Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56515
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 2, 1
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

تم تطوير طريقة بسيطة للحصول على استنساخ ناغورني-كاراباخ وخلية T من المرضى كايبف بكفاءة عالية وكمية صغيرة من الدم المحيطي، وجرعة منخفضة من إيل-2.

Abstract

قد وصفت عددا من الأساليب إنشاء خطوط الخلايا ناغورني كاراباخ للطن من المرضى الذين يعانون من مرض سرطان الغدد الليمفاوية أو ليمفاوية. هذه الأساليب تستخدم الخلايا المغذية، وتنقية الخلايا T أو ناغورني كاراباخ مع قدر من 10 مل دم، أو جرعة عالية من إيل-2. هذه الدراسة ويعرض طريقة جديدة مع استراتيجية قوية وبسيطة لإنشاء خطوط ناغورني-كاراباخ وخلية T باستزراع الطرفية الدم الخلايا وحيدات النوى (PBMC) مع إضافة إيل-2 البشري الماشوب (رحيل-2)، ويستخدم أقل من 2 مل دم الكامل. الخلايا يمكن أن تنتشر بسرعة في غضون أسبوعين، ويستمر لمدة أكثر من 3 أشهر. مع هذا الأسلوب، أنشئت خطوط ناغورني كاراباخ أو خلية تي 7 مع نسبة نجاح عالية. هذا الأسلوب بسيطة وموثوق بها، وينطبق على إنشاء خطوط الخلايا من المزيد من حالات سرطان الغدد الليمفاوية الخلية كايبف أو ناغورني كاراباخ/تي.

Introduction

فيروس ابشتاين-بار (EBV) في كل مكان ويصيب ليس فقط خلايا ب، ولكن أيضا تي والطبيعية الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل، الذي يسبب عددا من الأمراض المرتبطة EBV ناغورني كاراباخ/تي ليمفاوية (LPD) وسرطان الغدد الليمفاوية/اللوكيميا، مثل هيموفاجوسيتيك EBV المرتبطة ليمفوهيستيوسيتوسيس و extranodal ناغورني كاراباخ/تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية، ونوع الآنف وهيدرا فاكسينيفورمي مثل الأورام اللمفاوية العدوانية ناغورني-كاراباخ خلية اللوكيميا1،،من23. ومن بين هذه هو حادة نشطة EBV (سكايبف) الأمراض المزمنة، وهو الحادث أساسا في شرق آسيا، والذي يعتبر الآن LPD الناجم عن التوسع في الاستنساخ من المصابين EBV T أو ناغورني كاراباخ الخلايا4،5،6، 7، لكن من دون نقص المناعة الظاهر موجودة في كثرة الوحيدات العدوائيه (IM)-مثل الأعراض بما في ذلك الحمى وضخامة وتضخم العقد اللمفية والخلل في الكبد مستمر أو متكرر، فضلا عن ارتفاع EBV-الحمض النووي تحميل في الدم المحيطي8،9. المرضى الذين يعانون من كايبف سوء تشخيص10،11، والمرضية، ودور EBV غير واضح. ولذلك، الخلية الخطوط المشتقة من الأمراض المرتبطة EBV ناغورني كاراباخ/تي ليمفاوية والأورام الليمفاوية مفيدة جداً كنماذج الخلية لتوضيح إليه EBV الناجم عن انتشار الخلايا T أو ناغورني كاراباخ وعلاقتها مع ارتفاع عدد حالات سرطان الدم أو سرطان الغدد الليمفاوية.

