Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av hela, intakt mus mjölkkörtlar för att undersöka extracellulär matrix (ECM) uttryck och duktal morfologi. Mus #4 buk körtlar utvanns från 8-10 vecka gammal dräktiga honmöss, fixeras i neutral buffrad formalin, sektioneras och färgas med immunohistokemi för ECM proteiner.
Abstract
Målet med detta förfarande var att skörda #4 buk mjölkkörtlar från dräktiga honmöss för att bedöma ECM uttryck och duktal arkitektur. Här, skapades en liten ficka under huden med Mayo sax, så att separationen av körtlar inom den subkutana vävnaden från underliggande bukhinnan. Visualisering av körtlar var hjälpt av användningen av 3.5 x-R kirurgiska micro luppar. Pelt var inverterad och nålas tillbaka möjliggör identifiering av de intakta mjölkkörtlar fett kuddar. Var och en av #4 buk körtlar var rakt på sak dissekeras av glidning skalpell bladet sidled mellan den subkutana vävnaden och körtlar. Omedelbart efter skörd, körtlar placerades i 10% neutral buffrad formalin för efterföljande vävnad bearbetning. Excision av hela körteln är fördelaktigt eftersom det primärt eliminerar risken för exklusive viktigt vävnad-wide interaktioner mellan duktal epitelial celler och andra microenvironmental cellulära populationer som kan missas i en partiell biopsi. En nackdel med metoden är användning av seriell avsnitt från fasta vävnader vilket begränsar analyser av duktal morfogenes och protein uttryck till diskreta platser i körteln. Som sådan, förändringar i duktal arkitektur och protein uttryck i 3 dimensioner (3D) är inte lätt kan anskaffas. Övergripande, tekniken är tillämpliga på studier som kräver helt intakt murina mjölkkörtlar för nedströms utredningar såsom utvecklingsmässiga duktal morfogenes eller bröst cancer.
Introduction
Bröstcancer är kännetecknas av en betydande grad av vävnad fibros1,2,3,4. Kallad ECM, icke-cellulär entiteten finns i varierande grad i alla vävnader och består primärt av en komplex meshwork av fibrillar och icke-fibrillar kollagen, elastin och glykoproteiner förutom olika signalmolekyler som är binds i denna matris. Homeostatiska villkor kontrolleras tätt den nedfall och nedbrytning av ECM. 5 under bröstet uppkomst störs balansen i ECM nedfall och nedbrytning. Som sådan, rapporterats brösttumörer att uttrycka riklig ECM proteiner såsom kollagen, Fibronektin och tenascin-C bl.a. 6 onormal uttrycket av dessa proteiner förutom ökad mönster av matrix crosslinking har dokumenterats för att främja bröstcancer tumör progression, metastaser och terapi motstånd1,3, 4,7,8,9.
För att bedöma ECM sammansättning och duktal morfologi, utfördes isolering av intakt bröstkörtlarna. Här använde vi dräktiga honmöss bristfällig för caveolin-1, en integrerad membranprotein som har kopplats till en aggressiv bröstcancer tumör signatur10,11,12, och styra kvinnliga dräktiga B6 möss. Histologisk bearbetning och färgning av dessa vävnader tillåtna identifiering av flera ECM proteiner tillsammans med karakterisering av duktal morfologi.
Sammantaget ger isolering av hela, intakt bröstkörtlarna forskare möjlighet att undersöka vävnad-wide morfologiska eller cellulära förändringar som sker i svar på exogena och endogena faktorer. Nackdelar med tekniken är associerade med analyser av 2 dimension (2D) vävnadssnitt i motsats till ett 3D-perspektiv, vilket skulle ge en mer fullständig bild av trädet duktal komplexa morfologi. Tanke på komplexiteten i cell-cell och cell-ECM interaktioner som sker i bröstkörteln, är isolering av hela, intakt körtlar fördelaktigt för att effektivt analysera duktal morfologi och protein uttryck i olika regioner för murint mjölkkörtlar körtel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
förfaranden som omfattar animaliska ämnen i detta protokoll var granskad och godkänd av institutionella djur vård och användning kommittén av de Philadelphia College of Osteopathic Medicine och alla tekniker genomfördes under strikt etiska riktlinjer.
