Summary
En enkel metod för att erhålla NK och T-cell kloner från CAEBV patienter utvecklades med hög verkningsgrad, en liten mängd av perifert blod och en låg dos av IL-2.
Abstract
Ett antal metoder har beskrivits att upprätta NK/T cellinjer från patienter med lymfom eller lymfoproliferativa syndrom. Dessa metoder anställd feeder cellerna, renat NK eller T med så mycket som 10 mL blod, eller en hög dos av IL-2. Denna studie presenterar en ny metod med en kraftfull och enkel strategi att etablera NK och T-cell linjer av odlingsskålar perifera mononukleära blodkroppar (PBMC) med tillägg av rekombinant humant IL-2 (rhIL-2), och använder så lite som 2 mL helblod. Cellerna kan föröka sig snabbt i två veckor och upprätthållas för mer än 3 månader. Med den här metoden har 7 NK eller T cell linjer fastställts med en hög framgång. Denna metod är enkel, tillförlitlig och för att upprätta cellinjer från fler fall av CAEBV eller NK/T-cellslymfom.
Introduction
Epstein - Barr virus (EBV) är allestädes närvarande och infekterar inte bara B-celler, men också T och naturliga killer (NK) celler, som orsakar ett antal EBV-associerade NK/T lymfoproliferativa sjukdomar (LPD) och lymfom/leukemi, såsom EBV-associerade hemofagocyterande Lymfohistiocytos, hydroa vacciniforme-liknande lymfom, extranodal NK/T-cellslymfom, nasal typ och aggressiva NK cell leukemi1,2,3. Bland dessa är svår kronisk aktiv EBV (SCAEBV) sjukdom, som är incident främst i östra Asien, och som anses nu vara en LPD orsakas av klonal expansion av EBV-infekterade T eller NK celler4,5,6, 7, men utan den skenbara immunbrist presentera i infektiös mononukleos (IM)-som symptom som feber, hepatosplenomegali, lymfadenopati och leverdysfunktion ihållande eller återkommande, samt hög EBV-DNA lasta i den perifert blod8,9. Patienter med CAEBV har en dålig prognos10,11, och dess patogenes och rollen av EBV är oklart. Därför cellinjer som härstammar från EBV-associerade NK/T lymfoproliferativa sjukdomar och lymfom är mycket hjälpsamma som cellmodeller för att klargöra mekanismen av EBV inducerad NK eller T cell spridning och dess förhållande med hög förekomst av leukemi eller lymfom.
Hittills har flera cellinjer fastställts med olika tekniker12,13,14,15,16. En human cellinje NK, NK-YS, etablerade från NK cell lymfom/leukemi, samtidig odling med en mus stromal cellinje som mataren, och i närvaro av rhIL-2 med en koncentration på 20U per mL15. KAI3 var en annan NK cell linje etablerade från patienter med svår mygga allergi eller SCAEBV med autolog lymfoblastoida cellinje (LCL), B-celler omvandlas av EBV, som mataren cellerna och tillsats av rhIL-2 100U/mL16. SNK6 och SNT8 härleddes från tumörvävnad nasal NK/T cell lymfom patienter genom att lägga till hög dos av rhIL-2 (700U/mL)12. Med liknande teknik var SNK-1 cellen från CAEBV patienter, odlade från PBMC genom att ta bort T-celler och lägga till 700U/mL av rhIL-213,17. SNT13 och SNT15 fastställdes genom att ta bort CD4 + och CD8 + celler18. Hittills, har andra T-celler och NK cellinjer från EBV-NK/T LPD patienter alla utvecklats med denna metod19.
Nackdelarna med de befintliga metoder som nämnts ovan inkluderar anställningen av mataren celler, kravet på en hög dos IL-2, utilizationen av så mycket som 10 mL helblod eller rening av NK/T-celler, som är mycket utmanande i kliniken på grund nödvändigheten av att kontrollera vilka typer av cell att EBV latent infekterar före början till kultur. Som CAEBV förekommer främst hos barn i Asien, är 10 mL blod inte lätt att förvärva i alla regioner. I denna studie har vi utvecklat en ny enkel metod med en hög framgång att upprätta NK eller T cell linjer genom att odla PBMC från CAEBV patienter med en låg dos av rhIL2 och en volym på 2 mL helblod utan matare celler. Resultaten av denna metod har visat sin höga effektivitet och sparar tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den etiska kommittén av Institutet för genetik och utvecklingsbiologi, kinesiska vetenskapsakademin, och protokollet följer anvisningar för mänsklig välfärd.
Obs: Se figur 1 för en schematisk av arbetsflödet.
