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Immunology and Infection

जीर्ण सक्रिय Epstein-बर्र वायरस संक्रमण के साथ रोगियों से NK और टी सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए एक कुशल और सरल तरीका

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56515
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 2, 1
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

CAEBV रोगियों से NK और टी सेल क्लोन प्राप्त करने के लिए एक सरल तरीका उच्च दक्षता, परिधीय रक्त की एक छोटी राशि है, और आईएल-2 की एक कम खुराक के साथ विकसित किया गया था ।

Abstract

NK/टी सेल लाइनों लिंफोमा या lymphoproliferative सिंड्रोम के साथ रोगियों से स्थापित करने के लिए तरीकों की एक संख्या वर्णित किया गया है । इन तरीकों फीडर कोशिकाओं, शुद्ध NK या टी कोशिकाओं के रूप में ज्यादा के रूप में रक्त के 10 मिलीलीटर, या आईएल-2 की एक उच्च खुराक के साथ कार्यरत हैं । इस अध्ययन के साथ एक नई विधि प्रस्तुत करता है एक शक्तिशाली और सरल रणनीति के साथ परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं संवर्धन द्वारा NK और टी सेल लाइनों की स्थापना के साथ रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-2 (rhIL-2), और पूरे रक्त के रूप में छोटे रूप में 2 मिलीलीटर का उपयोग करता है । कोशिकाओं को दो हफ्तों में जल्दी पैदा करना और अधिक से अधिक 3 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है । इस विधि के साथ, 7 NK या टी सेल लाइनों एक उच्च सफलता दर के साथ स्थापित किया गया है । इस विधि सरल, विश्वसनीय है, और CAEBV या NK के अधिक मामलों से सेल लाइनों की स्थापना के लिए लागू/

Introduction

Epstein-बर्र वायरस (EBV) सर्वव्यापी है और न केवल बी कोशिकाओं को संक्रमित करता है, लेकिन यह भी टी और प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं, जो EBV के एक नंबर-जुड़े NK का कारण बनता है/टी lymphoproliferative रोगों (LPD) और लिंफोमा/लेकिमिया, जैसे EBV-संबद्ध hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-लिंफोमा की तरह, extranodal NK/टी-सेल लिंफोमा, नाक प्रकार और आक्रामक NK सेल ल्यूकेमिया1,2,3. इनमें गंभीर जीर्ण सक्रिय EBV (SCAEBV) रोग है, जो मुख्य रूप से पूर्वी एशिया में घटना है, और जो अब EBV-संक्रमित टी या NK कोशिकाओं4,5,6के क्लोनल विस्तार की वजह से एक LPD माना जाता है, 7, लेकिन संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस (IM) में स्पष्ट इम्यूनो मौजूद बिना-बुखार, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, और जिगर रोग सहित लक्षण की तरह लगातार या आवर्तक रूप, साथ ही उच्च EBV में डीएनए लोड परिधीय रक्त8,9. CAEBV के साथ रोगियों को एक गरीब रोग का निदान है10,11, और इसके रोगजनन और EBV की भूमिका स्पष्ट नहीं है । इसलिए, EBV से व्युत्पंन सेल लाइनों-संबद्ध NK/टी lymphoproliferative रोगों और लिंफोमा EBV प्रेरित NK या टी सेल प्रसार और ल्यूकेमिया की उच्च घटना के साथ अपने रिश्ते के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए सेल मॉडल के रूप में बहुत उपयोगी होते है या लिंफोमा.