1. provet upphandling och bearbetning
- Välj lämpligt animaliskt ämne och plats i en CO 2 kammare. För detta experiment, använda 8-10 veckors gamla kvinnliga dräktiga B6. CG-Cav1tmMIs/J och C57BI/6J.
- Aktivera gasflödet till 30-40%. När djuret är synbart medvetslös efter ca 2 min, öppna gasventilen till fullt tryck för en ytterligare 5 min.
Obs: Bekräfta djur döden genom att observera synliga tecken på andning (t.ex. rörlighet för bröstet) för en period av 10 min efter upphörande av CO 2 leverans. Om djuret lever fortfarande, kan den placeras tillbaka i CO 2 kammaren. Cervikal dislokation kan också användas men det inte rekommenderas eftersom blod kan ackumuleras runt mjölkkörtlar störande med dissektion och resultat. - Efter offer, fästa stommen i ryggläge och mätta med 70% etanol.
- Nypa pelt precis ovanför pubis använder tången och nick med liten kirurgisk sax. Roterande saxen, skär pelt längs ventrala mittlinjen flyttar stjärtfenan till kraniala.
- Med större sax eller en hemostat, rakt på sak dissekera subkutana fascian bilateralt, använda försiktighet att inte punktera bukhinnan. Klipp längs de horisontella marginalerna både distala ändarna av snittet.
- Pin pelt klaffar öppna och spraya igen med 70% etanol.
Obs: Även om 70% etanol användas bättre visuella skillnaden mellan körteln och omgivande subkutan vävnad, var noga med att undvika uttorkning av vävnad till följd av användning av denna lösning. Undvik torkning, ta bort körteln i en tidsram på högst 4 min. Som ett alternativ till 70% etanol, utredaren kan också ersätta en allmän isolera buffert, till exempel 1 x PBS, att undvika vävnad uttorkning. - Att lokalisera mjölkkörtlar sevärdheter, skjut ett #4 skalpell blad längs insidan av viftar med pelt, skära av bröstkörteln och associerade kutan adipose fri från dermis.
Obs: 3,5 x kirurgiska micro luppar får stöd i enklare visualisering av körtlar. - Sänk omedelbart nyligen isolerade körtel i koniska rör som innehåller 10:1 lösning-vävnad volym i 10% neutral buffrad formalin för 24-48 h.
Obs: Beroende på avsikten med studien, många alternativa fixativ användas såsom paraformaldehyd, etanol för genetiska studier, och kommersiellt tillgängliga RNA bevara buffertar. - Följ institutionella protokoll för paraffin inbäddning, överlämna prover till en leverantör för bearbetning, inbäddning, och skivning bilden montering. Avsnitt vävnader på 5 µm.
Obs: På grund av överflödigt fett omgivande körtel, överväga att ta bort 100-200 µm vävnad innan snittning och färgning.
2. Vävnaden färgningen
- immunohistokemi
- plats diabilder att färgas på värme block fastställts till 58 ° c för 1 h att smälta paraffin.
FÖRSIKTIGHET: Smältande paraffin vax kan köra bort bilden. Noggrant övervaka eller placera torka under bild fånga avrinning vax.
Obs: Detta steg är inte nödvändigt och kan hoppas över. Om resultaten inte som förväntat, att lägga till detta steg tillbaka kan förbättra resultat. - Inkubera bilder i ett bildspel burk innehållande 100% xylen i 30 min att säkerställa fullständig nedsänkning. Upprepa en gång.
Obs: vid denna punkt, visuell inspektion bör utföras för att säkerställa att vävnadssnitt gratis av fettvävnad och paraffin. Om ytterligare fettvävnad eller vax är uppenbart, bör bilden vara åter nedsänkt i xylen. Var försiktig för att minimera extra exponering för xylen eftersom detta kan orsaka krympning av vävnaden. - Rehydrera vävnader i en bild burk innehållande 100% etanol för 10 min. Upprepa en gång.