1. isolering av PBMC från CAEBV patienter
- Rena primära PBMC från 2 mL helblod av CAEBV patienter av lutning (t.ex., Ficoll-plack) centrifugering följa tillverkarens instruktioner. Alternativt, Tina frysförvarade PBMC från flytande kväve med RPMI 1640 medium.
- Tillsätt 2 µL trypan blå (0,4%) i 18 µL cellsuspension, vänta på 3 min att färga celler, överför till cell counter plattan och mäta cellernas koncentration och lönsamhet med en automatisk cell räknare.
- Förbereda cellsuspension på en densitet på 2-3 × 106 celler/mL kompletteras med komplett RPMI 1640 odlingsmedium som innehåller 20% humant serum (värme inaktiverat vid 56 ° C), 2 mM L-glutamin, och antibiotika (100 µg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin). Frö 1 mL PBMC suspension per brunn i 24-väl cell kultur plattor.
- Lägg till 150 U rhIL-2 per brunn.
- Placera kultur plattorna i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- På dag 2, Observera cellmorfologi under ett mikroskop (200 X förstoring); cellerna är i bra skick när de är ljusa och runda.
2. utbyggnad av celler och numrering av viabla celler
- Observera cellmorfologi under ett mikroskop (200 X förstoring) och övervaka villkora av celltillväxt genom numrering cellerna innan du ändrar medium: Tillsätt 2 µL trypan blå (0,4%) i 18 µL cellsuspension, och beräkna cellernas koncentration (se 1.2, Figur 2).
- Kassera 500 µL av medlet i en 24-well platta och tillsätt 500 µL färska komplett odlingsmedium. Lägg till 150U rhIL-2 per brunn.
- Ändra på medellång två gånger i veckan som i steg 2.2.
- Rita cell tillväxtkurvan (figur 3).
- När livskraftig cellernas koncentration överstiger 5 × 106/ml, dela celler i nya brunnar med en koncentration på 1-2 × 106 celler/mL i varje brunn. Denna process tar 2-4 veckor.
3. cell fenotypning av flödescytometri
- När cellerna har expanderat, samla 1 × 106 celler för att avgöra fenotyperna av cellinjer. Centrifugera celler vid 240 x g under 5 minuter i rumstemperatur (NK/T-celler kommer fällningen på botten av röret).
- Tag bort supernatanten, tvätta nederbörden genom att lägga till 7 mL PBS. Centrifugera under 5 minuter vid 240 x g vid rumstemperatur. Upprepa en gång.
- Tillsätt 200 µL humant serum i varje rör, blanda väl och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera celler vid 240 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna på 1 × 106/ml med kall PBSA (PBS+0.2%BSA). Dela celler i 5 rör, varje rör innehållande 2 × 105 celler.
- Centrifugera celler vid 240 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna med PBSA buffert eller PBSA som innehåller 10 µL PE (eller PE-Cy7) och 10 µL FITC märkt antikroppar för att färga cellreceptorer T eller NK celler på isen som framgår av figur 4. Celler upphängd med PBSA buffert används som en negativ kontroll.
- Inkubera cellerna med antikroppar för 20-30 min på is i mörkret.
- Tvätta cellerna två gånger med kallt PBSA, Slamma upp cellerna med 300 µL kallt PBSA.
- Analysera den cell fenotypen med en flödescytometer.
- Ställ in den Flow Cytometer i ”skapa kalkylblad” skick. Ställa in experimentella mallen med en dot tomt som visar framåt scatter (FSC) kontra side scatter (SSC).
- Fyll isotypen kontroll röret för att optimera FSC och SSC spänningar och optimera FSC tröskelvärdet för att eliminera skräp utan att störa cell befolkningen av intresse. Ta bort alla parametrar utom FSC, SSC, FITC, PE och PE-Cy7.
- Utföra ersättning använda kontrollen isotyp och en enda positiv kontroll i varje 2-färg analysgruppen.
- Ladda prover och skapa HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 och CD3 VS CD16 dot-diagram som visar olika populationer av celler.
Obs: PBMC användes för att utföra ersättning med negativa/isotypen kontroll och den enda positiva kontrollen. 2-färg immunofluorescens med flödescytometer användes rutinmässigt analysera uttrycket av yta markörer. Följande antikroppar ingår: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 konjugerat med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 konjugerat med fykoerytrin (PE) och anti-CD19 konjugerat med PE-Cy7.
4. expansion och Frysförvaring av NK/T-celler
- Ändra mediet när cell fenotyp analysen är klar. Försiktigt bort hälften av supernatanten och Undvik att vidröra cellerna längst ned i plattan. Tillsätt samma mängd färskt odlingssubstrat som innehåller 300 U/mL rhIL-2 till cell pläterar.