तिथि करने के लिए, विभिंन तकनीकों के साथ कई सेल लाइनों की स्थापना की गई है12,13,14,15,16। एक मानव NK सेल लाइन, NK-वाईएस, NK सेल लिंफोमा/ल्यूकेमिया से स्थापित किया गया था, सह द्वारा संवर्धन फीडर के रूप में एक माउस stromal सेल लाइन के साथ, और rhIL-2 की उपस्थिति में प्रति मिलीलीटर 20U की एकाग्रता पर15। KAI3 एक और NK सेल लाइन था एक गंभीर मच्छर एलर्जी या SCAEBV ऑटोलॉगस lymphoblastoid सेल लाइन (LCL) के साथ रोगियों से स्थापित, बी कोशिकाओं EBV द्वारा परिवर्तित, फीडर कोशिकाओं के रूप में और rhIL के अलावा-2 पर 100U/एमएल16। SNK6 और SNT8-2 (700U/एमएल) के उच्च खुराक जोड़कर नाक NK/टी सेल लिंफोमा रोगियों के ट्यूमर ऊतकों से व्युत्पंन थे12। इसी तरह की तकनीक के साथ, SNK-1 सेल CAEBV रोगियों से था, PBMC से कल्चरित टी कोशिकाओं को हटाने और rhIL के 700U/एमएल जोड़ने-213,17. SNT13 और SNT15 को हटाकर CD4 + और सीडी 8 + कोशिकाओं को १८ की स्थापना की गई. अब तक अन्य टी सेल और NK सेल लाइनों से EBV-NK/टी LPD रोगियों सभी इस विधि के साथ विकसित किया गया था19.

उपर्युक्त तरीकों के नुकसान फीडर कोशिकाओं के रोजगार, आईएल-2 की एक उच्च खुराक की आवश्यकता में शामिल हैं, के रूप में ज्यादा के उपयोग के रूप में 10 मिलीलीटर पूरे रक्त, या NK/टी कोशिकाओं है, जो बहुत चुनौतीपूर्ण है के कारण क्लिनिक में की शुद्धि कोशिका के किस प्रकार है कि EBV अव्यक्त रूप से संस्कृति के लिए शुरुआत से पहले संक्रमित की पुष्टि की आवश्यकता । के रूप में CAEBV मुख्य रूप से एशिया में बच्चों में होता है, 10 मिलीलीटर रक्त सभी क्षेत्रों में प्राप्त करने के लिए आसान नहीं है । इस अध्ययन में, हम एक उच्च सफलता दर के साथ एक नई सरल विधि विकसित करने के लिए NK और/या CAEBV रोगियों से संवर्धन PBMC द्वारा टी सेल लाइनों की एक कम खुराक का उपयोग कर rhIL2 और फीडर कोशिकाओं के बिना पूरे खून की 2 मिलीलीटर की मात्रा । इस विधि के परिणाम अपनी उच्च दक्षता और समय की बचत साबित कर दिया है ।

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Protocol

यह अध्ययन संस्थान के आनुवंशिकी और विकासात्मक जीवविज्ञान, चीनी अकादमी विज्ञान की एथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रोटोकॉल मानव कल्याण के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

नोट: वर्कफ़्लो के किसी योजनाबद्ध के लिए चित्र 1 देखें ।

1. CAEBV रोगियों से PBMC का अलगाव

  1. ढाल द्वारा CAEBV रोगियों के पूरे रक्त की 2 मिलीलीटर से प्राथमिक PBMC शुद्ध (उदा., Ficoll-पट्टिका) निर्माता के निर्देशों के बाद केंद्रापसारक । वैकल्पिक रूप से, गल cryopreserved PBMC तरल नाइट्रोजन से RPMI १६४० मध्यम के साथ ।
  2. trypan ब्लू के 2 µ एल जोड़ें (0.4%) to 18 µ l सेल निलंबन, कोशिकाओं दाग करने के लिए 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, निलंबन सेल काउंटर प्लेट को हस्तांतरण, और एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की एकाग्रता और व्यवहार्यता को मापने.
  3. 2 के घनत्व पर सेल निलंबन तैयार-3 × 106 कोशिकाओं/एमएल पूरा RPMI १६४० संस्कृति मध्यम 20% मानव सीरम युक्त के साथ पूरक (56 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गर्मी), 2 मिमी एल-glutamine, और एंटीबायोटिक दवाओं (100 µ g/एमएल streptomycin, 100 U/एमएल पेनिसिलिन) । बीज 1 मिलीलीटर PBMC निलंबन के प्रति अच्छी तरह से 24-well सेल संस्कृति प्लेटों में ।
  4. 150 U rhIL-2 जोड़ें प्रति अच्छी तरह से ।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 मशीन में संस्कृति प्लेट रखें ।
  6. 2 दिन पर, एक खुर्दबीन (200X आवर्धन) के तहत सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण; कोशिकाओं को अच्छी हालत में है जब वे उज्ज्वल और गोल कर रहे हैं ।

