין.
- Hematoxylin ואאוזין (H & E)
- לאחר השטיפה הסופית לאחר דגירה chromogen, להטביע שקופיות ב hematoxylin האריס עבור 2-2.5 דקות שקופיות יש לשטוף בעדינות תחת ברז מים במשך 1-2 דקות
הערה: לטפל כדי למנוע סילון ישירה של מים על גבי רקמות. - Submerge שקופיות עבור 2-3 s בפתרון בידול (0.25 מ"ל חומצה הידרוכלורית 100 מ של 70% אתנול). לשטוף את השקופיות בעדינות תחת ברז מים במשך כ- 1-2 דקות
- להטביע שקופיות בסוכן כחול (4.5 מ"ג סידן פחמתי ב- 100 מ ל מי ברז, pH להתאים ל- 9.4) עבור שקופיות שטיפה ס' 60 ב 95% אתנול ל 30 ס
- השקופיות Submerge אלכוהוליים אאוזין Y עבור 2-3 דקות
- מייבשים רקמות 2 שינויים של אתנול 95% 1 דקות.
- רקמת Dehydrate 1 שינוי של אתנול 100% עבור מינימלית 1
- יבש בזהירות שקופיות עם מגבון נטולת מוך. החלת טיפה 1 (כ 100-200 µL) של סינתטיים, הלא-מימית, שרף המבוססת על טעינת מדיה שקופית ולהחיל coverslip.
הערה: אם נבחר מכתימים שיטה שונה, באמצעי התקשורת הרכבה שונים עשוי להידרש. למשל, אם החוקר בוחר נוגדנים משניים מצומדת פלורסנט, הר מימית יהיה יותר אידיאלי. - לאפשר שקופיות להגדיר ללילה בטמפרטורת החדר.
- לאחר השטיפה הסופית לאחר דגירה chromogen, להטביע שקופיות ב hematoxylin האריס עבור 2-2.5 דקות שקופיות יש לשטוף בעדינות תחת ברז מים במשך 1-2 דקות
- Staining Picrosirius אדום (הפי)
- בחר שקופיות כדי להיות מוכתם ופעל אימונוהיסטוכימיה פרוטוקול דרך שלב 6 (50% אתנול להשרות).
- השקופיות Submerge הפי כתם על ה' 1
- להטביע שקופיות ב- 0.5% חומצה אצטית עבור s 1-2, פעמיים כדי להבדיל בין הכתם.
- מייבשים רקמות 2 שינויים של אתנול 95% 1 דקות.
- רקמות Dehydrate 1 שינוי של אתנול 100% עבור מינימלית 1
- ברור שקופיות על ידי בקצרה השוקע ב- 100% קסילן עבור ס' 3-4
- יבש בזהירות שקופיות עם מגבון נטולת מוך. החלת טיפה 1 (כ 100-200 µL) של סינתטיים, הלא-מימית, שרף המבוססת על טעינת מדיה שקופית ולהחיל coverslip.
3. לטעום ניתוח
- ניתוח Ductal
- בחר שקופיות צבעונית עבור α-SMA. באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד יעד רכוב מצלמה, לאסוף להחליפן בתמונות בהגדלה X 20-
- שימוש ImageJ (NIH), להבדיל ולספור צינורות לכל תמונה. אלה יכולים להיות ספירה ידנית או אחד יכולות להקצות תוצאה מספרית צינורות בודדים. כדי להקצות תוצאה מספרית, פתח ImageJ ובחר תוספים. לאחר מכן בחרו נתח ובחרו מונה תא מתוך התפריט הנפתח. לחץ על אתחל ולאחר מכן לסמן את סוג 1 כדי להתחיל תיוג צינוריות. בסיום, בחר תוצאות כדי להציג את הספירה ductal.
הערה: לטפל כדי לוודא מבנים הם ductal ואת כלי הדם לא. - ב ' מדידה להגדיר ' אופציות, בדוק ' היקפית ' ו- ' אזור ".
- בעזרת הכלי מצולע ביד חופשית, לצייר קו סביב כל צינור-תא myoepithelial (ראות שנעזר α-SMA כתם). בחר ' מידה ' ולהקליט את ההיקף ואת אזור.