- Ändra hälften av medlet var 3 dagar (som 2.2) tills cellen kluster är tydligt synliga i Mikroskop (figur 2). Denna process tar normalt 2-3 veckor.
- Överföra cellerna från 24 brunnar till T25 kultur kolvar efter blandning olika brunnar i samma härstamning. Dubbla volymen av odlingsmedium expanderar som det visar gult tills volymen av mediet till 10-15 mL. Lägg till rhIL-2 med koncentrationen av 150 U/mL.
- Ändra medium 24 h innan frysning efter 2-3 veckor växer, när cellen massan kan observeras med blotta ögat. Mäta cellkoncentrationen med en cell räknare.
- Centrifugera cellsuspensionen för 5 min vid 240 x g och resuspendera cellpelleten på en densitet på 5-10 x 106 celler/mL med frysta stamlösning som innehåller 90% fetalt bovint serum och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Frysa i en takt av 1 ° C per min till-80 ° C och sedan överföra direkt i flytande kväve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 3 dagar kultur under etableringen av cellinjer, börja polymorfa cellerna visas (figur 2). Efter 7 dagar växer cellerna snabbt, som både antalet och viabiliteten hos celler höjts i hög hastighet (figur 3). Små kluster av celler är tydligt synliga efter 10-14 dagar växer, när cell kan överstiga 3-6 × 10-6. Under denna period, bör celler utökas genom uppdelning i två eller tre brunnar av kultur plattan. Ungefär en månad senare, när den cell nummer når 3-5 × 107, greven är tillräckligt hög för bevarande.
En annan viktig fråga är att bestämma fenotyperna när cellerna har varit odlade framgångsrikt. Våra resultat tyder T (L196) och NK (M296) celler kan vara odlade av den metod som beskrivs ovan (figur 4), som cell linjer skulle kunna inrättas med denna teknik, som cellerna växte mer än 3 månader i bra skick.
Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet. Den första dagen samlats antikoagulerande blod från CAEBV patienter, då Laboratoriestammar var isolerade och odlade med 1640 medium innehållande 20% humant serum och 150U/mL för rhIL-2. NK/T-cellerna odlades vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2. Efter 2-4 veckor odling, började cellerna att växa snabbt. När koncentrationen översteg 5 × 10 6/ml, har vi delat in celler i 2-3 brunnar på koncentrationen av 2 × 10-6. Fortsätter kulturen för 2-3 veckor, överfördes celler från 24-väl plattan i T25 kolv när cellen kluster var klart synliga i Mikroskop. Frysa celler när cellens massan kan observeras med blotta ögat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: cellulära morfologiska förändringar i processen odlingsskålar. Celler odlade och observeras för angivet antal dagar. Polymorf celler (pilarna pekade) var synlig under mikroskopet klart efter 3-7 dagar, och cellerna började växa snabbt efter 7-14 dagar kultur. Ursprungliga förstoringen för ljusmikroskopi var 200 X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tillväxtkurvorna av cellproliferation. Efter 7 dagars odling, celler började växa snabbt (A) och med hög lönsamhet (B). Cellernas koncentration och livskraft mättes med en automatisk cell räknare med följande procedur: lägga till 2 µL av trypan blå (0,4%) i 18 µL cellsuspension för färgning, vänta 3 min, överför till cell counter plattan och mäta cellernas koncentration och cellviabiliteten med en automatisk cell räknare. Felstaplar är standardavvikelserna för tre repliker. L196, Z290, M296, L311 är namnen på fyra cellinjer. Start koncentrationen att mäta tillväxtkurvan är cirka 3 × 10-6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa gating strategi för flödescytometri Flödesanalys av cellinjer L196 och M296. PBMC användes för att justera FSC och SSC spänningar. Klustret av levande och enda lymfocyter var gated för P1 på FSC och SSC tomt. Isotypen kontroll och enda positiva kontroller användes för att utföra ersättning. Fyra par 2-färg immunofluorescens konjugerad antikropp färgning användes för att analysera uttrycket av yta markörer. Anti-HLA-DR och anti-CD19 användes att upptäcka B-celler, medan anti-CD3, anti-CD4 och anti-CD8 användes för att upptäcka T-celler. Anti-CD16 och anti-CD56 användes för att definiera NK-celler. (A) fenotypen av L196 är CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, den huvudsakliga celltypen är CD8 +. (B) M296 är CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, den huvudsakliga celltypen är CD16 + CD56 +. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, har ny teknik för att fastställa NK/T cellinjer från helblod av CAEBV patienter utvecklats. Jämfört med de befintliga metoderna, är den stora fördelen med denna metod dess enkelhet och dess krav på endast en liten mängd blod, medan den uppvisar en hög framgång och bra villkor för cellernas viabilitet. NK/T cellinjer kan dessutom fastställas av odlingsskålar PBMC utan att fastställa celltyper de EBV latent infekterade i förväg, som bestämning skulle konsumera mer blod och tid före odling. Alternativt cellinjer kan analyseras och olika fenotyper av celler kan renas med flödescytometri efter cell linje etablering. Dessutom metoden använder en låg dos av rhIL-2 och behöver inga feeder celler. Med den här metoden har vi utvecklat 7 cellinjer från 8 CAEBV patienter och fryst tillstånd dem inom en månad. En som inte har utvecklats till en cell fodrar kan upprätthållas vid liv för mer än 5 månader utan betydande spridning, och orsakerna bakom detta måste ytterligare prospektering.