- Flytta bilder till en bild burk som innehåller 95% etanol för 10 min. Upprepa en gång.
- Flytta bilder till en bild burk innehållande 75% etanol för 5 min.
- Flytta bilder till en bild burk innehållande 50% etanol för 5 min.
- Koka 10 mM natriumcitratlösning (pH 6.0) i en värmeplatta eller mikrovågsugn och häll i Coplin jar.
FÖRSIKTIGHET: Noggrant övervaka lösning medan värme och var noga med för att undvika koka över. Behållaren är mycket varm. Använd skydd för att undvika brännskador. - Långsamt plats glider in Coplin burk, att säkerställa fullständig nedsänkning och inkubera vid 100 ° C i ca 10 min att hämta epitoper. Ta bort och noggrant torka diabilder.
- Rita en barriär runt vävnad med en hydrofob markör. Lägg tillräckligt endogena enzym blocker (väteperoxid och natriumazid, tillgängliga kommersiellt) att täcka vävnad och inkubera i 10 min.
- Sänk diabilder i 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) för 10 min.
- Lägga tillräckligt 10% åsna serum i 1 x PBS att täcka vävnad och inkubera i 1 h i rumstemperatur i en fuktig kammare.
Obs: Experimentet kan pausas här genom att lagra bilderna i befuktade kammaren vid 4 ° C över natten. Medan åsna serum konstaterades för att ge optimal färgning resultat, kanske utredaren vill testa olika sera såsom bovint serumalbumin (BSA), get serum eller häst serum att fastställa optimala resultat. Om du använder BSA, utredaren bör förbereda denna färska före användning. - Dekantera överskott blockerare från bilderna och lägga ordentligt utspädd primär antikropp i 1% serum direkt till diabilder säkerställer att vävnaden jämnt omfattas i lösning. Inkubera i 30 min i rumstemperatur i en fuktig kammare.
Obs: Detta steg får fortsättas för längre tid löptider med fuktig kammare lagras vid 4 ° C. se till att inkludera korrekt negativ kontroll bilder (t.ex. en bild med ingen primär antikropp, känd antigen-negativ vävnad, etc.) i detta steg. - Noggrant tvätta diabilder av strömmande ca 1 mL Dihs 2 O över vävnad och inkubera i 1 byte av 1 x PBS för 5 min.
- Dekantera överskott PBS och lägga till tillräckligt pepparrotperoxidas etikett för att täcka vävnad och inkubera i 30 min i en fuktig kammare.
Obs: Vid detta steg, prövaren kanske vill fortsätta till fluorescerande färgning med fluorescently konjugerade sekundära antikroppar. Om detta önskas, nästa steg beskrivs bör ändras i enlighet därmed. - Noggrant tvätta diabilder av strömmande ca 1 mL Dihs 2 O över vävnad och inkubera i 1 byte av 1 x PBS för 5 min.
- Diaminobenzidin (DAB) plus kromogen lösning enligt tillverkaren föreslagna kvoten och blanda av virvel.
Obs: Många färdiga kit finns kommersiellt bortsett från den som används i detta protokoll. - Dekantera överskott buffert från diabilder och tillsätt 2-3 droppar (10-50 µL) av kromogen fläcken direkt till vävnader och Inkubera i 5 min i fuktig kammare. Noggrant tvätta diabilder av flödande ca 1 mL Dihs 2 O över vävnad.
Varning: DAB-kromogen är mycket giftiga. Undvik direkt kontakt av fläcken med hud och samla flödet av farligt avfall.
- plats diabilder att färgas på värme block fastställts till 58 ° c för 1 h att smälta paraffin.
- Hematoxylin och Eosin (H & E)
- efter sista sköljningen efter kromogen inkubation, dränka diabilder i Harris hematoxylin för 2-2,5 min. Skölj diabilder försiktigt under rinnande vatten för 1-2 min.
Obs: var noga med för att undvika direkt vattenstråle på vävnader. - Sänk glider för 2-3 s i differentiering lösning (0,25 mL saltsyra i 100 mL 70% etanol). Skölj diabilder försiktigt under rinnande vatten i ca 1-2 min.