- שוב בעזרת הכלי מצולע ביד חופשית, לצייר קו לאורך הצד הפסגה של האפיתל ductal בתוך החלק הפנימי של לומן. בחר ' מידה ' ולהקליט את ההיקף ואת אזור.
- להחסיר את ההיקף של תא luminal מן ההיקף של תא myoepithelial על מנת לקבל את היקף ductal האפיתל. להחסיר את האזור של תא luminal מהאזור של תא myoepithelial כדי להשיג את האזור של האפיתל ductal.
- אימונוהיסטוכימיה ניתוח
- להעלות תמונות brightfield תוכנה אנליטית, כגון ImageJ או סוויטה פיג'י.
הערה: פרוטוקול זה מתאר את השלבים עבור צביעת ניתוח באמצעות ImageJ והתוסף בארגז הכלים IHC. - לפתוח את ארגז הכלים IHC ' מתפריט ' תוסף. ב " בחר דגם " תיבה משולבת שנפתח, בחר הכתם המתאים (קרי H-DAB, הפי, וכדומה). בחר " צבע " אפשרות לבודד את הכתם. פעולה זו תפתח חלון התוצאה.
הערה: שיטה זו מתאימה, אם חלבון עניין ממוקם ברווחים חוץ-תאית או cytosolic, או מאוגד קרום פלזמה. אם החלבון עניין הגרעין, בחירת " גרעינים " יבקש את התוסף על מנת לנתח את התמונה עבור גרעין חיובי מוכתם. - השתמש השקופית בוחר צבע כדי להבטיח בידוד נאות של הכתם ללא רקע הכללה או אי הכללה הכתם מופרז.
הערה: אם מצב אוטומטי אינו מסוגל לזהות את הכתם או לא תגרום תמונות מקובל, צייר ריבוע אזור של הריבית (ROI) מעל מזוהה צבעונית באזור. בחלון IHC בארגז הכלים, בחר " הרכבת " לכוון את התוסף המתאים ליעד. - להמיר את התמונה ל- 16 סיביות. עבור אל התמונה → סוג → 16 bit.
- סף התמונה. עבור אל התמונה → להתאים את → אוטומטי הסף.
- קבע את קנה המידה של התמונה על ידי ציור קו רועי ישירות מעל הבאר סולם בתמונה מכן הקצאת האורך. כדי להגדיר את סרגל קנה מידה, ללכת ניתוח → לקבוע קנה מידה- קלט מספר פיקסלים לכל יחידת הרצויה אורך (למשל 120 פיקסלים לכל 50 מיקרומטר).
- למדוד את השטח תוצאות ואני מתכוון ערך אפור. ללכת נתח → להגדיר מידות לאסוף את המדידה על-ידי לחיצה על ניתוח → מידה.
- להעלות תמונות brightfield תוכנה אנליטית, כגון ImageJ או סוויטה פיג'י.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים נקבה יש 5 זוגות של בלוטות מוגדלות. באופן ספציפי, יש זוג אחד של בלוטות צוואר הרחם (#1), שני זוגות של בלוטות בית החזה (#2 ו- #3), זוג אחד של בטן בלוטות (#4), 1 זוג בלוטות במפשעה (מס ' 5) (איור 1א'). כאן, אנחנו מבודדים הבלוטות #4 כפי שהם לזיהוי בקלות. בנסיבות מסוימות, #4 והן #5 בלוטות היו מבודדים ביחד ההבחנה בין השניים היה קשה. כדי לבודד שלם #4 בטן בלוטות מוגדלות, הפרווה מוצמדים, הופרדו בקפידה הצפק הבסיסית, את המיקום של הבלוטות #4 מסומנים בחץ (איור 1B). הבלוטות #4 היו בקפידה טוחנות ולא בדק נוכחות של כל רקמה תת עורית או שריר שיורית. למרות אלו לא היו לזיהוי בבלוטות מבודד שלנו (איור 1C), יש לציין עורית משמעותית יותר בבלוטות שהוכתמו fibronectin מבלוקים רקמות שבו רקמת לא הוסרו לפני חלוקתה (למשל שטחית) (איור 1D) לעומת בלוטות ב איזה 100-200 מיקרומטר של רקמה מרקמות החסימות הוסרו לפני אופטים (למשל עמוק) (איור 1E). כדי לקבל הבנה טובה יותר של רקמת פיברוזיס בבלוטת החלב בתגובה גורמים אקסוגניים או אנדוגני, החוקר ייתכן שתרצה להשוות פיברוזיס ב שטחית לעומת חתכים עמוקים של בלוטת. עבור ניתוחים אחרים, זה יכול להיות יתרון עבור החוקר את סעיף הרחוב רקמות לשניים לפני שימשיך רקמות לחתוך מכתים אם ניכר תת עורית ו/או רקמת שריר קיים בעקבות ניתוח בלוטת.
