Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des souris entière et intacte pour étudier l’expression de la matrice extracellulaire (ECM) et de la morphologie ductal des glandes mammaires. La souris #4 glandes abdominales ont été extraits des 8-10 semaines vieux nullipares les souris femelles, fixés dans du formol tamponné neutre, sectionnés et colorés par immunohistochimie pour protéines ECM.
Abstract
Cette procédure visait à récolter les #4 abdominale des glandes mammaires des femelles nullipares afin d’évaluer l’expression de l’ECM et architecture canalaire. Ici, une petite poche sous la peau a été créée à l’aide de ciseaux de Mayo, permettant une séparation des glandes dans le tissu sous-cutané de la péritoine sous-jacent. Visualisation des glandes ont été facilitée par l’utilisation de 3.5 loupes micro chirurgical x-R. La dépouille a été inversée et épinglé de retour permettant d’identifier les coussinets adipeux mammaires intacts. Chacune des glandes abdominales #4 a été carrément disséqué en faisant glisser la lame de bistouri Swann-Morton latéralement entre les glandes et la couche sous-cutanée. Immédiatement après la récolte, les glandes ont été placés dans 10 % de formol tamponné neutre pour le traitement des tissus ultérieures. L’excision de la glande entière est avantageuse car elle élimine principalement le risque d’exclure les tissus à l’échelle des interactions importantes entre les cellules épithéliales canalaires et autres populations cellulaires micro-environnementales qui pourraient manquer dans une biopsie partielle. Un inconvénient de la méthode est l’utilisation de coupes sériées de tissus fixés qui limite les analyses d’expression canalaire de la morphogénèse et la protéine à des endroits distincts au sein de la glande. Par conséquent, changements dans l’expression d’architecture et protéines canalaire en 3 dimensions (3D) n’est pas vérifiable. Dans l’ensemble, la technique est applicable aux études exigeant des glandes mammaires murins ensemble intacts pour les enquêtes en aval telles que le cancer morphogénèse ou du sein canalaire du développement.
Introduction
Le cancer du sein se caractérise par un degré important de tissu fibrose1,2,3,4. Dénommé l’ECM, cette entité non cellulaire se trouve à des degrés divers dans tous les tissus et se compose principalement d’un réseau complex de collagènes fibrillaires et non fibrillaire, élastine et de glycoprotéines en plus de diverses molécules de signalisation qui sont séquestré dans cette matrice. Dans des conditions homéostatiques, la déposition et la dégradation de l’ECM est étroitement contrôlée. 5 au cours de la tumorigenèse mammaire, le solde du dépôt de l’ECM et la dégradation est perturbé. Ainsi, les tumeurs du sein ont été signalés pour exprimer les protéines ECM abondantes telles que les collagènes, fibronectine et ténascine C entre autres. 6 l’expression anormale de ces protéines en plus de patrons une augmentation de la réticulation à matrice a été documentée pour promouvoir du sein tumeur progression, métastases et thérapie résistance1,3, 4,7,8,9.
Pour évaluer la composition de l’ECM et morphologie canalaire, isolement d’intact glande mammaire a été effectuée. Ici, nous avons utilisé des souris femelles nullipares déficients pour cavéoline-1, une protéine intégrale de membrane qui est reliée à un agressif du sein tumeur signature10,11,12et contrôler les femmes nullipares B6 souris. Traitement et la souillure de ces tissus histologiques permis d’identifier plusieurs protéines ECM ainsi que la caractérisation de la morphologie canalaire.
Dans l’ensemble, l’isolement des glandes mammaires intacts, tout donne aux chercheurs la possibilité d’étudier les tissus à l’échelle des changements morphologiques ou cellulaires survenant en réponse à des facteurs exogènes ou endogènes. Inconvénients de la technique sont associés aux analyses de 2 sections de tissu de dimensions (2D) par opposition à une perspective 3D, ce qui donnerait une image plus complète de la morphologie complexe de l’arbre canalaire. Compte tenu de la complexité des interactions cellule-cellule et cellule-ECM qui se déroulent dans la glande mammaire, l’isolement des glandes entières et intactes est avantageuse pour analyser efficacement une expression morphologie et protéine canalaire dans diverses régions de la murine mammaire glande.
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Protocol
procédures sur des sujets animaux au présent protocole ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme de la faculté de médecine ostéopathique de Philadelphie et d’institutionnels animalier et toutes les techniques se sont déroulées sous stricte lignes directrices éthiques.