- Sänk diabilder i blå agent (4,5 mg kalciumkarbonat i 100 mL kranvatten, pH justeras till 9,4) för 60 s. Skölj diabilder i 95% etanol för 30 s.
- Sänk diabilder i alkoholhaltiga eosin Y för 2-3 min.
- Torkar vävnad 2 förändringar av 95% etanol för 1 min varje.
- Dehydrate vävnad i 1 ändra 100% etanol för 1 min.
- Noga torra diabilder med en luddfri torka. Applicera 1 droppe (ca 100-200 µL) av syntetisk, icke vattenhaltigt, hartsbaserad montering media att glida och applicera täckglas.
Obs: Om en annan färgning metod valdes, en annan montering media kan krävas. Exempelvis om prövaren valde en fluorescerande-konjugerad sekundär antikropp, ett vattenhaltigt mount skulle vara mer perfekt. - Tillåta diabilder att ställa över natten i rumstemperatur.
- efter sista sköljningen efter kromogen inkubation, dränka diabilder i Harris hematoxylin för 2-2,5 min. Skölj diabilder försiktigt under rinnande vatten för 1-2 min.
- Picrosirius röd (PSR) färgningen
- Välj bilder som ska färgas och följ immunohistokemi protokoll genom steg 6 (50% etanol blöt).
- Sänk diabilder i fso stain för 1 h.
- Sänk diabilder i 0,5% ättiksyra för 1-2 s, två gånger för att skilja fläcken.
- Torkar vävnader 2 förändringar av 95% etanol för 1 min varje.
- Dehydrate vävnader i 1 ändra 100% etanol för 1 min.
- Rensa bilder genom kort dränka i 100% xylen för om 3-4 s.
- Noga torra diabilder med en luddfri torka. Applicera 1 droppe (ca 100-200 µL) av syntetisk, icke vattenhaltigt, hartsbaserad montering media att glida och applicera täckglas.
3. Prova analys
- Duktal analys
- Välj bilder färgas för α-SMA. Använda ett ljusmikroskop försedd med en kamera monterad mål, samla representativa bilder på 20 X förstoring.
- Använda ImageJ (NIH), skilja och räkna kanaler i varje bild. Dessa kan räknas manuellt eller en kan tilldela en numerisk poäng till enskilda kanaler. Tilldela en numerisk poäng, öppna ImageJ och välj Plugins. Nästa Välj analysera och välj Cell Counter från nedrullningsbara menyn. Klicka på initiera sedan markera typ1 börja märkning kanaler. När du är klar väljer resultat att visa antalet duktal.
Obs: var noga med för att kontrollera strukturer är duktal och inte vaskulära. - i ' ställ mätning ' alternativ, kolla ' omkrets ' och ' område ".
- Med freehand polygonverktyget, rita en linje runt varje kanal på myoepithelial facket (synlighet med hjälp av α-SMA fläcken). Välj ' åtgärd ' och registrera den omkrets och area.
- Igen med freehand polygonverktyget, rita en linje längs den apikala sidan av duktal epitel inom inre av lumen. Välj ' åtgärd ' och registrera den omkrets och area.
- Subtrahera omkretsen av luminala kupén från omkretsen av myoepithelial facket för att få omkrets av duktal epitel. Subtrahera området av luminala kupén från området i myoepithelial facket att få området av duktal epitel.
- Immunohistokemi analys
- Ladda upp brightfield bilder till en analytisk programvara, såsom ImageJ eller FIJI svit.
Obs: Detta protokoll beskriver stegen för färgning analys med hjälp av ImageJ och IHC Toolbox plugin. - Öppna verktygslådan IHC från menyn Plugin. I den " väljer modell " kombinationsruta att öppnas, Välj lämplig fläcken (dvs H-DAB, fso, etc.). Välj den " färg " möjlighet att isolera fläcken. Detta kommer att öppna en resultatfönstret.