בעקבות בידוד, בלוטות היו קבועים בפורמלין במאגר נייטרלי 10%, מעובד, למחלקה עבור צביעת. המדרגות המשמש לניתוח ביטוי קולגן בנוסף לחלבונים אחרים עניין מתוארת באיור2 א. מדגמים מייצגים חלבונים קולגן, fibronectin, tenascin-C ECM מוצגים באיור 2B. חצים בכל אחת מהתמונות להציג את הנוכחות של צינוריות ברקמות אלה (איור 2B).
כדי לכמת תכונות מורפולוגיות של צינורות, חשוב להתייחס הסעיפים היסטולוגית בזהירות כמו טיפול לקוי עלול להניב רקמות שנפגעו ותעלות אינם מדידים. דוגמאות של טיפול לקוי עשוי לפעול מאגרי מים או ישירות על הרקמות, באמצעות מאגרי בטמפרטורה לא תקין או עוזבת דגימות רקמה במאגרי קשים כגון ציטראט נתרן וחומצה אצטית לתקופה ארוכה יותר של זמן ממה שצוין בפרוטוקול. דוגמה של קטע רקמה ברקמת אשר נגרם נזק מוצג באיור 3א. . הנה, לנזק לרקמת ניתן לצפות בקלות נקודות שבירה צינוריות (איור 3א). מקטע זה אינו יכול לשמש עבור ניתוח של מבנים ductal. דוגמה דגימות רקמות ללא פגע איפה צינוריות מדיד ו לכימות מוצג איור 3. . הנה, צינוריות אינם רק מאופיין על ידי stroma שהוכתמו fibronectin שמסביב, אך גם מאופיינים על ידי הנוכחות של אוכלוסיה צפופה לתאי האפיתל המצפים את לומן של הצינורות (איור 3ב). חשוב לציין כי במהלך הפיתוח, בלוטת החלב העכבר מכיל צינור אוורור יחיד בלידה של איזה נבט לרוחב ענפים משניים, ויוצרים עץ ductal מורכבת יותר אשר עובר סדרה של הסתעפות רגרסיה עם כל ייחום 13. למרות שלא לקחנו בחשבון את ייחום של בעלי החיים בניסויים אלה, החוקר ייתכן שתרצה לעשות זאת על מנת לקבל מידע על באופן עצמאי ייחום ductal מספרים. החוקר המכונה פרוטוקול בפי Caligioni14 בו השלב של ייחום יכול בעליל להיקבע. לגבי לכימות צינוריות, הנוכחות של מספר מבנים ductal בסעיפים אלה היסטולוגית אינה מעידה על מספר צינוריות ייחודי, אבל מעדיף מעידה על עץ ductal מפותחת יותר הנובע ductal תוצר. למנות צינוריות, אחד עשויים להשתמש ניתוח תמונה של תוכנה כגון ImageJ (NIH) כדי להקצות מספר צינורות בודדים קטע רקמה. החוקר ייתכן שתרצה לספור צינוריות כמו שינויים במספרים ductal, אשר עשוי להיות מעיד על הפרעות התפתחותיות או מצב פתולוגי. לגבי המחקר שלנו, אנחנו מאמינים למספר גדל של צינורות, תוצאה של תוצר ductal, קשורה עם איבוד caveolin-1 אשר ייתכן כונן aberrant הביטוי של גורמי גדילה כמו פקטורי גדילה אינסולין 1 (IGF-1), מגשר הידוע של העכבר ductal צמיחה 15.