2. कोशिकाओं का विस्तार और व्यवहार्य कोशिकाओं क्रमांकन

  1. एक खुर्दबीन (200X आवर्धन) के तहत सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण, और मध्यम बदलने से पहले कोशिकाओं की संख्या से सेल वृद्धि की स्थिति की निगरानी: trypan ब्लू के 2 µ एल जोड़ने (0.4%) 18 µ l सेल निलंबन, और कोशिकाओं की गणना की ' एकाग्रता (1.2 देखें, चित्रा 2) ।
  2. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में मध्यम के 500 µ एल त्यागें, और 500 µ एल ताजा पूरा संस्कृति माध्यम जोड़ें । 150U rhIL-2 प्रति अच्छी तरह से जोड़ें ।
  3. मध्यम एक सप्ताह में दो बार बदलने के रूप में 2.2 चरण में ।
  4. कक्ष वृद्धि वक्र (चित्र 3) आरेखित करना ।
  5. जब व्यवहार्य ' कोशिकाओं एकाग्रता 5 × 106/mL से अधिक है, एक अच्छी तरह से 1-2 × 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता में नए कुओं में विभाजित कोशिकाओं । इस प्रक्रिया में 2-4 सप्ताह लगते हैं ।

3. सेल Phenotyping द्वारा फ्लो Cytometry

  1. जब कोशिकाओं का विस्तार किया है, सेल लाइनों के phenotypes निर्धारित करने के लिए 1 × 106 कोशिकाओं को इकट्ठा । कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 240 x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक (NK/टी कोशिकाओं ट्यूब के तल पर वेग होगा) ।
  2. supernatant को त्यागें, 7 मिलीलीटर पंजाबियों को जोड़कर वर्षण धो लें । कमरे के तापमान पर 240 x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक बार दोहराएं ।
  3. प्रत्येक ट्यूब के लिए 200 µ एल मानव सीरम जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गर्मी ।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 240 x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और कोशिकाओं को 1 × 106/mL को कोल्ड PBSA (पंजाब + 0.2% BSA) के साथ फिर से सस्पेंड करें । 5 ट्यूबों, प्रत्येक 2 × 105 कोशिकाओं से युक्त ट्यूब में विभाजित कोशिकाओं ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 240 x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और PBSA बफर या 10 µ एल पीई (या पीई-Cy7) युक्त PBSA के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 10 µ एल FITC लेबल एंटीबॉडी बर्फ पर टी या NK कोशिकाओं के सेल रिसेप्टर्स दाग के रूप में चित्रा 4द्वारा संकेत दिया है । PBSA बफ़र के साथ निलंबित कक्ष एक ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाते हैं ।
  6. अंधेरे में बर्फ पर 20-30 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
  7. कोशिकाओं को दो बार ठंडे PBSA से धोएं, फिर से 300 µ l कोल्ड PBSA के साथ कोशिकाओं को सस्पेंड कर दें ।
  8. एक प्रवाह cytometer के साथ सेल phenotype विश्लेषण ।
    1. "कार्यपत्रक बनाएं" शर्त में प्रवाह Cytometer सेट करें । एक डॉट साजिश है कि आगे तितर बितर (FSC) बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) को प्रदर्शित करता है के साथ प्रयोगात्मक टेंपलेट सेट करें ।
    2. FSC और एसएससी वोल्टेज का अनुकूलन करने के लिए isotype नियंत्रण ट्यूब लोड, और ब्याज की कोशिका आबादी के साथ हस्तक्षेप के बिना मलबे को खत्म करने के लिए FSC थ्रेसहोल्ड मूल्य का अनुकूलन. FSC, एसएससी, FITC, पीई और पीई-Cy7 को छोड़कर सभी मापदंडों को हटा दें ।
    3. isotype नियंत्रण और प्रत्येक 2-रंग विश्लेषण समूह में कोई एकल धनात्मक नियंत्रण का उपयोग कर क्षतिपूर्ति निष्पादित करें ।
    4. नमूने लोड और एचएलए बनाने-DR बनाम CD19, CD4 बनाम सीडी 8, CD56 बनाम CD16 और CD3 बनाम CD16 डॉट भूखंडों कोशिकाओं की अलग जनसंख्या दिखा ।
      नोट: PBMC नकारात्मक/isotype नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग क्षतिपूर्ति प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । 2-रंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रवाह cytometer के साथ नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया था सतह मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण । निम्नलिखित एंटीबॉडी में शामिल हैं: एंटी-एचएलए-डॉ, एंटी-CD4, एंटी-CD16 संयुग्मित विथ fluorescein isothiocyanate (FITC), एंटी-सीडी 8, एंटी-CD56, CD3 संयुग्मित विथ phycoerythrin (पीई), और एंटी-CD19 संयुग्मित विथ पे-Cy7.

4. NK/टी कोशिकाओं के विस्तार और Cryopreservation

  1. कक्ष phenotype विश्लेषण पूर्ण होने पर माध्यम परिवर्तित करें । ध्यान से आधा supernatant निकालें और प्लेट के तल पर कोशिकाओं को छूने से बचें । सेल प्लेटों के लिए 300 यू/एमएल rhIL-2 युक्त ताजा संस्कृति माध्यम के समान मात्रा जोड़ें ।
  2. मध्यम के हर 3 दिन (2.2 के रूप में) जब तक सेल क्लस्टर स्पष्ट रूप से माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 2) बदलें. आमतौर पर, इस प्रक्रिया में 2-3 सप्ताह लगते हैं ।
  3. एक ही वंश के विभिन्न कुओं को मिलाने के बाद T25 संस्कृति कुप्पी के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों से कोशिकाओं स्थानांतरण । संस्कृति माध्यम की मात्रा डबल के रूप में यह मध्यम की मात्रा को 10-15 मिलीलीटर तक फैलता है जब तक पीले रंग बदल जाता है । rhIL-2 को 150 यू/एमएल की एकाग्रता के साथ जोड़ें ।
  4. बदलें मध्यम 24 घंटे के बाद ठंड से 2-3 सप्ताह बढ़ रही है, जब सेल मास नग्न आंखों से मनाया जा सकता है । एक सेल काउंटर के साथ सेल एकाग्रता उपाय ।
  5. 5 मिनट के लिए 240 x जी में सेल सस्पेंशन, और फिर से 5-10 x 106 कोशिकाओं के एक घनत्व में सेल गोली सस्पेंड/जो 90% भ्रूण गोजातीय सीरम और 10% dimethylsulfoxide (DMSO) शामिल जमे हुए शेयर समाधान के साथ । -80 ° c करने के लिए प्रति मिनट 1 डिग्री सेल्सियस की दर से फ्रीज और फिर सीधे तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरण ।

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Representative Results

सेल लाइनों की स्थापना के दौरान 3 दिन संस्कृति के बाद, बहुरूपी कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए शुरू (चित्रा 2). 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं की वृद्धि जल्दी, दोनों संख्या और कोशिकाओं की व्यवहार्यता के रूप में एक उच्च दर (चित्रा 3) में वृद्धि हुई है । कोशिकाओं के छोटे समूहों 10-14 दिन बढ़ रही है, जब कोशिका एकाग्रता 3-6 × 106से अधिक हो सकता है के बाद स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । इस अवधि में, कोशिकाओं को संस्कृति की थाली के दो या तीन कुओं में विभाजन का विस्तार किया जाना चाहिए । के बारे में एक महीने बाद, एक बार कक्ष संख्या 3-5 × 107तक पहुंचता है, गिनती पर्याप्त संरक्षण के लिए उच्च है ।

एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा phenotypes जब कोशिकाओं को सफलतापूर्वक संस्कृति गया है निर्धारित है । हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि टी (L196) और NK (M296) कोशिकाओं (चित्रा 4) ऊपर वर्णित विधि द्वारा प्रसंस्कृत किया जा सकता है, और सेल लाइनों इस तकनीक के साथ स्थापित किया जा सकता है, के रूप में कोशिकाओं को अच्छी हालत में अधिक से अधिक 3 महीने बढ़ी ।

Figure 1
चित्र 1: कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. पहले दिन, थक्कारोधी रक्त CAEBV रोगियों से एकत्र किया गया था, तब PBMC अलग थे और १६४० मध्यम से युक्त 20% मानव सीरम और rhIL-2 की एमएल 150U/ NK/टी कोशिकाओं 5% सह2की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर हो रहे थे । 2-4 हफ्तों संवर्धन के बाद, कोशिकाओं को जल्दी से बढ़ने लगे । जब एकाग्रता 5 × 106 /mL से अधिक है, हम 2-3 कुओं में 2 × 106की एकाग्रता पर कोशिकाओं को विभाजित । 2-3 सप्ताह के लिए संस्कृति को जारी रखने, कोशिकाओं T25 कुप्पी में 24 अच्छी तरह से थाली से स्थानांतरित कर रहे थे जब सेल समूहों सूक्ष्मदर्शी के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे । Cryopreserve कोशिकाओं जब सेल मास नग्न आंखों के साथ मनाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन की प्रक्रिया में संवर्धन. कक्षों को दिनों की इंगित संख्या के लिए कल्चरित और स्वीकार्य है । बहुरूपी कोशिकाओं (तीर बताया) 3-7 दिनों के बाद स्पष्ट रूप से खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहे थे, और कोशिकाओं को 7-14 दिन संस्कृति के बाद जल्दी से बढ़ने लगे । प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए मूल आवर्धन 200X था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल प्रसार के विकास घटता । संवर्धन के 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं को जल्दी से बढ़ने लगे (क) और उच्च व्यवहार्यता के साथ (ख)। ' कोशिकाओं एकाग्रता और व्यवहार्यता निंनलिखित प्रक्रिया के साथ एक स्वचालित सेल काउंटर द्वारा मापा गया: trypan ब्लू के 2 µ एल जोड़ने के लिए (0.4%) धुंधला के लिए सेल निलंबन के 18 µ एल, 3 मिनट रुको, निलंबन सेल काउंटर प्लेट को हस्तांतरण, और कोशिकाओं को मापने ' एकाग्रता और एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ सेल व्यवहार्यता । त्रुटि पट्टियां तीन replicas के मानक विचलन हैं । L196, Z290, M296, L311 चार सेल लाइनों के नाम हैं । विकास वक्र को मापने के लिए शुरू एकाग्रता के बारे में 3 × 106है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सेल लाइनों के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति L196 और M296. PBMC FSC और एसएससी वोल्टेज को एडजस्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया । FSC व एसएससी प्लाट में P1 के लिए लाइव व सिंगल लिम्फोसाइटों का कलस्टर gated किया गया । isotype नियंत्रण और एकल सकारात्मक नियंत्रण मुआवजा प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । 2 के चार जोड़े-रंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस संयुग्मित एंटीबॉडी धुंधला सतह मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया । एंटी-एचएलए-डॉ और एंटी-CD19 बी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया, जबकि एंटी CD3, एंटी CD4, और एंटी सीडी 8 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया. NK कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए एंटी-CD16 और एंटी CD56 का इस्तेमाल किया गया । (क) L196 का phenotype CD19-एचएलए-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + सीडी 8 +, मुख्य कोशिका प्रकार सीडी 8 + है. (ख) M296 CD19-एचएलए-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-सीडी 8 +, मुख्य कोशिका प्रकार आहे CD16 + CD56 +. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, CAEBV रोगियों के पूरे रक्त से NK/टी सेल लाइनों की स्थापना के लिए एक उपंयास तकनीक विकसित किया गया है । मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में, इस विधि का प्रमुख लाभ अपनी सादगी और रक्त की केवल एक छोटी मात्रा की अपनी आवश्यकता है, जबकि यह एक उच्च सफलता दर और सेल व्यवहार्यता की अच्छी स्थिति प्रदर्शित । इसके अलावा, NK/टी सेल लाइनों सेल प्रकार EBV अव्यक्त रूप से पहले से संक्रमित निर्धारित किए बिना संवर्धन PBMC द्वारा स्थापित किया जा सकता है, के रूप में दृढ़ संकल्प और अधिक रक्त और समय की खपत होगी संवर्धन । वैकल्पिक रूप से, सेल लाइनों का विश्लेषण किया जा सकता है और कोशिकाओं के विभिंन phenotypes सेल लाइन स्थापना के बाद प्रवाह cytometry के साथ शुद्ध किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि rhIL-2 की एक कम खुराक का उपयोग करता है और कोई फीडर कोशिकाओं की जरूरत है । इस विधि के साथ, हम 8 CAEBV रोगियों से 7 सेल लाइनों विकसित की है और उंहें एक महीने के भीतर cryopreserved । एक सेल लाइन में विकसित नहीं किया गया है जो एक महत्वपूर्ण प्रसार के बिना अधिक से अधिक 5 महीनों के लिए जिंदा बनाए रखा जा सकता है, और इस आगे की खोज की जरूरत के पीछे कारण ।

यह नोट करना आवश्यक है कि कोशिका वृद्धि सख्ती से रिकॉमबिनेंट मानव IL-2, जो पिछले रिपोर्टों के अनुरूप है की उपस्थिति पर निर्भर है20,21; कोई मानव IL-2 के साथ, कोशिकाओं 3 सप्ताह में मर जाएगा । जाहिर है, आईएल-2 की एक उच्च गुणवत्ता सेल प्रसार के लिए आवश्यक है, हालांकि कारकों है कि इन विट्रो में कोशिकाओं की प्रफलन क्षमता का निर्धारण अभी भी स्पष्ट किया जाना चाहिए । IL-2 की खुराक की आवश्यकता अलग सेल लाइनों के बीच चर रहा है, उदाहरण के लिए, 50U/एमएल M296 के प्रसार को बनाए रखने के लिए संतोषजनक है । तथापि, NK/टी सेल लाइनों की स्थापना के लिए सबसे किफायती और विश्वसनीय एकाग्रता अध्ययन में प्रस्तुत नहीं किया गया है; दरअसल, 150 यू/एमएल सफलता के लिए पर्याप्त है ।

कोशिका संवर्धन की इस प्रक्रिया में, कोशिका वृद्धि को प्रभावित करने वाले तत्वों की, प्राथमिक PBMC की व्यवहार्यता सबसे महत्वपूर्ण है. सफलता सुनिश्चित करने के लिए PBMC को यथासंभव तरोताजा रहना चाहिए । निस्संदेह, कोशिका एकाग्रता सफल संवर्धन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक है, इसलिए थ्रेशोल्ड मान 105 प्रति मिलीलीटर से कम नहीं होना चाहिए । यदि नमूना से पृथक की गई कुल कक्ष संख्या 106से कम है, तो पर्याप्त सेल एकाग्रता बनाए रखने के लिए एक मिनी-वेल सेल प्लेट का उपयोग करना आरंभिक संस्कृति में एक वैकल्पिक विकल्प है । इसके अलावा, NK और टी सेल लाइन भी परिधीय रक्त की एक सीमित मात्रा के साथ स्थापित किया जा सकता है जब रक्तलायी प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए PBMC को समृद्ध के रूप में हम पहले22की सूचना दी । प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, मानव सीरम संस्कृति की शुरुआत में सेल अस्तित्व के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है । हम सोचते है कि कुछ अज्ञात अवयवों सीरम जो अनुपस्थित या भ्रूण गोजातीय सीरम में अलग है में मौजूद है और टी के लिए आवश्यक/NK सेल प्रसार ।