1. échantillon approvisionnement et traitement
- Sélectionner la matière animale et la place dans une chambre de CO 2. Pour cette expérience, utiliser 8-10 semaine vieille femelle B6 nullipares. CG-Cav1tmMIs/J et C57BI/6J.
- Tour sur le débit de gaz de 30 à 40 %. Une fois que l’animal est visiblement inconscient après environ 2 min, ouvrir le robinet de gaz à pleine pression pendant un 5 min supplémentaires
NOTE : Confirmer animale mort en observant les signes visibles de la respiration (par exemple le mouvement de la poitrine) pour une période de 10 min après la cessation de la livraison de CO 2. Si l’animal est encore en vie, il peut être placé retour dans la chambre de CO 2. Dislocation cervicale peut également être utilisée même si elle n’est pas recommandé, car le sang peut s’accumuler autour de la glande mammaire, interférant avec la dissection et les résultats. - Suite de sacrifice, épingler la carcasse dans une position en décubitus dorsal et saturer avec de l’éthanol à 70 %.
- Pincer la peau juste au-dessus du pubis avec une pincette et nick avec des petits ciseaux chirurgicaux. Tourner les ciseaux, coupez la peau le long de la ligne de médiane ventrale moving caudale à crânienne.
- Avec des grands ciseaux ou une pince hémostatique, carrément disséquer le fascia sous-cutané au niveau bilatéral, utilisation attention ne pas de perforation du péritoine. Couper le long des marges horizontales aux extrémités distales de l’incision.
- Pin la peau volets ouvert et vaporiser avec l’éthanol à 70 %.
Remarque : Bien que l’utilisation de l’éthanol à 70 % autorisée meilleure distinction visuelle entre la glande et le tissu sous-cutané environnant, veillez à éviter le séchage des tissus par suite de l’utilisation de cette solution. Pour éviter le séchage, retirer la glande dans un délai ne devant ne pas dépasser 4 min. Comme alternative à l’éthanol à 70 %, l’enquêteur peut également remplacer un tampon isolat général, tels que PBS 1 x, pour éviter le dessèchement des tissus. - Localiser les glandes mammaires d’intérêt, glissez une lame de bistouri #4 à l’intérieur des volets pelt, coupant la glande mammaire et associé adipeux cutané exempt de derme.
NOTE : 3.5 x loupes micro chirurgicales peut aider à la visualisation plus facile des glandes. - Submerger immédiatement gland nouvellement isolé en tube à fond conique contenant 10:1 solution-tissu volume de 10 % de formol tamponné neutre pendant 24-48 h
Remarque : Selon intention d’étude, nombreux fixatifs alternatifs peuvent être utilisés comme paraformaldéhyde, éthanol pour les études génomiques et RNA disponible dans le commerce, préserver les zones tampons. - Suivre les protocoles institutionnels pour l’enrobage de paraffine, soumettre des échantillons à un vendeur à la transformation, enrobage et tranchage/plaque de fixation. Section des tissus à 5 µm.
Remarque : En raison des excès adipeuse glande environnante, envisager la suppression de 100 à 200 µm de tissu avant la coupe et la coloration.
2. Teinture de tissus
- immunohistochimie
- diapositives Place à colorer sur bloc chauffant fixé à 58 ° c pendant 1 h faire fondre la paraffine.
ATTENTION : Faire fondre la cire de paraffine peut-être exécuter hors diapositive. Suivre de près ou de placer sous glissière pour capturer la cire ruissellement.
Remarque : Cette étape n’est pas indispensable et peut être ignorée. Si les résultats sont ne pas comme prévu, ajoutant ce recul peut améliorer les résultats. - Incuber les lames dans une diapositive jar contenant 100 % de xylène pendant 30 min, garantissant une immersion complète. Répéter une fois.
Remarque : À ce stade, inspection visuelle doit être effectuée pour s’assurer que les coupes de tissus sont libres de tissu adipeux et de paraffine. Si le tissu adipeux supplémentaire ou la cire est évidente, la diapositive se re-s’enfoncent dans le xylène. Soyez prudent pour minimiser l’exposition supplémentaire au xylène car ceci peut causer le rétrécissement du tissu. - Tissus de réhydrater dans un bocal de diapositive contenant de l’éthanol à 100 % pendant 10 min. répètent une fois.
- Déplacer diapositives dans un bocal diapositive contenant 95 % d’éthanol pour 10 min. répètent une fois.