בנוסף הנוכחות של צינורות ללא פגע, מכילים צינוריות מספר ענפים, המסומנים על ידי חצים במקטע שהוכתמו fibronectin (איור 3C). למטרת ניתוח זה, ענפים ductal אלה אין להתייחס ductal כמבנה נפרד. בעת הערכת ומדידת צינוריות, חשוב להבחין צינוריות לבין מבנים כלי הדם. מבנים כלי הדם לא רק ניתן לזהות על ידי נוכחות טפט אנדותל המצפים לומן, אלא גם על ידי הנוכחות של מבנים-גרעיני, אאוזינופילית. מצביע על תאי דם אדומים (RBC) בתוך לומן (איור 3ד'). למרות הנוכחות של מבנים אאוזינופילית לומן מציין RBC מרמז להערכת, המנוע של RBC במהלך האיסוף בלוטת לאורך כל מקטעי רקמת אפשרי. רצוי לאשר מבנים וסקולרית תוך שימוש בסמן אנדותל CD31. דוגמה של מקטע היסטולוגית מוכתם CD31 מוצג (איור 3ד'). על מנת לכמת את היקף ductal ואזור, ניתן להקצות וקטורים ב- ImageJ (NIH) כדי לחלק לרמות את הגבול myoepithelial (היקף) והגבול luminal בסעיף רקמות α-SMA-צבעונית. Α-SMA, סמן של תאי שריר חלק, נעשה שימוש כמו זה מכתים את התאים myoepithelial אשר קו צינורות אוורור. בתמונה המוצגת, הקו האדום מראה הגבול myoepithelial ובמקביל הקו הכחול מראה הגבול luminal (איור 3E). האזור בין התאים סטרומה, luminal, שמוצג בתרשימים, הינו האזור שנכבש על ידי הרקמה סטרומה הכולל פלוס בתאי אפיתל ductal (איור 3E).
איור 1 : בידוד של בלוטות מוגדלות שלם, שלם עבור ניתוחים היסטולוגית. (א) בעקבות להקריב חיה, הפרווה הוסר בזהירות, מוצמדת האחורי כדי לחשוף את בלוטות החלב ממוקם בין הצפק דרמיס. התרשים מציג את המיקומים היחסיים של צוואר הרחם (#1), בית החזה (# של 2 ו- 3), בטן (#4) ובלוטות במפשעה (#5). (B) #4 בלוטות בטן, שמוצג החיה ביתור ומצוינות על ידי החיצים האדומים, היו מבודדים. (ג) נציג דוגמה #4 בלוטות בטן מבודד עכבר B6 הנשי nulliparous. (ד) הרקמה התת עורית משמעותית מן בלוטות שבו רקמת לא הוסרו לבלוק פראפין לפני אופטים (למשל שטחית) היה ברור בעקבות צביעת עבור fibronectin חלבון ECM. (ה) Considerably פחות עורית ו- fibronectin יותר צבעונית רקמות סטרומה נצפו מן בלוטות שבו הוסרו מיקרומטר 100-200 של רקמה מהגוש פרפין לפני אופטים (למשל עמוק). סעיפים היסטולוגית הם מדגמים מייצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Histological מכתים ועיבוד. (א) ייצוג סכמטי של המדרגות המשמש לעיבוד היסטולוגית. סדרת צעדים שונים היה מנוצל עבור ניתוחים של הביטוי קולגן. (B) להחליפן בתמונות של חלבונים קולגן, fibronectin, tenascin-C מן בלוטות הנקבה nulliparous caveolin-1 חסר חיות ECM. חיצים קולגן, fibronectin, tenascin-C מציינים stroma צפופה רירית צינוריות. הפי: Picrosirius אדום. Fn: fibronectin. 