विधि की दो सीमाएं हैं । सबसे पहले, इस विधि के बारे में कई अनुत्तरित प्रश्न हैं, जैसे कैसे और क्यों EBV vivo मेंNK या टी कोशिकाओं को संक्रमित, NK के तंत्र/टी सेल विकास और इन विट्रोमें प्रसार, और सेल के किस प्रकार में सेल लाइनों में स्थापित किया जा सकता है एक रोगी । हालांकि हम कोशिका प्रकार और पवित्रता को नियंत्रित नहीं कर पाए, जो कि विधि द्वारा निर्धारित नहीं हैं, इन कारकों के रोगियों में संक्रमित EBV कोशिकाओं पर निर्भर हो सकता है । इस प्रोटोकॉल के साथ, NK और टी कोशिकाओं सेल लाइनों में स्थापित किया जा सकता है, हालांकि इस पद्धति को तरजीही संस्कृति एक प्रकार नहीं कर सका । फिर भी, वहां इन कोशिकाओं का एक प्रमुख समूह है । दूसरा, वहां एक रिपोर्ट है कि NK और टी LPD या NK/टी लिंफोमा के साथ रोगियों से सेल क्लोन था सेल लाइनों के लिए स्थापित किया जा सकता है, जबकि अंय कई महीनों के लिए बनाए रखा जा सकता है17। वर्तमान अध्ययन में प्राप्त कोशिकाओं को 3 महीने से अधिक अच्छी तरह से पैदा करना कर सकते हैं, लेकिन क्या वे पैदा करना अनिश्चित काल के लिए मांय की जरूरत सकता है ।

सारांश में, इस विधि का उपयोग कर, CAEBV या NK से अधिक सेल लाइनों/टी लिंफोमा आसानी से रक्त की एक सीमित मात्रा में और एक कम खुराक फीडर कोशिकाओं के बिना आईएल-2 के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इन सेल लाइनों NK/टी कोशिकाओं और EBV जुड़े ल्यूकेमिया या लिंफोमा के रोगजनन में EBV persistency के अध्ययन के लिए योगदान देगा ।

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Disclosures

D.Z., X.Z., और X.C. इस अध्ययन में स्थापित NK/टी सेल लाइनों और सेल लाइनों की स्थापना के लिए इस पद्धति के संभावित उपयोग को कवर करने के लिए लंबित पेटेंट आवेदनों पर सह-अंवेषकों हैं । D.Z., X.Z., और X.C. इस काम में कोई होड़ वित्तीय हितों की घोषणा । शेष लेखक वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा की है ।

Acknowledgments

यह काम चीनी विज्ञान अकादमी के प्रमुख परियोजनाओं (KFZD-SW-205), सामरिक जैविक संसाधन प्रौद्योगिकी के चीनी विज्ञान अकादमी के समर्थन प्रणाली (CZBZX-1 और ZSSB-004) द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा चीन ( ८१४०१६४०) और शंघाई प्राकृतिक विज्ञान कोष (14ZR1434800) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू 133 NK सेल लाइंस टी सेल लाइंस क्रोनिक एक्टिव EBV इंफेक्शन रिकॉमबिनेंट ह्यूमन आईएल-2 PBMC पूरे ब्लड
जीर्ण सक्रिय Epstein-बर्र वायरस संक्रमण के साथ रोगियों से NK और टी सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए एक कुशल और सरल तरीका
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Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

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