Obs: Denna metod är lämplig om ett protein av intresse ligger i de extracellulära eller cytosoliska utrymmena eller är bundet till plasmamembranet. Om proteinet av intresse är kärnkraft, välja " Nuclei " uppmanas att plugin för att analysera bilden för positivt färgade kärnor. - Använda den färg väljaren Skjut för att säkerställa ordentlig isolering av fläcken utan bakgrund inbegripandet eller överdriven fläcken uteslutandet.
Obs: Om det automatiska läget inte kan identifiera fläcken eller inte leder till acceptabla bilder, rita en fyrkant regionen av intresse (ROI) över en identifierad målat regionen. Välj IHC verktygslådan fönstret, " tåg " direkt plugin till lämpliga målet. - Konvertera bilden till 16-bitars. Gå till bild → typ → 16 bitars.
- Tröskel bilden. Gå till bild → justera → Auto tröskel.
- Ange måttskalan bild genom att rita en linje ROI direkt över skalstapeln i bilden sedan tilldela längd. Om du vill ange skalstapeln, gå till analysera → ange skala. Mata in antalet bildpunkter per önskad enhet av längden (e.g. 120 pixlar per 50 µm).
- Mäter det resulterande området och grå medelvärde. Gå till analysera → ange mätningar och samla mätningen genom att klicka analysera → åtgärd.
- Ladda upp brightfield bilder till en analytisk programvara, såsom ImageJ eller FIJI svit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Honmöss har 5 par mjölkkörtlar. Specifikt, finns det ett par av livmoderhalscancer körtlar (#1), två par bröstkorg körtlar (#2 och #3), ett par av buken körtlar (#4), och 1 par av inguinal körtlar (#5) (figur 1A). Här, isolerade vi #4 körtlar som de är lätt identifierbara. I vissa fall isolerades både #4 och #5 körtlar tillsammans som skillnaden mellan två var svårt. För att isolera intakt #4 buken var mjölkkörtlar, pelt nålas och noga skiljas från underliggande bukhinnan, avslöjar platsen för #4 körtlar markerad med en pil (bild 1B). #4 körtlar var noggrant censurerade och inspekteras avseende förekomsten av eventuella kvarvarande subkutan eller muskel vävnad. Även om dessa inte var identifieras i vår isolerade körtlar (figur 1C), vi notera väsentligen mer subkutan vävnad i Fibronektin-färgade körtlar från vävnad block där vävnaden inte hade avlägsnats före snittning (t.ex. ytliga) (figur 1D) kontra körtlar som 100-200 µm vävnad från vävnaden block hade tagits bort före snittning (t.ex. djup) (figur 1E). För att få en bättre förståelse av vävnad fibros i bröstkörteln svar på exogena och endogena faktorer, prövaren kanske vill jämföra fibros i ytliga kontra djupa snitt av körteln. För andra analyser, kan det vara fördelaktigt för prövaren avsnitt vävnad blocket i hälften innan fortsätter till vävnad skivning och färgning om betydande subkutan eller muskelvävnad är närvarande efter körtel dissektion.
Efter isolering, var körtlar fast i 10% neutral buffrad formalin, bearbetas och sektioneras för färgning. De steg som används för att analysera kollagen intresseanmälan förutom andra proteiner avbildas i figur 2A. Representativa prover från ECM proteiner kollagen, Fibronektin och tenascin-C visas i figur 2B. Pilarna i var och en av bilderna visar förekomsten av kanalerna i dessa vävnader (figur 2B).