10-c: tenascin-C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוחים של אדריכלות ductal. (א) fibronectin צבעונית סעיף מדגים נזק לרקמות נרחב. זה מסומן על ידי הנוכחות של מעברי במבנים ductal (חיצים). (B) fibronectin צבעונית סעיף ממחיש את הנוכחות של מבנים ductal שלם אשר מסומנים על ידי הנוכחות של לומן, מוקף שכבה אחת או יותר של תאים אפיתל של משתית שמסביב. חיצים מציינים מבנים ductal בודדים. (ג) תמונה צבעונית-fibronectin מדגיש את הנוכחות של ענפים ductal, אשר מסומנים עם חצים. הערה את ההמשכיות של אלה עם לומן של המבנה ductal גדול יותר. (ד) כלי הדם מבנים (חצים אדומים), המאופיינת על ידי שכבה אחת של תאים ונוכחות של-nucleated מעיד על כדוריות הדם האדומות, אאוזינופילית מבנים הם לעתים קרובות נצפו בסמיכות עם צינוריות (חץ שחור). הגדלה נמוכה מוצג בתמונה משמאל, תמונת בהגדלה המתאים מוצג מימין. התמונות האלה היו מוכתמים H & E ו- C tenascin-. CD31 שימש כסמן חיובי עבור תאי אנדותל המצפים את המבנים כלי הדם. המוצג הוא מבנה כלי הדם גדול ב CD31 אילו תאים חיוביים גלויים רירית לומן של כלי השיט. הגדלה נמוכה מוצג בתמונה משמאל, תמונת בהגדלה המתאים מוצג מימין. (ה) היקף Ductal נמדדה ב תמונה צבעונית-α-SMA באמצעות וקטור (באיור אדום) כדי לחלק לרמות תא myoepithelial בעוד אזור ductal נמדדה באמצעות וקטור (מוצג בצבע כחול) כדי לחלק לרמות תא luminal. האזור בין התאים סטרומה, luminal, כשטח אזור ductal. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. תיאור סכמטי של מבנה ductal הדגשת האזורים שממנה נמדדו המערכת ו באזור. 10-c: tenascin-C. המקטע היסטולוגית במי דמות שונה מ: C תומפסון. et al. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעיתון תארנו טכניקה כדי לבודד את העכבר ללא פגע בלוטות מוגדלות עבור ניתוחים היסטולוגית במורד הזרם של מורפולוגיה ductal וביטוי ECM. לגבי ניתוחים של מורפולוגיה ductal, מתודולוגיה זו מאפשרת חקירת ארכיטקטורת ductal מבוסס את סעיפים מוכתמים היסטולוגית מהירה. שיטות אחרות של ניתוחים ductal להסתמך על זריקות של צבעים כדי לאפשר ויזואליזציה של העץ ductal, שיטות אשר עשוי להיות טכנית מאתגר וצורכת זמן.
בסרטן השד, דווח על ECM להיות חריג. 1 , 2 , 6 , 9 . במיוחד, שינויים בתבניות שפע ו/או cross-linking של ECM דווחו להשפיע על גידול התקדמות, גרורות, טיפול ההתנגדות3,4,6,7 8, ,9. בנוסף, שינויים חצרו ECM דווחו גם לשנות תאים אפיתל ductal מורפולוגיה והתפשטות17, שעלול כדי מצב העדפה הגידול חניכה. בעוד אנו מנוצלים caveolin-1 לקוי במודל חיה כדי להעריך שינויים בביטוי ECM מורפולוגיה ductal בעקבות אובדן caveolin-1, אחד עשויים לחול מתודולוגיה זו במודל עכבר כלשהו. כדי להעריך את דפוסי ביטוי ECM ואדריכלות ductal, אנו מתארים שיטה לבודד עטין שלם, שלם עבור ניתוחים היסטולוגית במורד הזרם. תוצאות של מתודולוגיה זו הניבה ניתוחים חזקים של מורפולוגיה בלוטות וביטוי ECM. . מצאנו את הביטוי ECM וניתוח הזה, במיוחד fibronectin, ממקטעים שבו 100-200 מיקרומטר של רקמות שטחיות הוסר לפני חלוקתה, צביעת הניב תמונה שלמה יותר של פיברוזיס של הבלוטות. בנוסף, מצאנו כי השימוש בסרום חמור בניגוד BSA הניבו יותר איכות היסטולוגית דגימות שבו שאינם ספציפיים מכתים צומצם במידה ניכרת.