وحتى الآن، تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا مع تقنيات مختلفة12،،من1314،،من1516. خط خلية بشرية ناغورني-كاراباخ، ناغورني كاراباخ-يس، أنشأت من ناغورني كاراباخ الخلية اللمفاوية/اللوكيميا، استزراع يشترك مع خط خلية stromal ماوس كالتغذية، وحضور رحيل-2 بتركيز 20U كل مل15. KAI3 وكان آخر خط الخلية ناغورني كاراباخ المنشأة من سكايبف مع خط الخلية ليمفوبلاستويد الذاتي (LCL)، أو المرضى الذين يعانون من حساسية شديدة البعوض من الخلايا ب غيرت EBV، كالخلايا المغذية وإضافة لرحيل-2 في 100U/مل16. SNK6 و SNT8 مستمدة من أنسجة الورم الأنفي ناغورني كاراباخ/تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية المرضى عن طريق إضافة جرعة عالية من رحيل-2 (700U/mL)12. مع تقنية مماثلة، وكانت الخلية SNK-1 من المرضى كايبف، مثقف من ببمك عن طريق إزالة خلايا تي ومشيراً إلى 700U/مل من رحيل-213،17. وأنشئت عن طريق إزالة خلايا CD4 + و CD8 + الخلايا18SNT13 و SNT15. حتى الآن، الأخرى خطوط الخلية خلية تي وناغورني كاراباخ من المرضى LPD EBV ناغورني كاراباخ/تي كل ما وضعت مع هذا الأسلوب19.

عيوب الأساليب القائمة المذكورة أعلاه تتضمن توظيف الخلايا المغذية، واشتراط جرعة عالية من إيل-2، والاستفادة من قدر 10 مل كل الدم، أو تنقية الخلايا NK/T، والتي صعبة للغاية في العيادة المقرر أن ضرورة التحقق من أي نوع من أنواع الخلايا أن EBV خفية يصيب قبل بداية للثقافة. كما كايبف يحدث أساسا في الأطفال في آسيا، 10 مل الدم لا يسهل الحصول عليها في جميع المناطق. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة بسيطة جديدة مع نسبة نجاح عالية إنشاء خطوط ناغورني كاراباخ و/أو خلية T باستزراع ببمك من كايبف من المرضى باستخدام جرعة منخفضة من rhIL2 ووحدة تخزين 2 مل من الدم كله دون تغذية الخلايا. وقد أثبتت نتائج هذه الطريقة كفاءة عالية وتوفير الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي، الأكاديمية الصينية للعلوم، والبروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لرفاهية الإنسان.

ملاحظة: انظر الشكل 1 لتخطيطي لسير العمل.

1-عزل ببمك من المرضى كايبف

  1. تنقية ببمك الأولية من 2 مل دم الكامل للمرضى الذين كايبف بالتدرج (مثلاً، فيكل-البلاك) الطرد المركزي اتباع إرشادات الشركة المصنعة. وبدلاً من ذلك، ذوبان الجليد PBMC cryopreserved من النتروجين السائل مع المتوسط RPMI 1640.
  2. إضافة 2 ميليلتر من تريبان الأزرق (0.4 في المائة) إلى 18 تعليق خلية ميليلتر، والانتظار لمدة 3 دقائق لوصمة عار الخلايا ونقل التعليق على لوحة العداد الخلية وقياس تركيز للخلايا والبقاء مع عداد الآلي خلية.
  3. إعداد تعليق خلية في كثافة من 2-3 × 106 خلايا/مل استكماله بالكامل المتوسطة الثقافة RPMI 1640 الذي يحتوي على 20% مصل الإنسان (الحرارة غير نشط في 56 درجة مئوية)، 2 مم ل الجلوتامين، والمضادات الحيوية (100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 100 يو/مليلتر البنسلين). البذور 1 مل تعليق PBMC الواحدة وكذلك في لوحات ثقافة الخلية 24-جيدا.
  4. إضافة 150 من رحيل-2 ش كل بئر.
  5. وضع لوحات الثقافة في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
  6. في اليوم 2، نلاحظ مورفولوجيا الخلايا تحت مجهر (200 X التكبير)؛ الخلايا في حالة جيدة عندما تكون مشرقة وجولة.

2-توسيع نطاق الخلايا وترقيم الخلايا قابلة للتطبيق

  1. مراقبة مورفولوجيا الخلايا تحت مجهر (200 X التكبير)، ورصد حالة نمو الخلايا بترقيم الخلايا قبل تغيير المتوسطة: إضافة 2 ميليلتر من تريبان الأزرق (0.4 في المائة) إلى 18 تعليق خلية ميليلتر، وحساب تركيز للخلايا (انظر 1-2، الشكل 2).
  2. تجاهل 500 ميليلتر من المتوسط في صفيحة 24-جيدا، وإضافة 500 ميليلتر جديدة كاملة الثقافة المتوسطة. إضافة 150U رحيل-2 كل بئر.
  3. تغيير في المتوسط مرتين في أسبوع كما هو الحال في الخطوة 2، 2.
  4. رسم منحنى نمو الخلية (الشكل 3).
  5. عندما يتجاوز تركيز خلايا قابلة للحياة 5 × 106/mL، تقسيم الخلايا إلى آبار جديدة بتركيز 1-2 × 106 خلايا/مل في كل بئر. تستغرق هذه العملية من 2-4 أسابيع.