- Déplacer les diapositives une diapositive jar contenant 75 % d’éthanol pendant 5 min.
- Déplacer les diapositives une diapositive jar contenant 50 % d’éthanol pendant 5 min.
- , Bouillir 10 mM du citrate de sodium solution (pH 6.0) dans une plaque chauffante ou un four à micro-ondes et verser dans de Coplin.
ATTENTION : Soigneusement surveiller la solution tout en chauffant et veiller à ne pas faire bouillir plus. Conteneur sera très chaud. Utiliser une protection pour éviter les brûlures. - Lentement place glisse dans Coplin jar, assurer l’immersion complète et incuber à 100 ° C pendant 10 min récupérer les épitopes. Retirez et séchez soigneusement les diapositives.
- Dessiner une barrière autour de tissus avec un marqueur hydrophobe. Ajouter suffisamment inhibiteur de l’enzyme endogène (peroxyde d’hydrogène et de l’azide de sodium, disponible dans le commerce) pour couvrir le tissu et incuber pendant 10 min.
- Diapositives submerge dans le 1 phosphate x solution saline tamponnée (PBS) pendant 10 min.
- Ajouter assez sérum âne de 10 % dans du PBS 1 x à couvrir le tissu et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée.
Remarque : L’expérience peut être suspendue ici en stockant les diapositives dans la chambre humidifiée à 4 ° C durant la nuit. Tandis que le sérum de l’âne a été trouvé pour donner des résultats optimaux de coloration, l’enquêteur pourra tester les sérums différents tels que l’albumine sérique bovine (BSA), sérum de chèvre ou de sérum de cheval pour déterminer un résultat optimal. Si vous utilisez BSA, l’enquêteur doit préparer ce frais avant utilisation. - Décanter excès bloqueur de diapositives et ajoutez l’anticorps primaire correctement dilué à 1 % de sérum directement aux diapositives, veiller à ce que le tissu est uniformément couvert en solution. Incuber 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée.
Remarque : Cette étape peut être poursuivie pour des durées plus longues avec chambre humide conservé à 4 ° C. Assurez-vous d’inclure des lames de bon contrôle négatif (par exemple une diapositive avec aucun anticorps primaire, appelé tissu négatifs, etc.) à cette étape. - Soigneusement les lames par coule environ 1 mL de diH 2 O sur tissu et incuber dans 1 changement de 1 x PBS pendant 5 min.
- PBS excès de décanter et ajouter suffisamment étiquette de peroxydase de raifort pour couvrir le tissu et incuber pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée.
NOTE : À cette étape, l’enquêteur voudra procéder à fluorescent coloration à l’aide d’anticorps secondaires conjugués fluorescent. Si cela est souhaité, les prochaines étapes décrites devront être modifiés en conséquence. - Soigneusement les lames par coule environ 1 mL de diH 2 O sur tissu et incuber dans 1 changement de 1 x PBS pendant 5 min.
- Faire la diaminobenzidine (DAB) plus solution chromogène selon le ratio suggéré du fabricant et mélanger par vortex.
NOTE : De nombreux kits prêts à l’emploi sont disponibles dans le commerce en dehors de celle utilisée dans le présent protocole. - Decant excès de tampon de diapositives et ajouter 2 à 3 gouttes (10-50 µL) de chromogène tache directement aux tissus et Incuber pendant 5 min dans la chambre humide. Laver soigneusement les diapositives qui coule environ 1 mL diH 2 O sur tissus.
ATTENTION : DAB chromogène est hautement toxique. Eviter le contact direct de tache avec peau et recueillir l’écoulement hors déchets dangereux.
- diapositives Place à colorer sur bloc chauffant fixé à 58 ° c pendant 1 h faire fondre la paraffine.
- Hématoxyline et éosine (H & E)
- après le rinçage final après incubation chromogène, submerger les diapositives à l’hématoxyline de Harris pour les diapositives de rinçage 2 à 2,5 min. doucement sous l’eau courante pendant 1-2 min.
Remarque : veiller à ne pas jet direct de l’eau sur les tissus. - Submerge glisse pour 2-3 s dans une solution de différenciation (0,25 mL d’acide chlorhydrique dans 100 mL d’éthanol à 70 %). Rincer les lames doucement sous l’eau courante pendant environ 1-2 min.
- Immerger diapositives dans agent bleu (carbonate de calcium 4,5 mg dans 100 mL d’eau robinet, pH ajusté à 9,4) pendant 60 s. diapositives de rinçage dans l’éthanol à 95 % pendant 30 s.