עבור ניתוחים של אדריכלות ductal, חשוב להשתמש במקטעים שבו הרקמות שלמים, מכילות צינורות שבו שבירה נקודות, תוצאה של הטיפול ברקמה פסולים ואינם חלוקתה, ניכר. יתר על כן, חשוב להבחין כראוי סניפים ductal פרמטר נוסף זה חוקר מומלץ למדוד, מבנים כלי הדם אשר ניתן לזהות בקלות באמצעות שלהם אנדותל טפט ומבנים אאוזינופילית בתוך לומן בנוסף מכתים עם CD31. בעוד צינוריות נצפו בסעיפים מוכתם חלבונים שונים ECM, myoepithelial סמן αSMA H & E counterstaining, אשר הדגיש את רכיב הסלולר של הצינורות, ספירה של צינוריות ואת כל בסניפים המשוייכים הוא בר השגה עם H & E סעיפים מוכתמים רקמות לבד. ניתוח מפורט יותר של מורפוגנזה ductal או ניתוחים של הנוכחות של נגעים טרום אמצעים ו/או אמצעים, חוקר ייתכן שתרצה לנצל הדמיה קונאפוקלית להעריך בשידור חי לשעבר-vivo רקמות. במקרה זה, ניתן להחיל באותה שיטה שבה כל בלוטות הדליות עם קיבוע, עיבוד צעדים חיסלה הרקמה.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את השימוש זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי אשר לא רק התומך הזיהוי המדויק של בלוטות בטן #4, אבל בנוסף מותר ניתוח בלוטת מן צפק כבסיס דרמיס שמעליה. הכללת ניכר הרקמות והשרירים מופחת שומן-הקשורים להפרעה מכתים, היסטולוגיה. בנוסף, לזיהוי טוב יותר ECM ביטוי לשינויים בלוטת, מצאנו את זה שימושי להסיר מיקרומטר 100-200 של גוש רקמות, אשר סייע לחסל את שרידי רקמת שומן. למרות כל בלוטת חלב בידוד מספק מידע על רקמות רחב לשינויים מורפוגנזה ductal וביטוי חלבונים סטרומה, הטכניקה המתוארת מוגבלת ניתוח סעיפים טורי מ קבוע, פרפין מוטבע רקמות. כדי לקבוע את מידת אשר התרחשו שינויים מסעף ductal, הר שלמה הדמיה של רקמות לשעבר-vivo בשידור חי, היה הכרחי. . כאן, חוקר יכול להשתמש Cre-לקס לעיצוב מותאם אישית, מותנה כתב פלורסנט ההטיות לימוד אינטראקציות חלבון ספציפי בלוטת או לנצל את צבע כדי להאיר את העץ ductal לפני הדמיה18. בנוסף לכך, עוד ניתוח של חלבונים עניין במכלול של בלוטת יצריכו שימוש תספיג או ספקטרומטר מסה או טכניקות טיפול נוספות תפוקה גבוהה cross-linking immunoprecipitation (קליפ) או כרומטין immunoprecipitation (ChIP). במקרה זה, כל בלוטות ניסויים, המחולקת למקטעים לחתיכות קטנות ומעובדים בהתאם עבור הניתוחים במורד הזרם. בנוסף, ניתן להיעזר הדמיה פלורסנט במקטעי רקמות. טכניקה זו יהיה אידיאלי לניתוח מרובים חלבונים ולוקליזציה חלבון ביטוי משותף בתוך הרקמה זהה.
לסיכום, אנו מתארים טכניקה מציע הבידוד מהירה של בלוטות מוגדלות שלם, שלם ומספק פרטים נוספים על עיבוד היסטולוגית וניתוחים ductal. יישומים עתידיים של טכניקה זו יוכלו לחקור ECM ביטוי ושינויים הקשורים מורפולוגיה ductal בבעלי חיים נושאות. יתר על כן, ניתן לבצע ניתוחים של קולגן התמצאות, סיבים בקוטר, מידע אשר עשוי להיות שימושי עבור ניתוח צפיפות רקמה, גם על הפי סעיפים מוכתמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר אפריל וויילס, ד ר רוג'ר Broderson לקבלת סיוע עם necropsy בעלי חיים ובידוד בלוטת, בהתאמה. מימון עבור עבודה זו נתמכה על ידי המרכזים פילדלפיה המכללה לרפואה אוסטאופתי עבור כרונית בהפרעות של הזדקנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