3-خلية فينوتيبينج بالتدفق الخلوي

  1. عندما اتسع نطاق الخلايا، جمع 1 × 106 خلايا لتحديد تعمل خطوط الخلية. الطرد المركزي خلايا في 240 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الخلايا NK/T سوف يعجل في الجزء السفلي من الأنبوب).
  2. تجاهل المادة طافية، وتغسل الترسيب بإضافة 7 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 x ز في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
  3. إضافة 200 ميليلتر مصل الدم البشري لكل أنبوبة ومزيج جيد واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. الطرد المركزي خلايا في ز x 240 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في 1 × 106/mL مع ببسا الباردة (PBS+0.2%BSA). تقسيم الخلايا في أنابيب 5، كل أنبوبة تحتوي على خلايا5 × 10 2.
  5. خلايا أجهزة الطرد المركزي في ز x 240 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا مع ببسا المخزن المؤقت أو ببسا التي تحتوي على 10 ميليلتر PE (أو PE-Cy7) والمسمى 10 ميليلتر فيتك الأجسام المضادة وصمة عار مستقبلات الخلية من الخلايا T أو ناغورني كاراباخ على الجليد كما هو مبين في الشكل4. يتم استخدام الخلايا علقت مع ببسا المخزن المؤقت كعنصر سلبي.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 20-30 دقيقة على الجليد في الظلام.
  7. تغسل الخلايا مرتين مع ببسا الباردة، وإعادة تعليق الخلايا مع 300 ميليلتر ببسا الباردة.
  8. تحليل النمط الظاهري الخلية مع سيتوميتير تدفق.
    1. قم بإعداد Cytometer التدفق في حالة "إنشاء ورقة العمل". إعداد قالب تجريبي مع مؤامرة دوت يعرض المبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC).
    2. تحميل أنبوب ايستب التحكم الأمثل الفولتية منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، وتحسين قيمة العتبة منتدى التعاون الأمني لإزالة الحطام دون التداخل مع السكان خلية للفائدة. حذف كافة المعلمات فيما عدا منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، فيتك، PE و PE-Cy7.
    3. أداء التعويض باستخدام عنصر التحكم ايستب وعنصر إيجابي واحد في كل مجموعة التحليل 2-لون.
    4. تحميل عينات وإنشاء CD19 مقابل الدكتور هلا، دوت CD8 CD4 و CD56 مقابل CD16 CD3 مقابل CD16 مؤامرات عرض السكان مختلفة من الخلايا.
      ملاحظة: استخدمت ببمك لأداء تعويض استخدام عنصر التحكم السلبية/ايستب ومراقبة إيجابية واحدة. واستخدمت الفلورة 2-اللون مع تدفق سيتوميتير بشكل روتيني لتحليل التعبير عن علامات السطحية. الأجسام التالية مدرجة: المضادة-هلا-الدكتور ومكافحة CD4 والمضادة-CD16 مترافق مع fluorescein isothiocyanate (فيتك)، CD8 المضادة، ومكافحة CD56، CD3 مترافق مع فيكوريثرين (PE) ومكافحة-CD19 مترافق مع PE-Cy7.