- Submerge diapositives d’éosine alcoolique Y pendant 2-3 min.
- Déshydrater le tissu en 2 changements d’éthanol à 95 % pendant 1 min de chaque.
- Tissu de la déshydratation en 1 changer d’éthanol à 100 % pendant 1 min.
- Sécher soigneusement les lames avec un chiffon non pelucheux. Déposer 1 goutte (environ 100-200 µL) de synthèse, non aqueux, médias de glisser et d’appliquer la lamelle couvre-objet de montage à base de résine.
Remarque : Si une méthode de coloration différente a été élue, un support de montage différent peut être requis. Par exemple, si l’enquêteur a choisi un anticorps secondaire conjugué fluorescent, un montage aqueux serait plus idéal. - Laisser lames définir toute la nuit à température ambiante.
- après le rinçage final après incubation chromogène, submerger les diapositives à l’hématoxyline de Harris pour les diapositives de rinçage 2 à 2,5 min. doucement sous l’eau courante pendant 1-2 min.
- Coloration de Picrosirius rouge (PSR)
- Sélectionnez diapositives pour colorer et suivre le protocole d’immunohistochemistry jusqu'à l’étape 6 (trempage de l’éthanol à 50 %).
- Diapositives de submerge dans PSR tachent pendant 1 h.
- Submerger les diapositives à l’acide acétique à 0,5 % pour 1-2 s, deux fois de différencier les tache.
- Déshydrater tissus 2 changements d’éthanol à 95 % pendant 1 min chaque.
- Tissus de la déshydratation en 1 changer d’éthanol à 100 % pendant 1 min.
- Effacer les diapositives en submergeant brièvement dans 100 % xylène pour tout 3-4 s.
- Sécher soigneusement les lames avec un chiffon non pelucheux. Déposer 1 goutte (environ 100-200 µL) de synthèse, non aqueux, médias de glisser et d’appliquer la lamelle couvre-objet de montage à base de résine.
3. Analyse de l’échantillon
- Sélectionnez l' Analyse canalaire lames colorées pour α-SMA. À l’aide d’un microscope optique équipé d’un objectif de caméra montée, recueillir des images représentatives à un grossissement de 20 X.
- Using ImageJ (NIH), distinguer et compter les conduits dans chaque image. Ils peuvent être énumérés manuellement ou on peut attribuer un score numérique aux conduits individuels. Pour attribuer un score numérique, ouvrez ImageJ et sélectionnez Plugins. Ensuite sélectionnez analyser et choisissez compteur de cellules dans le menu déroulant. Cliquez sur initialiser, puis mettez en surbrillance de Type 1 pour commencer le marquage des conduits. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez les résultats pour afficher le nombre canalaire.
Remarque : prenez soin de vérifier les structures sont canalaire et non vasculaires. - Dans ' la valeur de mesure ' options, vérifiez ' périmètre ' et ' zone ".
- à l’aide de l’outil Polygone à main levée, tracer une ligne autour de chaque conduit au compartiment myoépithéliales (visibilité avec l’aide de α-SMA tache). Sélectionnez ' mesure ' et enregistrer le périmètre et l’aire.
- Encore une fois à l’aide de l’outil Polygone à main levée, dessiner une ligne le long du côté apical de l’épithélium canalaire à l’intérieur de la lumière. Sélectionnez ' mesure ' et enregistrer le périmètre et l’aire.
- Soustraire le périmètre du compartiment luminal du périmètre du compartiment myoépithéliales afin d’obtenir la circonférence de l’épithélium canalaire. Soustraire de la zone du compartiment luminale de la zone du compartiment pour obtenir la zone de l’épithélium canalaire myoépithéliales.
- Analyse immunohistochimique
- Télécharger des images de fond clair à un logiciel d’analyse, par exemple ImageJ ou Fidji Suite.
Remarque : Ce protocole décrit les étapes pour la coloration analyse ImageJ et le plugin IHC Toolbox. - Ouvrir la boîte à outils de l’IHC dans le menu Plugin. Dans le " sélectionner un modèle " zone de liste déroulante que s’ouvre, sélectionnez tache approprié (c.-à-d. H-DAB, PSR, etc.). Sélectionnez le " couleur " option pour isoler la tache. Ceci ouvrira une fenêtre de résultats.