Det är nödvändigt att notera att celltillväxt är strängt beroende av närvaron av rekombinant humant IL-2, vilket överensstämmer med tidigare rapporter20,21. med ingen human IL-2, kommer att cellerna dö i 3 veckor. Tydligen, en hög kvalitet på IL-2 är viktigt för cellproliferation, även om de faktorer som avgör proliferativ kapacitet celler in vitro- fortfarande behöver klargöras. Dosen av IL-2 som krävs varierar bland olika cellinjer, exempelvis 50U/mL är tillfredsställande att bibehålla spridningen av M296. Den mest ekonomiska och tillförlitliga koncentrationen för att upprätta cellinjer som NK/T har dock inte presenterats i studien; 150 U/mL är faktiskt tillräckligt för framgång.
I denna process av cell odling, element som påverkar celltillväxt, är primära PBMC livskraft det viktigaste. För att säkerställa framgång, bör PBMC vara så färsk som möjligt. Utan tvekan cellkoncentrationen är en viktig faktor som påverkar framgångsrik odling, tröskelvärdet bör därför inte lägre än 105 per mL. Om antalet summacell isolerade från provet är mindre än 10 är6, med en mini väl cell platta för att behålla en tillräcklig cellkoncentrationen ett alternativt val i första kultur. NK och T-cell linje kunde dessutom fastställas med även en begränsad mängd perifert blod när du använder Hemolytiskt reaktionen för att berika PBMC som vi rapporterat tidigare22. Som beskrivs i protokollet, är i humant serum en annan viktig faktor för cellöverlevnad i början av kulturen. Vi spekulerar att några okända ingredienser finns i serum som är frånvarande eller olika i fostrets bovint serum och är nödvändiga för proliferation av T/NK.
Det finns två begränsningar av metoden. Första finns det flera obesvarade frågor om denna metod, som hur och varför EBV infekterar den NK eller T-celler i vivo, NK/T cell tillväxt och spridning av in vitro-mekanismer och vilken typ av cell kan bli etablerad in cellinjer i en patient. Även om vi inte kunde kontrollera den celltyp och renhet, vilka inte bestäms av metoden, kan dessa faktorer vara beroende av cellerna EBV infekterar patienter. Med detta protokoll, kunde NK och T celler fastställas i cellinjer, även om denna metod inte kunde prioriterat kultur en typ. Dock finns det en dominerande grupp av dessa celler. För det andra fanns det en rapport som NK och T-cell kloner från patienter med LPD eller NK/T lymfom kunde fastställas till cellinjer, medan andra kunde bibehållas för flera månader17. Celler som erhållits i föreliggande studie kan föröka sig väl över 3 månader, men om de kunde föröka på obestämd tid behöver valideras.
Sammanfattningsvis, med denna metod kan mer cellinjer från CAEBV eller NK/T lymfkörtelcancer lätt erhållas med en begränsad mängd blod och en låg dos av IL-2 utan matare celler. Dessa cellinjer kommer att bidra till studiet av EBV persistens i NK/T-celler och patogenesen av EBV tillhörande leukemi eller lymfom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DZ., X.Z. och X.C. är samtidig uppfinnare på pågående patentansökningar som omfattar potentiella användningsområden av denna metod för fastställande av NK/T cell linjer och de cellinjer som fastställts i denna studie. DZ., X.Z. och X.C. förklarar inget konkurrerande ekonomiska intressen i detta arbete. Återstående författarna förklarar de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av nyckel projekt av kinesiska Academy of Sciences (KFZD-SW-205), strategiska biologiska resurser teknik Support System av kinesiska vetenskapsakademin (CZBZX-1 och ZSSB-004), och genom bidrag från National Science Foundation Kina ( 81401640) och Shanghai naturvetenskap fond (14ZR1434800).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