4-التوسع وتجميد الخلايا NK/تي

  1. تغيير الوسط عند اكتمال تحليل النمط الظاهري الخلية. بعناية إزالة نصف من المادة طافية وتجنب لمس الخلايا في الجزء السفلي من اللوحة. إضافة نفس الحجم من المتوسطة ثقافة جديدة تحتوي على 300 من رحيل-2 يو/مليلتر إلى لوحات الخلية.
  2. تغيير نصف المتوسط كل 3 أيام (ك 2.2) حتى الخلية مجموعات مرئية بوضوح تحت المجهر (الشكل 2). عادة ما تستغرق هذه العملية من 2-3 أسابيع.
  3. نقل الخلايا من لوحات 24-جيدا في قوارير الثقافة T25 بعد خلط آبار مختلفة من نفس النسب. مضاعفة حجم متوسط الثقافة، فإنه يتحول إلى اللون الأصفر حتى حجم المتوسط توسع إلى 10-15 مل. إضافة رهيل-2 مع تركيز 150 يو/مليلتر.
  4. تغيير متوسطة 24 ساعة قبل تجميد بعد 2-3 أسابيع المتنامية، عند الخلية كتلة يمكن ملاحظتها بالعين المجردة. قياس تركيز الخلية مع عداد خلايا.
  5. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 240 x ز، وإعادة تعليق خلية بيليه في كثافة من 5-10 × 106 خلايا/مل مع الحل الأرصدة المجمدة التي تحتوي على مصل بقرى الجنين 90% و 10% ديميثيلسولفوكسيدي ([دمس]). تجميد بمعدل 1 درجة مئوية في كل دقيقة إلى-80 درجة مئوية ومن ثم نقل مباشرة إلى النتروجين السائل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد 3 أيام الثقافة أثناء إنشاء خطوط الخلايا والخلايا متعددة الأشكال تبدأ في الظهور (الشكل 2). بعد 7 أيام، خلايا تنمو بسرعة، كما يتم زيادة عدد وصلاحية الخلايا بمعدل مرتفع (الشكل 3). مجموعات صغيرة من الخلايا تكون واضحة للعيان بعد 10-14 يوما وتنمو، عندما يمكن أن يتجاوز تركيز الخلية 3-6 × 106. في هذه الفترة، ينبغي توسيع نطاق الخلايا بتقسيم آبار اثنان أو ثلاثة من لوحة الثقافة. حوالي شهر في وقت لاحق، مرة واحدة يبلغ عدد الخلايا 3-5 × 107، العد عالية بما يكفي للحفاظ على.

مسألة هامة أخرى تحديد تعمل عند قد تم استزراع الخلايا بنجاح. نتائجنا تشير إلى أن تي (L196) والخلايا ناغورني كاراباخ (M296) يمكن أن تكون مثقف بالطريقة الموصوفة أعلاه (الشكل 4)، ويمكن إنشاء خطوط الخلايا مع هذه التقنية، كما نمت الخلايا أكثر من 3 أشهر في حالة جيدة.