Remarque : Cette méthode est appropriée si une protéine d’intérêt est située dans les espaces extracellulaires ou cytosoliques, ou est liée à la membrane plasmique. Si la protéine d’intérêt est nucléaire, sélectionnant " noyaux " invitera le plugin d’analyser l’image pour les noyaux positivement tachées. - Utiliser le sélecteur de couleur glisser afin d’assurer une isolation correcte de la tache sans fond inclusion ou l’exclusion de l’excessive tache.
Remarque : Si le mode automatique est incapable de détecter la tache ou ne débouche pas sur des images acceptables, dessinez un carré région d’intérêt (ROI) sur un identifiés teinté de région. Dans la fenêtre boîte à outils IHC, sélectionnez " Train " pour diriger le plugin à la cible appropriée. - Convertir l’image en 16 bits. Aller à Image → Type → 16bits.
- Seuil de l’image. Aller à Image → ajuster → Auto seuil.
- Définir l’échelle de mesure d’image en traçant une ligne ROI directement au-dessus de la barre d’échelle dans l’image, puis assigner la longueur. Pour définir la barre d’échelle, allez à Analyze → échelle définie. Inscrire le nombre de pixels par l’unité de longueur (par exemple 120 pixels par 50 µm).
- Mesurer la surface résultante et gris valeur moyenne. Allez dans Analyze → définir des mesures et recueillir la mesure en cliquant sur Analyze → mesure.
- Télécharger des images de fond clair à un logiciel d’analyse, par exemple ImageJ ou Fidji Suite.
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Representative Results
Des souris femelles ont 5 paires de glandes mammaires. Plus précisément, il y a une paire de ganglions cervicaux (#1), deux paires de glandes thoracique (#2 et #3), une paire de glandes abdominales (#4) et 1 paire de glandes inguinales (#5) (Figure 1A). Ici, nous avons isolé les glandes #4 où ils sont facilement identifiables. Dans certaines circonstances, les glandes fois #4 et #5 ont été isolés ensemble car la distinction entre les deux est difficile. Pour isoler intact #4 abdominale des glandes mammaires, la peau a été épinglé et soigneusement séparé le péritoine sous-jacent, révélant l’emplacement des glandes #4 indiqué par une flèche (Figure 1B). Les glandes de #4 ont été soigneusement excisées et inspectés la présence de n’importe quel tissu sous-cutané ou musculaire résiduelle. Bien que ceux-ci n’étaient pas identifiables dans nos glandes isolés (Figure 1C), nous avons noté des tissus sous-cutanés nettement plus colorés à la fibronectine des glandes de blocs de tissus où les tissus n’avaient pas été retiré avant incision (par exemple superficielle) (Figure 1D) par rapport aux glandes dans laquelle µm 100-200 de tissu provenant du tissu bloc avait été enlevée avant sectionnement (p. ex. profonde) (Figure 1E). Pour acquérir une meilleure compréhension de la fibrose des tissus dans la glande mammaire en réponse à des facteurs exogènes ou endogènes, l’enquêteur voudra comparer fibrose chez superficielle par rapport aux coupes profondes de la glande. Pour les autres analyses, il peut être avantageux pour l’enquêteur à la section du bloc de tissu dans la moitié avant de procéder au découpage de tissu et coloration si substantielle sous-cutanée et/ou le tissu musculaire est présent après dissection de la glande.
Après isolement, glandes ont été fixés à 10 % de formol tamponné neutre, traitées et sectionnés pour une coloration. Les étapes utilisées pour analyser l’expression de collagène en plus d’autres protéines d’intérêt sont illustrés dans la Figure 2 a. Des échantillons représentatifs du collagène protéines ECM, de fibronectine et ténascine C sont indiquées dans la Figure 2B. Flèches dans chacune des images montrent la présence de conduits dans ces tissus (Figure 2B).