För att kvantifiera morfologiska egenskaper av kanaler, är det viktigt att behandla de histologiska sektioner med omsorg eftersom felaktig hantering kan resultera i skadade vävnader och kanaler som inte är mätbara. Exempel på felaktig hantering kan köras buffertar eller vatten direkt på vävnaderna, använder buffertar på en felaktig temperatur eller lämnar vävnadsprover i hårda buffertar som natriumcitrat och ättiksyra under en längre tidsperiod än vad som anges i protokollet. Ett exempel på en vävnad avsnitt i vilken vävnad skada har uppstått visas i figur 3A. Här, kan omfattande skador på vävnaden observeras lätt som brott punkter i kanaler (figur 3A). En sektion som denna kan inte användas för analyser av duktal strukturer. Ett exempel på ett intakt vävnad exemplar där trummorna är mätbara och kvantifierbara visas i figur 3B. Här, trummorna är inte bara kännetecknas av omgivande Fibronektin-färgade stroma, men kännetecknas också av närvaron av en tät population av epitelceller som kantar lumen av trummorna (figur 3B). Det är viktigt att notera att musen bröstkörteln under utveckling, innehåller en enda kanal vid födseln från som laterala sekundära grenar gro, bildar ett mer komplicerat duktal träd som genomgår en serie av förgrening och regression med varje östruscykel 13. även om vi inte har tagit hänsyn till östruscykel av djuren i dessa experiment, utredaren kan vilja göra det för att få information om duktal nummer oberoende av östruscykel. Utredaren är avses ett protokoll i Caligioni14 där scenen av östruscykel synligt kan bestämmas. När det gäller kvantifiering av kanaler, närvaron av flera duktal strukturer i dessa histologiska avsnitt är inte tecken på flera unika kanaler, men snarare tyder på ett mer utvecklat duktal träd som följd av duktal utväxt. För att räkna upp kanaler, kan man använda en bild analys programvara såsom ImageJ (NIH) för att tilldela ett nummer till enskilda kanaler i en vävnad avsnitt. Utredaren vill räkna upp trummorna eftersom förändringar i duktal nummer, som kan vara vägledande i utvecklingsmässiga abnormiteter eller ett sjukdomstillstånd. När det gäller vår studie, vi tror att det ökade antalet kanaler, ett resultat av duktal utväxt, är relaterad till förlusten av caveolin-1 som kan driva aberrant uttryck av tillväxtfaktorer såsom insulin tillväxtfaktor 1 (IGF-1), kända medlare av mus duktal tillväxt 15.
Utöver förekomsten av intakt kabelrör innehåller flera kanaler grenar, anges med pilar i en Fibronektin-färgade avsnitt (figur 3C). I syfte att denna analys bör dessa duktal grenar inte betraktas som en separat duktal struktur. Samtidigt utvärdera och mäta kanaler, är det viktigt att skilja kanaler från vaskulära strukturer. Vaskulära strukturer kan inte bara identifieras genom närvaron av en endothelial enskiktslager foder lumen, men också av närvaron av en nukleär, eosinofil strukturer vägledande av röda blodkroppar (RBC) inom lumen (figur 3D). Även om förekomsten av eosinofil strukturer inom lumen anger RBC och föreslår kärlsystemet, är förskjutningen av RBC under körteln samling i hela vävnadssnitt möjligt. Det är tillrådligt att bekräfta vaskulära strukturer endothelial märkpenna CD31. Ett exempel på en histologisk avsnitt fläckade CD31 visas (figur 3D). För att kvantifiera duktal omkrets och area, kan vektorer i ImageJ (NIH) tilldelas till beskriva den myoepithelial gränsen (omkrets) och luminala gränsen i α-SMA-färgade vävnad avsnitt. Α-SMA, en markör av glatta muskelceller, användes som det fläckar myoepithelial celler som linje kanaler. I bilden, visar den röda linjen den myoepithelial gränsen medan den blå linjen visar den luminala gränsen (figur 3E). Regionen mellan de stromaceller och luminala utrymmen, visas i schematiskt, är det område som upptas av den totala stromal vävnaden plus duktal epitelceller (figur 3E).
Figur 1 : Isolering av hela, intakt mjölkkörtlar för histologiska analyser. (A) efter djuroffer, pelt bort noggrant och nålas tillbaka för att exponera mjölkkörtlar ligger mellan dermis och bukhinnan. Schematiskt visar de relativa positionerna för livmoderhalscancer (#1), bröstkorg (#'s 2 och 3), buksmärta (#4) och inguinal (#5) körtlar. (B) The #4 buk körtlar, och visas i dissekerade djuret av de röda pilarna, var isolerade. (C) representativa exempel på #4 buk körtlar isolerade från dräktiga kvinnliga B6 mus. (D) betydande subkutan vävnad från körtlar där vävnaden inte hade tagits bort från paraffin blocket innan snittning (t.ex. ytliga) var uppenbart efter färgning för ECM protein Fibronektin. (E) Considerably observerades mindre subkutan vävnad och mer Fibronektin målat stromal vävnad från körtlar där 100-200 µm vävnad hade avlägsnats från paraffin blocket innan snittning (t.ex. djup). Histologiska sektioner är från representativa prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Histological beredning och färgning. (A) Schematisk bild av de steg som används för histologisk bearbetning. En annan serie av steg utnyttjades för analyser av kollagen uttryck. (B) representativa bilder av ECM proteiner kollagen, Fibronektin och tenascin-C från körtlar i dräktiga caveolin-1 bristfällig hondjur. Pilar för kollagen, Fibronektin och tenascin-C indikerar tät stroma foder trummorna. FSO: Picrosirius Red. FN: Fibronektin. Tio-C: tenascin-C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analyser av duktal arkitekturen. (A) en Fibronektin målat avsnitt illustrerar omfattande vävnadsskador. Detta markeras av närvaron av raster i duktal strukturer (pilar). (B) en Fibronektin målat avsnitt illustrerar närvaron av intakt duktal strukturer som markeras av närvaron av lumen omgiven av ett eller flera lager av epitelceller och en omgivande stroma. Pilarna anger individuella duktal strukturer. (C) en Fibronektin-färgade bilden belyser förekomsten av duktal grenar, som anges med pilar. Notera kontinuiteten i dessa med lumen större duktal struktur. (D) vaskulära strukturer (röda pilar), kännetecknas av ett enda lager av celler och närvaron av en-nucleated eosinofil strukturer vägledande av röda blodkroppar, observeras ofta i närhet med trummorna (svart pil). Låg förstoring visas i bilden till vänster och en motsvarande hög förstoring-bilden visas till höger. Dessa bilder var fläckade av H & E och tenascin-C. CD31 användes som en positiv markör för de endothelial celler som kantar de vaskulära strukturerna. Visas är en stor vaskulär struktur i vilken CD31 positiva celler är synliga foder lumen av fartyget. Låg förstoring visas i bilden till vänster och en motsvarande hög förstoring-bilden visas till höger. (E) duktal omkrets mättes i en α-SMA-färgade bild med en vektor (visas i rött) för att beskriva myoepithelial facket medan duktal området mättes med en vektor (visas i blått) att beskriva luminala facket. Regionen mellan de stromaceller och luminala utrymmen klassificerades som duktal området. Skalstapeln = 50 µm. Schematisk bild av en duktal struktur som lyfter fram de områden som mättes i omkrets och area. Tio-C: tenascin-C. Avsnittet histologiska i figur E ändrades från: Thompson C et al. 16 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tidningen, har vi beskrivit en teknik för att isolera intakt mus mjölkkörtlar för efterföljande histologiska analyser av ECM uttryck och duktal morfologi. När det gäller analyser av duktal morfologi möjliggör denna metod snabb utredning av duktal arkitektur baserad bort av färgade histologiska sektioner. Andra metoder för duktal analyser är beroende av injektioner av färgämnen att aktivera visualisering av duktal träd, metoder som kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande.
I bröstcancer, har ECM rapporterats vara onormal. 1 , 2 , 6 , 9 särskilt, förändringar i konsumtionsmönster, överflöd eller cross-linking ECM har rapporterats att påverka tumör progression, metastaser och terapi motståndet3,4,6,7 ,8,9. Dessutom har förändringar i ECM miljö också rapporterats att ändra duktal epitelial cell morfologi och spridning17, vilket kan leda till en situation som gynnar tumör inledande. Medan vi utnyttjas en caveolin-1 bristfällig djurmodell för att bedöma förändringar i ECM uttryck och duktal morfologi efter förlust av caveolin-1, kan man tillämpa denna metod i någon musmodell. För att bedöma ECM uttrycksmönster och duktal arkitektur, beskriver vi en teknik för att isolera hela, intakt mjölkkörtlar för efterföljande histologiska analyser. Resultaten från denna metod gav robusta analyser av ECM uttryck och glandular morfologi. Vi fann att analysera ECM uttryck, speciellt Fibronektin, från sektioner där 100-200 µm ytlig vävnad togs bort innan snittning och färgning gav en mer fullständig bild av glandular fibros. Vi hittade dessutom att användning av åsna serum i motsats till BSA gav bättre kvalitet histologiska prover där icke-specifik färgning kraftigt reducerades.
För analyser av duktal arkitekturen är det viktigt att använda sektioner där vävnader är intakta och innehåller kanaler där brott punkter, ett resultat av felaktig vävnad hantering inte och snittning, uppenbart. Dessutom är det viktigt att korrekt skilja duktal grenar, en annan parameter som en utredare vill mäta och vaskulära strukturer som enkelt kan identifieras genom deras enskiktslager endotel och eosinofil strukturer inom den lumen förutom färgning med CD31. Medan trummorna observerades i avsnitten färgas för olika ECM proteiner, myoepithelial markör αSMA och H & E från, som belyste den cellulära delen av trummorna, uppräkning av kanaler och alla associerade grenar är uppnåeligt med H & E färgade vävnadssnitt ensam. För mer detaljerade analyser av duktal morfogenes eller analyser av förekomst av pre-neoplastisk eller neoplastiska lesioner, kan en utredare vill utnyttja confocal imaging för att utvärdera levande ex-vivo vävnader. I detta fall kan samma teknik där hela körtlar är censurerade tillämpas med fixering och vävnad bearbetningssteg elimineras.
Kritiska steg i detta protokoll omfatta användning av kirurgiska micro luppar som inte bara aktiverat exakt identifiering av #4 buk körtlar, men dessutom tillåtet dissektion av körteln från ovanliggande dermis och underliggande bukhinnan. Uteslutandet av betydande subkutan vävnad och muskler minskas adipose-associerade inblandning i färgning och histologi. Dessutom, för att bättre identifiera ECM uttryck förändringar i körteln, funnit vi det lämpligt att ta bort 100-200 µm av vävnad block, som hjälpte eliminera kvarstående fettvävnad. Även om hela bröstkörteln isolering ger information om vävnad brett förändringar i stromaceller proteinuttryck och duktal morfogenes, beskrivs tekniken är begränsad till analys av seriell avsnitt från fasta, paraffin inbäddat vävnader. Att fastställa graden som skett förändringar i duktal förgrening, hela mount avbildning av levande, ex-vivo vävnader skulle vara nödvändigt. Här kunde en utredare använda Cre-Lox för att utforma anpassade, villkorligt fluorescerande reporter konjugationer att studera körtel specifika proteininteraktioner eller utnyttja ett färgämne för att belysa duktal trädet före imaging18. Utöver detta skulle ytterligare analys av proteiner av intresset för helheten av körteln kräva användning av western blot eller masspektrometri eller andra hög genomströmning tekniker såsom cross-linking immunoprecipitation (klipp) eller kromatin immunoprecipitation (ChIP). I detta fall skulle hela körtlar vara dissekeras, sektionerad i små bitar och bearbetade med detta för de efterföljande analyserna. Dessutom kan man också använda fluorescerande imaging på vävnadssnitt. Denna teknik skulle vara perfekt för att analysera flera proteiner och protein uttryck samtidig lokalisering i samma vävnaden.
Sammanfattningsvis beskriver vi en teknik som erbjuder snabba isolering av hela, intakt mjölkkörtlar och ger ytterligare detaljer om histologisk bearbetning och duktal analyser. Framtida tillämpningar av denna teknik kunde undersöka ECM uttryck och associerade ändringar i duktal morfologi i tumör-bärande djur. Vidare kan analyser av kollagen orientering och fiber diameter, information som kan vara användbara för att analysera vävnad densitet, också utföras på fso färgade sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna April Wiles och Dr. Roger Broderson för hjälp med animaliskt obduktion och körtel isolering, respektive. Finansiering för detta arbete stöddes av Philadelphia College of Osteopatisk medicin Centers för kroniska sjukdomar av åldrande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L.
- Caligioni, C. S.
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