Figure 1
رقم 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل. اليوم الأول، جمعت التخثر الدم من المرضى كايبف، ثم ببمك كانت معزولة ومثقف مع المتوسط 1640 الذي يحتوي على 20% مصل الدم البشري و 150U/مل من رحيل-2. كانت تزرع الخلايا NK/تي في 37 درجة مئوية حضور 5% CO2. بعد 2-4 أسابيع استزراع، بدأت الخلايا تنمو بسرعة. عند تجاوز التركيز/mL6 × 10 5، نحن تقسيم الخلايا إلى 2-3 آبار في تركيز من 2 × 106. استمرار الثقافة لمدة 2-3 أسابيع، خلايا نقلوا من لوحة 24-جيدا في قارورة T25 عند الخلية مجموعات كانت مرئية بوضوح تحت المجهر. كريوبريسيرفي الخلايا عند الخلية كتلة يمكن ملاحظتها بالعين المجردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التغييرات الشكلية الخلوية عملية استزراع. الخلايا المستزرعة ولاحظ للمشار إليه بعدد الأيام. خلايا متعددة الأشكال (الأسهم وأشار) كانت مرئية تحت المجهر وضوح بعد 3-7 أيام، والخلايا وبدأت تنمو بسرعة بعد الثقافة 7-14 يوما. وكان التكبير الأصلي للفحص المجهري الخفيفة 200 X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: منحنيات نمو تكاثر الخلايا- بعد 7 أيام من استزراع، بدأت الخلايا تنمو بسرعة (A) ومع بقاء عالية (ب). تم قياس تركيز للخلايا والبقاء العداد الآلي خلية مع الإجراء التالي: إضافة 2 ميليلتر من تريبان الأزرق (0.4 في المائة) إلى 18 ميليلتر من تعليق خلية لتلطيخ والانتظار 3 دقائق ونقل التعليق على لوحة العداد الخلية وقياس للخلايا تركيز وبقاء الخلية مع عداد الآلي خلية. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية لثلاثة من النسخ المتماثلة. L196، Z290، M296، L311 هي أسماء أربعة خطوط الخلايا. هو تركيز انطلاق لقياس منحنى النمو حوالي 3 × 106. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الممثل النابضة استراتيجية لتحليل التدفق الخلوي من خطوط الخلايا L196 و M296- واستخدمت ببمك لضبط الفولتية منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. كان مجموعة الخلايا الحية وواحد عن طريق بوابة ل P1 في المؤامرة منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. واستخدمت ايستب التحكم وعناصر إيجابية واحدة لأداء التعويض. واستخدمت أربعة أزواج من تلطيخ جسم الفلورة 2-لون مترافق لتحليل التعبير عن علامات السطحية. واستخدمت المضادة-هلا-الدكتور و CD19 المضادة للكشف عن خلايا ب، بينما استخدمت المضادة CD3 و CD4 مكافحة CD8 المضادة للكشف عن خلايا تي. CD16 المضادة ومكافحة CD56 استخدمت لتحديد الخلايا ناغورني-كاراباخ. (أ) هو النمط الظاهري L196 CD19-هلا-الدكتور + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +، نوع الخلية الرئيسية هي CD8 +. (ب) M296 هو CD19-هلا-الدكتور + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +، نوع الخلية الرئيسية هو CD16 + CD56 +. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وضعت في هذا البروتوكول، تقنية جديدة لإنشاء خطوط الخلايا ناغورني كاراباخ للطن من الدم كله من المرضى كايبف. بالمقارنة مع الأساليب القائمة، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو بساطته ومتطلباتها فقط كمية صغيرة من الدم، في حين أنه يسلك بمعدل نجاح مرتفع وظروف جيدة لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء خطوط الخلايا NK/تي باستزراع PBMC دون تحديد أنواع الخلايا EBV خفية المصابة في وقت مبكر، كتحديد سوف تستهلك المزيد من الدم والوقت قبل استزراع. وبدلاً من ذلك، يمكن تحليل خطوط الخلايا ويمكن تنقية مختلفة تعمل الخلايا مع التدفق الخلوي بعد إنشاء خط الخلية. إلى جانب ذلك، الأسلوب الذي يستخدم جرعة منخفضة من رحيل-2 ويحتاج أي من الخلايا المغذية. مع هذا الأسلوب، لدينا وضع خطوط الخلية 7 من 8 كايبف المرضى و cryopreserved عليها في غضون شهر. التي لم توضع في خط خلية يمكن الحفاظ عليه على قيد الحياة لأكثر من 5 أشهر دون انتشار كبير، والأسباب الكامنة وراء هذا بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف.

من الضروري أن نلاحظ أن نمو الخلايا يعتمد كلياً على وجود الماشوب البشري إيل-2، وما يتسق مع التقارير السابقة20،21؛ مع لا إيل-2 البشرية، سوف تموت الخلايا في 3 أسابيع. ومن الواضح أن جودة عالية لايل-2 ضروري لتكاثر الخلايا، على الرغم من أن العوامل التي تحدد قدرة التكاثري للخلايا في المختبر لا تزال بحاجة إلى توضيح. الجرعة من إيل-2 يتطلب متغير بين خطوط خلايا مختلفة، على سبيل المثال، 50U/mL مرضية للحفاظ على انتشار M296. ومع ذلك، لم يقدم تركيز الأكثر اقتصادا ويمكن الاعتماد عليها لإنشاء خطوط الخلايا NK/تي في الدراسة؛ وفي الواقع، 150 يو/مليلتر كافية للنجاح.