Afin de quantifier les caractéristiques morphologiques des gaines, il est important de traiter les coupes histologiques avec soin car une mauvaise manipulation peut entraîner dans les conduits qui ne sont pas mesurables et des tissus endommagés. Exemples d’une mauvaise manipulation peuvent s’exécuter de tampons ou l’eau directement sur les tissus, à l’aide de tampons à une température inadéquate ou laissant des échantillons de tissus dans les tampons durs tels que le citrate de sodium et d’acide acétique pour une plus longue période de temps supérieur à celui spécifié dans le protocole. Un exemple d’une section de tissu dans laquelle le tissu est survenu est illustré dans la Figure 3A. Ici, des dommages considérables au tissu peuvent être facilement observés comme des points de rupture dans les conduits (Figure 3A). Un article comme celui-ci ne peut servir pour les analyses des structures canalaires. Un exemple d’un échantillon de tissus intacts lorsque les conduits sont mesurables et quantifiables est illustré à la Figure 3B. Ici, les gaines ne sont pas seulement caractérisée par le stroma environnant colorés à la fibronectine, mais sont aussi caractérisés par la présence d’une population dense de cellules épithéliales rayant la lumière des conduits (Figure 3B). Il est important de noter que pendant le développement, la glande mammaire de la souris contient un seul conduit à la naissance de laquelle pousse des branches secondaires latérales, formant une arborescence canalaire plus compliquée qui subit une série de ramification et de régression à chaque cycle oestral 13. bien que nous n'avons pas pris en considération le cycle oestral des animaux dans ces expériences, l’enquêteur souhaiteront peut-être faire afin d’obtenir des informations sur les numéros canalaires indépendants du cycle oestral. Le chercheur est appelé un protocole par Caligioni14 dans lequel la phase du cycle oestral peut être visiblement déterminée. En ce qui concerne la quantification des conduits, la présence de multiples structures canalaires dans ces coupes histologiques n’est pas révélateur de plusieurs conduits uniques, mais est plutôt indicative d’un arbre canalaire plus développé, résultant d’une excroissance canalaire. Pour énumérer des conduits, on peut utiliser un logiciel d’analyse image par exemple ImageJ (NIH) pour attribuer un numéro à des conduits individuels dans une section de tissu. L’enquêteur pourrait énumérer les conduits comme des altérations en nombre canalaire, qui peut être le signe d’anomalies de développement ou d’un état pathologique. Au sujet de notre étude, nous croyons l’augmentation du nombre de conduits, conséquence de l’excroissance canalaire, est liés à la perte de la cavéoline-1, qui peut conduire à l’expression aberrante des facteurs de croissance comme facteur de croissance insuline 1 (IGF-1), un médiateur connu de souris canalaire croissance 15.
En plus de la présence de conduits intacts, plusieurs conduits contiennent des branches, indiquées par des flèches dans une section colorés à la fibronectine (Figure 3C). Dans le but de cette analyse, ces branches canalaires n’est pas comme une structure canalaire séparée. Tout en évaluant et en mesurant les conduits, il est important de distinguer les conduits des structures vasculaires. Structures vasculaires ne peuvent pas seulement être identifiés par la présence d’une monocouche endothéliale tapissant la lumière, mais aussi par la présence de structures a-nucléaire, éosinophiles l’indicatif de globules rouges (RBC) dans la lumière (Figure 3D). Bien que la présence de structures éosinophiles dans les lumens indique RBC et système vasculaire, le déplacement de RBC au cours de la collection de glande tout au long des sections de tissu est possible. Il est conseillé de confirmer les structures vasculaires à l’aide du marqueur endothélial CD31. Un exemple d’une coupe histologique coloré avec CD31 apparaît (Figure 3D). Afin de quantifier l’aire et circonférence canalaire, vecteurs dans ImageJ (NIH) peuvent être attribués à exposer la frontière myoépithéliales (circonférence) et la frontière luminale à la section de le α-SMA-coloration. Α-SMA, un marqueur des cellules musculaires lisses, servait comme il les taches les cellules myoépithéliales qui tapissent les conduits. Dans l’image affichée, la ligne rouge montre la frontière myoépithéliales tandis que la ligne bleue montre la frontière luminale (Figure 3E). La région entre les compartiments stromales et luminales, illustré dans le schéma, est la superficie occupée par le tissu stromal total plus les cellules épithéliales canalaires (Figure 3E).
Figure 1 : Isolement des entières et intactes les glandes mammaires pour les analyses histologiques. (A) suite de sacrifices d’animaux, la peau a été soigneusement retirée et épinglé arrière pour exposer les glandes mammaires situées entre le derme et le péritoine. Le schéma montre les positions relatives du col de l’utérus (#1), thoracique (# s 2 et 3), abdominales (#4) et les glandes inguinales (#5). (B) The #4 glandes abdominales, montré chez l’animal disséqué et indiqués par les flèches rouges, ont été isolés. (C) exemple représentatif du #4 glandes abdominales isolées de souris B6 femelle nullipare. (D) le tissu sous-cutané substantiel des glandes dans laquelle le tissu n’avait pas été retiré du bloc de paraffine avant sectionnement (p. ex. superficiel) était évident après coloration pour la fibronectine de protéines ECM. Considerab (E)ly moins le tissu sous-cutané et fibronectine plus teinté tissu stromal ont été observées des glandes dont 100 à 200 µm de tissu avait été retiré du bloc de paraffine avant sectionnement (p. ex. profonde). Coupes histologiques sont des échantillons représentatifs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: histologiques de traitement et de coloration. (A) représentation schématique des étapes utilisés pour la transformation histologique. Une autre série de mesures a été utilisée pour les analyses d’expression du collagène. (B) les images représentatives du collagène protéines ECM, de fibronectine et ténascine C des glandes de femelles nullipares animaux déficients de la cavéoline-1. Collagène, fibronectine et ténascine-C, les flèches indiquent le stroma dense bordant les canaux. RPS : Picrosirius rouge. FN : la fibronectine. Dix-C: ténascine.-c. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Analyses d’architecture canalaire. (A) une fibronectine teintée section illustre la lésion tissulaire étendue. C’est marqué par la présence de ruptures dans les structures canalaires (flèches). (B) une fibronectine teintée section illustre la présence de structures de ductal intacts qui sont marqués par la présence de lumens entouré d’une ou plusieurs couches de cellules épithéliales et un stroma environnant. Les flèches indiquent les structures canalaires individuelles. (C) une image de fibronectine teinté met en évidence la présence de branches canalaires, qui sont indiqués par des flèches. Noter la continuité de ces derniers avec la lumière de la plus grande structure canalaire. (D) les structures vasculaires (flèches rouges), caractérisées par une seule couche de cellules et la présence de structures éosinophiles a-nucléées indicatives des globules rouges, sont souvent observées à proximité avec les conduits (flèche noire). Faible grossissement est indiqué dans l’image sur la gauche et une image fort grossissement correspondante est indiquée à droite. Ces images ont été colorées avec H & E et ténascine-C. CD31 a été utilisé comme marqueur positif pour les cellules endothéliales tapissant les structures vasculaires. Montré est une grande structure vasculaire dans laquelle CD31 cellules positives sont visibles tapissant la lumière du vaisseau. Faible grossissement est indiqué dans l’image sur la gauche et une image fort grossissement correspondante est indiquée à droite. (E) tour canalaire a été mesuré dans une image α-SMA-teinté à l’aide d’un vecteur (indiqué en rouge) d’esquisser le compartiment myoépithéliales tandis que la zone canalaire a été mesurée en utilisant un vecteur (représentée en bleu) pour décrire le compartiment luminal. La région entre les compartiments stromales et luminales a été classée comme zone de canal artériel. Echelle = 50 µm. schéma d’une structure canalaire mettant en évidence les zones dont le périmètre et l’aire ont été mesurés. Dix-C: ténascine.-c. Modification de la section histologique dans Figure E de : Thompson C, et al. 16 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans le livre, nous avons décrit une technique pour isoler les glandes mammaires souris intactes pour les analyses histologiques en aval d’expression de l’ECM et morphologie canalaire. En ce qui concerne les analyses de morphologie canalaire, cette méthodologie permet l’enquête rapide d’architecture canalaire basé sur des coupes histologiques colorées. Autres méthodes d’analyse canalaire s’appuient sur des injections de colorants pour permettre la visualisation de l’arborescence canalaire, méthodes qui peuvent être techniquement difficile et chronophage.
Dans le cancer du sein, l’ECM a été signalée à être anormal. 1 , 2 , 6 , 9 spécifiquement, changements dans l’abondance et/ou la réticulation de l’ECM ont été signalés à influencer la tumeur progression, de métastases et de thérapie résistance3,4,6,7 ,8,9. En outre, des changements dans le milieu de l’ECM ont également signalés de modifier une cellule épithéliale canalaire morphologie et prolifération17, pouvant déboucher sur une situation favorisant l’initiation de la tumeur. Alors que nous avons utilisé un modèle animal déficient de cavéoline-1 pour évaluer les changements dans l’expression de l’ECM et morphologie canalaire suite à la perte de la cavéoline-1, on peut appliquer cette méthodologie dans n’importe quel modèle de souris. Afin d’évaluer les profils d’expression ECM et architecture canalaire, nous décrivons une technique pour isoler des glandes mammaires entières et intactes pour les analyses histologiques en aval. Les résultats de cette méthode a donné robustes analyses d’expression de l’ECM et morphologie glandulaire. Nous avons trouvé cette expression analyse d’ECM, surtout de la fibronectine, des sections où 100 à 200 µm de tissu superficiel a été supprimé avant coupe et coloration ont donné une image plus complète de la fibrose glandulaire. En outre, nous avons constaté que l’utilisation de sérum d’âne plutôt que BSA donnaient des résultats meilleure qualité des échantillons histologiques dans lequel une coloration non spécifique a été considérablement réduite.
Pour les analyses de l’architecture canalaire, il est important d’utiliser des sections dans lequel les tissus sont intacts et contiennent des conduits où rupture points, le résultat d’une manipulation incorrecte de tissu et sectionnement, ne sont pas évidents. En outre, il est important de distinguer correctement les branches canalaires, un autre paramètre que l’enquêteur pourrait vouloir mesurer et des structures vasculaires qui peuvent facilement être identifiés par leur endothélium monocouche et éosinophiles structures au sein de la Lumen en plus de la coloration avec le CD31. Alors que les conduits ont été observés dans les sections colorées pour diverses protéines ECM, le myoépithéliales marqueur αSMA et H & E contre-coloration, qui a mis en évidence la composante cellulaire des conduits, dénombrement des conduits et les branches connexes est réalisable avec H & E sections de tissu teinté seul. Pour des analyses plus détaillées de la morphogénèse canalaire ou des analyses de la présence de lésions pré-néoplasiques ou néoplasiques, un enquêteur pourrait utiliser l’imagerie confocale afin d’évaluer les tissus vivants ex vivo . Dans ce cas, la même technique dans laquelle les glandes entières sont excisés peut être appliquée avec la fixation et les tissus traitement pas éliminés.
Des étapes cruciales dans le présent protocole comprennent l’utilisation de loupes de micro chirurgies qui non seulement a permis l’identification précise des glandes abdominales #4, mais en outre permet la dissection de la glande du derme sus-jacent et péritoine sous-jacent. L’exclusion des muscles et des tissus sous-cutanés substantielles réduction adipeux associée à une ingérence dans la coloration et l’histologie. En outre, pour mieux identifier les modifications de l’expression ECM dans la glande, nous avons jugé utile de supprimer 100-200 µm du bloc de tissu, qui a contribué à éliminer le tissu adipeux résiduel. Bien que toute la glande mammaire isolement fournit des informations sur tissus larges changements dans l’expression de la protéine stromales et morphogenèse canalaire, la technique décrite est limitée à l’analyse de coupes sériées de fixe et paraffine encastrés tissus. Établir le degré auquel une ramification canalaire ont changé, support entier imagerie des tissus vivants, de ex vivo serait nécessaire. Ici, un enquêteur pourrait utiliser Cre-Lox pour concevoir des conjugaisons journaliste fluorescent personnalisé, conditionnelle à étudier les interactions de protéine spécifique de la glande ou utiliser un colorant pour illuminer l’arbre canalaire avant18d’imagerie. En outre, plus loin l’analyse des protéines d’intérêt dans la totalité de la glande nécessiterait l’utilisation de la tache occidentale ou de spectrométrie de masse ou d’autres techniques de haut débit telles que la réticulation immunoprécipitation (CLIP) ou la chromatine immunoprécipitation (ChIP). Dans ce cas, les glandes entières seraient être disséqués, coupés en petits morceaux et transformés en conséquence pour les analyses en aval. En outre, on peut aussi utiliser imagerie fluorescente sur coupes de tissus. Cette technique serait idéale pour l’analyse de plusieurs protéines et localisation co expression des protéines dans le même tissu.
En résumé, les auteurs décrivent une technique qui offre l’isolation rapide des glandes mammaires entiers, intacts et fournit des précisions sur la transformation histologique et analyses canalaires. Les applications futures de cette technique pourraient enquêter sur expression ECM et les changements associés dans la morphologie canalaire chez les animaux porteurs de tumeur. En outre, les analyses de l’orientation du collagène et de diamètre de fibre, informations qui peuvent être utiles pour l’analyse de densité des tissus, peuvent être effectuées sur PSR coupes coloré.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait remercier avril Wiles et Dr Roger Broderson d’assistance avec la nécropsie animale et l’isolement de la glande, respectivement. Financement pour ces travaux a été appuyée par les centres de Philadelphia College of Osteopathic Medicine pour troubles chroniques du vieillissement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
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