في هذه العملية من استزراع الخلايا، من العناصر التي تؤثر على نمو الخلايا، صلاحية PBMC الأساسي هو الأكثر أهمية. ولضمان النجاح، ينبغي ببمك طازجة قدر الإمكان. ولا شك أن تركيز خلية يعد عاملاً هاما يؤثر على نجاح استزراع، ولذلك ينبغي أن تكون قيمة العتبة لا أقل من 105 كل مل. إذا كان عدد مجموع الخلايا المعزولة من العينة أقل من 106، استخدام لوحة خلية جيدا المصغر للاحتفاظ بتركيز كاف خلية خيار بديل في الثقافة الأولية. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء خط ناغورني-كاراباخ وخلية T مع حتى كمية محدودة من الدم المحيطي عند استخدام رد فعل الانحلالي لإثراء ببمك كما ذكرت سابقا22. كما ورد في البروتوكول، المصل البشري عاملاً رئيسيا آخر لبقاء الخلية في البداية من الثقافة. يمكننا التكهن بأن بعض المكونات غير معروفة موجودة في المصل الذي غائبة أو مختلفة في مصل الدم البقري الجنين والتي تكون ضرورية لتكاثر الخلايا T/ناغورني كاراباخ.

توجد قيود اثنين من الأسلوب. أولاً، هناك العديد من الأسئلة دون إجابة عن هذا الأسلوب، مثل لماذا وكيف يصيب EBV في ناغورني كاراباخ أو تي الخلايا في فيفو، آليات ناغورني كاراباخ/T الخلية نمو وانتشار في المختبر، وما أنواع الخلايا التي يمكن إنشاؤها في خطوط الخلايا في مريض واحد. على الرغم من أننا يمكن أن لا التحكم في نوع الخلية والنقاء، التي لا تحدد بهذه الطريقة، قد تكون هذه العوامل تعتمد على الخلايا يصيب EBV في المرضى. مع هذا البروتوكول، يمكن إنشاء خلايا ناغورني-كاراباخ وتي في خطوط الخلايا، على الرغم من أن هذا الأسلوب لا يمكن أن الثقافة ترتبط بشكل تفضيلي نوع واحد. ومع ذلك، هناك مجموعة مهيمنة من هذه الخلايا. وثانيا، كان هناك تقرير أن ناغورني كاراباخ وخلية T استنساخ من مرضى LPD أو ناغورني كاراباخ/T اللمفاوية يمكن إنشاء خطوط الخلايا، في حين يمكن الإبقاء على الآخرين لعدة أشهر17. يمكن أن تتكاثر الخلايا التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة ما يزيد عن 3 أشهر، إلا إذا أنها يمكن أن تنتشر إلى أجل غير مسمى بحاجة إلى التحقق من صحتها.

في ملخص، باستخدام هذا الأسلوب، يمكن الحصول بسهولة على المزيد من خطوط الخلايا من الأورام الليمفاوية كايبف أو ناغورني كاراباخ/تي مع كمية محدودة من الدم وجرعة منخفضة من إيل-2 دون تغذية الخلايا. هذه خطوط الخلية سوف تسهم في دراسة الثبات EBV في ناغورني كاراباخ/تي الخلايا والمرضية EBV المرتبطة سرطان الدم أو سرطان الغدد الليمفاوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.Z. و X.Z. و X.C. هي المخترعين المشاركين في انتظار طلبات براءات الاختراع التي تغطي الاستخدامات المحتملة لهذا الأسلوب لإنشاء خطوط الخلايا NK/T وخطوط الخلية المحددة في هذه الدراسة. D.Z.، X.Z.، و X.C. تعلن لا تضارب المصالح المالية في هذا العمل. ويعلن الكتاب المتبقية لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذا العمل كان يؤيد مشاريع مفتاح من الأكاديمية الصينية للعلوم (كفزد-سويسري-205)، "الاستراتيجية البيولوجية موارد تكنولوجيا نظام الدعم للأكاديمية الصينية" للعلوم (كزبزكس-1 وزسب-004)، والمنح من "مؤسسة العلوم الوطنية في الصين" ( 81401640) وشنغهاي صندوق العلوم الطبيعية (14ZR1434800).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Tags

خلية T علم المناعة والعدوى، العدد 133، خطوط الخلايا ناغورني-كاراباخ، خطوط، العدوى المزمنة EBV النشطة، المؤتلف الدم البشري كله في إيل-2، ببمك،
طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T.,… More

Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter