Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56515
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 2, 1
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Summary

שיטה פשוטה להשגת שיבוטים NK ו T תאים מחולים CAEBV פותחה עם יעילות גבוהה, כמות קטנה של דם היקפיים במינון נמוך של il-2.

Abstract

מספר שיטות כבר מתואר להקים NK/T שורות תאים מחולים עם תסמונת לימפומה או lymphoproliferative. שיטות אלה המועסקים מזין תאים, תאי NK או T מזוכך ככל 10 מ"ל של דם או של מינון גבוה של il-2. מחקר זה מציג שיטה חדשה עם אסטרטגיה חזק ופשוט להקים קווי NK ו- T cell מאת culturing ההיקפית של דם תאי תאים (PBMC) עם התוספת של recombinant il-2 בני אדם (rhIL-2), ומשתמש רק 2 מ"ל של דם מלא. התאים יכולים להתרבות במהירות בעוד שבועיים, להישמר במשך יותר מ 3 חודשים. בשיטה זו, הוקמו 7 קווים NK או תא T עם אחוזי הצלחה גבוהים. שיטה זו היא פשוטה, אמינה, החלים על הקמת שורות תאים של מקרים נוספים של לימפומה תא CAEBV או NK/T.

Introduction

וירוס אפשטיין בר (EBV) נמצא בכל מקום והוא מדביק לא רק בתאי B, אבל גם T ותאי טבעי רוצח (NK), הגורמת מספר מחלות lymphoproliferative EBV-הקשורים NK/T (LPD), לימפומה/לוקמיה, כגון EBV-הקשורים hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme כמו לימפומה, extranodal NK/T-cell לימפומה, האף סוג, NK אגרסיבי תא לוקמיה1,2,3. בין אלה הוא חמור פעיל EBV (SCAEBV) מחלה כרונית, אשר הוא האירוע בעיקר בדרום מזרח אסיה, אשר כעת נחשב LPD הנגרמת על ידי משובט הרחבה של זיהום ב- EBV T או NK תאים4,5,6, 7, אבל בלי הכשל החיסוני לכאורה נוכח מונונוקלאוזיס זיהומי (IM)-כמו הסימפטומים לרבות קדחת, hepatosplenomegaly, לימפדנופתיה בתפקוד הכבד בהתמדה או שהדו-שיח, וכן EBV גבוהים-DNA לטעון דם היקפיים8,9. חולים עם CAEBV יש10,פרוגנוזה11, ו פתוגנזה שלה, התפקיד של EBV אינה ברורה. לכן, תא קווים נגזר EBV-הקשורים NK/T lymphoproliferative מחלות, לימפומות הם מאוד מועיל כמודלים תא עבור ולהבהיר את המנגנון של EBV המושרה NK או תא T התפשטות ועל מערכת היחסים שלה עם שכיחות גבוהה של לוקמיה או לימפומה.

עד היום הוקמו מספר שורות תאים עם טכניקות שונות12,13,14,15,16. קו NK תא אנושי, NK-YS, הוקמה של לימפומה התא NK/לוקמיה, על ידי שיתוף culturing עם קו תא סטרומה העכבר מזין, וגם בנוכחות rhIL-2-ריכוז 20U לכל mL15. KAI3 היה עוד שורה התא NK הוקמה מטופלים עם אלרגיה חמורה נגד יתושים או SCAEBV עם שורת התאים lymphoblastoid עצמיים (LCL), תאים B מומר על-ידי EBV, מזין תאים, תוספת של rhIL-2-100U/mL16. SNK6, SNT8 היו נגזר גידול רקמות האף חולי לימפומה של תאי NK/T על-ידי הוספת מינון גבוה של rhIL-2 (700U/mL)12. בטכניקה דומה, התא SNK-1 היה מחולים CAEBV, תרבותי של PBMC על ידי הסרת תאי T והוספת 700U/mL של rhIL-213,17. SNT13 SNT15 הוקמו על-ידי הסרת CD4 + ותאי CD8 +18. עד כה, שורות תאים אחרים תא T ו NK מחולים EBV-NK/T LPD התפתחו עם שיטה זו19.

החסרונות של השיטות הקיימות שהוזכרו לעיל כוללים את העסקתם של תאים מזין, הדרישה של מינון גבוה של il-2, הניצול של כל 10 מ"ל דם או הטיהור של תאי NK/T, אשר הוא מאוד מאתגר במרפאה עקב נחיצות מאמת אילו סוגי תאים EBV הזה לחשוף מדביק לפני שאתם מתחילים תרבות. כפי CAEBV מתרחשת בעיקר אצל ילדים באסיה, 10 מ ל דם הוא לא קל לרכוש בכל האזורים. במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה חדש עם אחוזי הצלחה גבוהים להקים קווי NK ו/או תא T על ידי culturing PBMC מחולים CAEBV באמצעות מינון נמוך של rhIL2 ונפח של 2 מ של דם מלא ללא מזין תאים. התוצאות של שיטה זו הוכיחו את יעילות גבוהה, חיסכון בזמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה של המכון לגנטיקה, ביולוגיה התפתחותית, האקדמיה הסינית למדעים, הפרוטוקול של מנחים המוסדית לרווחת האדם.

הערה: ראה איור 1 סכימטי של זרימת העבודה.

1. בידוד של PBMC מחולים CAEBV

  1. לטהר PBMC ראשי מ- 2 מ של דם מלא של חולים CAEBV על ידי מעבר צבע (למשל, Ficoll-פלאק) צנטריפוגה ההוראות של היצרן. לחלופין, הפשרה cryopreserved PBMC של חנקן נוזלי RPMI 1640 בינונית.
  2. להוסיף 2 µL של trypan blue (0.4%) 18 µL תא ההשעיה, לחכות 3 דקות כתם תאים, העברת התליה תא מונה לצלחת למדוד ריכוז של התאים לבין הכדאיות עם מונה הניתן תא אוטומטית.
  3. להכין התליה תא-צפיפות של 2-3 × 106 תאים למ"ל בתוספת מלאה RPMI 1640 תרבות בינוני המכיל 20% בנסיוב אדם (חום לא פעיל ב 56 ° C), 2 מ מגלוטמין, ואנטיביוטיקה (סטרפטומיצין µg/mL 100, 100 פניצילין U/mL). זרע 1 מ"ל של השעיה PBMC לכל טוב לוחות התרבות התא 24-. טוב.
  4. להוסיף 150 U rhIL-2 לכל טוב.
  5. הכנס את הצלחות תרבות חממה2 CO 5% ב 37 º C.
  6. יום 2, להתבונן על מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ (200 X הגדלה); תאים הם במצב טוב כאשר הם עגולים ובהירים.

2. התפשטות תאים ומספור התאים קיימא

  1. להתבונן המורפולוגיה תא תחת מיקרוסקופ (200 X הגדלה), ולעקוב אחר מצבו של צמיחת תאים על-ידי מספור התאים לפני שינוי בינוני: להוסיף 2 µL של trypan blue (0.4%) השעיה תא µL 18, וכן לחשב ריכוז התאים (ראה 1.2, איור 2).
  2. התעלם µL 500 של המדיום לתוך צלחת 24-ובכן, וכן להוסיף 500 µL טרי שלם תרבות בינוני. הוסף 150U rhIL-2 לכל טוב.
  3. לשנות את המדיום פעמיים בשבוע כמו שלב 2.2.
  4. שרטט את עקומת גדילה של תא (איור 3).
  5. כאשר ריכוז התאים קיימא עולה 5 /mL6× 10, לחלק תאים בארות חדשות-ריכוז של 1-2 × 106 תאים למ"ל כל היטב. תהליך זה לוקח 2-4 שבועות.

3. תא Phenotyping על ידי Cytometry זרימה

  1. כאשר התאים הורחב, לאסוף 1 × 106 תאים כדי לקבוע על הפנוטיפים של שורות תאים. צנטריפוגה תאים ב x 240 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (תאי NK/T לזרז בתחתית הצינורית).
  2. למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את המשקעים על-ידי הוספת 7 מ ל PBS. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 240 גרם בטמפרטורת החדר. חזור על פעם אחת.
  3. להוסיף 200 µL בנסיוב אדם כל שפופרת, מערבבים היטב, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה תאים ב- g x 240 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים ב 1 × 106/mL עם PBSA קר (PBS+0.2%BSA). לחלק תאים צינורות 5, כל שפופרת המכילה 2 × 105 תאים.
  5. צנטריפוגה תאים ב g x 240 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים עם מאגר PBSA או PBSA המכיל 10 µL PE (או PE-Cy7) 10 µL FITC ומתויגים נוגדנים כתם קולטני התא של תאי T או NK על קרח, כפי שציין באיור 4. תאים מושעה עם מאגר PBSA משמשים פקד שלילי.
  6. דגירה התאים עם נוגדנים למשך 20-30 דקות על קרח בחושך.
  7. לשטוף את התאים פעמיים עם PBSA קר, מחדש להשעות את התאים עם 300 µL PBSA קר.
  8. ניתוח של פנוטיפ תא עם cytometer זרימה.
    1. להגדיר את Cytometer זרימה במצב "ליצור גליון עבודה". הגדר את תבנית ניסיוני עם מגרש נקודה המציג פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס).
    2. לטעון את הצינור שליטה isotype כדי למטב את המתחים FSC של האס, למטב את ערך הסף FSC לסלק פסולת ללא הפרעה עם האוכלוסייה תא עניין. מחק את כל הפרמטרים חוץ FSC, האס, FITC, PE ו- PE-Cy7.
    3. לבצע פיצוי באמצעות הפקד isotype פקד חיובי יחיד בכל קבוצה 2-צבע ניתוח.
    4. דוגמיות וליצור הלע-ד ר VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 לעומת CD16, CD16 נגד CD3 מתווה נקודה מציג אוכלוסייה שונות של תאים.
      הערה: PBMC שימשו כדי לבצע פיצוי באמצעות הפקד שלילי/isotype ואת הפקד חיובי יחיד. immunofluorescence 2-צבע עם זרימה cytometer נעשה שימוש באופן שגרתי כדי לנתח את הביטוי של סמני פני השטח. הנוגדנים הבאים כלולים: אנטי-הלע-ד ר, אנטי-CD4, anti-CD16 מצומדת עם fluorescein isothiocyanate (FITC), אנטי-CD8, אנטי-CD56, CD3 מצומדת עם phycoerythrin (PE) ו- anti-CD19 מצומדת עם PE-Cy7.

4. הרחבת, הקפאה קריוגנית תאי NK/T

  1. לשנות את המדיום השלמת הניתוח פנוטיפ התא. בזהירות להסיר את מחצית תגובת שיקוע והימנע מלגעת התאים בתחתית הצלחת. להוסיף באותו אמצעי אחסון בינוני תרבות טריים המכילים 300 U/mL rhIL-2 אל צלחות התא.
  2. שנה וחצי של המדיום כל 3 ימים (כמו 2.2) עד התא אשכולות הם נראים בבירור תחת המיקרוסקופ (איור 2). בדרך כלל, תהליך זה לוקח 2-3 שבועות.
  3. העבר את התאים מ 24-ובכן צלחות T25 תרבות מבחנות לאחר ערבוב וולס שונים של אותה שושלת. כפול הנפח של תרבות בינוני מתברר צהוב עד הנפח של המדיום מתרחבת ל- 10-15 מ. הוסף rhIL-2 עם הריכוז של 150 U/mL.
  4. לשנות בינונית 24 שעות לפני הקפאת לאחר 2-3 שבועות גוברת, כאשר התא בנפח גדול יכול להיות שנצפו בעין בלתי מזוינת. למדוד ריכוז תא עם מונה התא.
  5. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב 240 x g, מחדש להשעות תא צניפה-צפיפות של 5-10 x 106 תאים למ"ל עם הפתרון מניות קפוא אשר מכיל סרום שור עוברית 90% ולא 10% dimethylsulfoxide (דימתיל סולפוקסיד). הקפאת בקצב של 1 ° C לכל דקות ל-80 מעלות ולאחר מכן להעביר ישירות לתוך חנקן נוזלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר 3 ימים תרבות במהלך הקמת שורות תאים, התאים רב-צורתיות מתחילים להופיע (איור 2). לאחר 7 ימים, תאים לגדול במהירות, כמו גם מספר וגם הכדאיות של תאים גדלו בקצב גבוה (איור 3). בקבוצות קטנות של תאים גלויים בבירור אחרי 10-14 ימים גוברת, כאשר הריכוז תא עולה על 3-6 × 106. בתקופה זו, תאים צריך ניתן להרחיב באמצעות חלוקת לתוך בארות שניים או שלושה לצלחת תרבות. כחודש לאחר מכן, פעם מגיע מספר תא ל 3-5 × 107, הרוזן הוא מספיק גבוה לשימור.

בעיה חשובה נוספת היא לקבוע את הפנוטיפים כאשר תאים תרבותי. בהצלחה. התוצאות שלנו מצביעים על כך T (L196) ותאי NK (M296) יכול להיות תרבותי על ידי השיטה המתוארת לעיל (איור 4), היתה אפשרות ליצור שורות תאים בטכניקה זו, כמו התאים גדלה יותר מ-3 חודשים במצב טוב.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת עבודה. ביום הראשון, נאסף הדם קרישה מחולים CAEBV, ואז PBMC היו מבודדים ותרבותית בינונית 1640 המכיל 20% בנסיוב אדם ו- 150U/mL של rhIL-2. תאי NK/T גדלו ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2. אחרי 2-4 שבועות culturing, התאים החלו לגדול במהירות. כאשר הריכוז חריגה 5 /mL6 × 10, חילקנו תאים 2-3 בארות-ריכוז של 2 × 106. המשך התרבות במשך 2-3 שבועות, תאים הועברו מהצלחת 24-ובכן לתוך הבקבוק T25 כאשר התא אשכולות נראו בבירור מתחת למיקרוסקופ. Cryopreserve תאים כאשר התא בנפח גדול יכול להיות שנצפו בעין בלתי מזוינת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: שינויים מורפולוגיים הסלולר בתהליך culturing. תאים תרבותי, נצפתה לגבי מספר הימים שצוין. תאים רב-צורתיות (החצים הצביע) היו גלויים תחת המיקרוסקופ בבירור לאחר 3-7 ימים, תאי החלה לגדול במהירות לאחר 7-14 ימי תרבות. ההגדלה המקורי של מיקרוסקופ אור היה 200 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: עקומות גדילה של התפשטות תא. לאחר 7 ימים של culturing, תאי החלה לגדול במהירות (א) ועם גבוהה הכדאיות (B). ריכוז של התאים ואת הכדאיות נמדדו על ידי מונה הניתן תא אוטומטית באמצעות ההליך שלהלן: להוסיף 2 µL של trypan blue (0.4%) µL 18 תא השעיה עבור צביעת, להמתין 3 דקות, להעביר את המתלים לצלחת מונה תא, ומדוד של התאים ריכוז, הכדאיות תא עם מונה הניתן תא אוטומטית. קווי השגיאה הן סטיות תקן של שלושה עותקים משוכפלים. L196, Z290, M296, L311 הם השמות של ארבע שורות תאים. הריכוז ההתחלתי כדי למדוד את עקומת הגדילה הוא בערך 3 × 106. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג gating אסטרטגיה לניתוח cytometry זרימה של שורות תאים L196, M296. PBMC שימשו עבור התאמת המתחים FSC של האס. האשכול של לימפוציטים בשידור חי, רווק היה פיקוח על P1 בעלילה FSC של האס. שליטה isotype ופקדים חיובי יחיד שימשו כדי לבצע פיצוי. ארבעה זוגות של 2-צבע immunofluorescence מצומדת נוגדן מכתים שימשו כדי לנתח את הביטוי של סמני פני השטח. אנטי-הלע-ד ר ו anti-CD19 שימשו כדי לזהות תאים B, והואיל anti CD3, אנטי-CD4, ו- anti-CD8 שימשו לזיהוי תאי T. Anti-CD16 ו- anti-CD56 שימשו להגדרת תאי NK. (א) פנוטיפ של L196 הוא CD19-הלע-ד ר + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, סוג התא העיקרי הוא CD8 +. (B) M296 הוא CD19-הלע-ד ר + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, סוג התא העיקרי הוא CD16 + CD56 +. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב פרוטוקול זה, פותחה טכניקה הרומן להקמת NK/T שורות תאים מדם כל המטופלים CAEBV. לעומת השיטות הקיימות, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הפשטות שלו ודרישת שלה רק נפח קטן של דם, בזמן זה מוצגים אחוזי הצלחה גבוהים ותנאים טובים של התא הכדאיות. יתר על כן, שורות תאים NK/T יכול להתבסס על culturing PBMC מבלי לקבוע סוגי תאים EBV לחשוף נגוע מראש, כמו קביעת תצרוך יותר זמן לפני culturing ודם. לחלופין, ניתן לנתח שורות תאים, אפשר לטהר פנוטיפים שונים של תאים עם cytometry זרימה לאחר הקמת קו תא. חוץ מזה, השיטה עושה שימוש במינון נמוך של rhIL-2 ויש אף תא מזין. בשיטה זו, יש שפותחה 7 שורות תאים מחולים CAEBV 8 ואנו cryopreserved אותם בתוך חודש. האחד אשר לא פותחה והפכה לקו התא יכול להישמר בחיים ליותר מ 5 חודשים ללא התפשטות משמעותית, הסיבות מאחורי זה צריך חקירה נוספת.

יש צורך לציין כי צמיחת תאים תלויה אך ורק הנוכחות של recombinant האנושי il-2, אשר עולה בקנה אחד עם20,הקודם דוחות21; עם אין האדם il-2, התאים ימותו בעוד 3 שבועות. אין ספק, באיכות גבוהה של il-2 הוא חיוני עבור התפשטות תאים, על פי הגורמים הקובעים את קיבולת שגשוג של תאים במבחנה עדיין צריך להיות מובהר. המינון של il-2 הנדרש משתנה בין שורות תאים שונים, למשל, 50U/mL הוא משביע רצון לשמור על ההתפשטות של M296. עם זאת, הריכוז הכי חסכוני ואמין להקמת קווי התא NK/T לא הוצגה במסגרת המחקר; אכן, 150 U/mL מספיקה להצלחה.

בתהליך זה של התא culturing, המרכיבים המשפיעים על צמיחת תאים, הכדאיות של PBMC העיקרי הוא החשוב ביותר. כדי להבטיח הצלחה, PBMC צריך להיות טריים ככל האפשר. ללא ספק, ריכוז התא הוא גורם חשוב להשפיע culturing מוצלח, ולכן ערך הסף צריך להיות לא נמוך מ- 10 הוא5 מ ל. אם המספר הכולל תא מבודד מן המדגם פחות מ 106, בעזרת צלחת תא מיני טוב לשמור על ריכוז תא נאותה הוא בחירה אלטרנטיבית בתרבות הראשונית. יתר על כן, קו NK ו- T cell יכול להיות הקים עם אפילו כמות מוגבלת של דם היקפיים בעת שימוש התגובה היילוד להעשיר PBMC כפי דיווחנו בעבר22. כפי שתואר בפרוטוקול, הסרום האנושי הוא גורם מפתח נוסף להישרדות תא בתחילתו של התרבות. אנו משערים כי כמה מרכיבים לא ידועים להתקיים בהסרום אשר נעדר או שונים בסרום שור בעובר ו נחוצים התפשטות תאים T/NK.

קיימות שתי מגבלות של השיטה. ראשית, ישנם מספר שאלות שלא נענו על שיטה זו, כמו למשל איך ולמה EBV מדביק את NK או T תאים ויוובמנגנונים של ה NK/T תאים צמיחה והתפשטות במבחנה, מה יכולים להיות סוגים של תא הוקמה לתוך שורות תאים ב מטופל אחד. למרות שאנחנו לא יכלה לשלוט את סוג התא ואת הטוהר, אשר לא נקבעות לפי השיטה, גורמים אלה עשוי להיות תלוי התאים ש-EBV מדביק בחולים. עם פרוטוקול זה, NK ותאי T יכול להקים לתוך שורות תאים, אך שיטה זו לא יכול מעדיפים תרבות סוג אחד. עם זאת, יש קבוצה דומיננטית של תאים אלה. שנית, שם היה דוח NK ו- T cell שיבוטים מחולים עם LPD או לימפומה NK/T יכול להקים שורות תאים, בעוד שאחרים יכולים להישמר חודשים מספר17. תאים שהושגו במחקר הנוכחי יכול להתרבות מעל 3 חודשים, אולם אם הם יכולים להתרבות ללא הגבלת זמן צריך לאמת.

לסיכום, השימוש בשיטה זו, יותר שורות תאים של לימפומות CAEBV או NK/T ניתן להשיג בקלות ועם כמות מוגבלת של דם במינון נמוך של il-2 ללא מזין תאים. שורות תאים אלה יתרום למחקר של EBV התמדה בתאי NK/T ומקושרת בפתוגנזה של EBV לוקמיה או לימפומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שסמית, X.Z. ו- X.C. הם ממציאים על ממתינים בקשות לפטנטים כיסוי שימושים פוטנציאליים של שיטה זו להקמת קווי התא NK/T והן לקווי תא הוקמה במחקר זה. שסמית ', ' X.Z., X.C. להכריז אין אינטרסים כלכליים מתחרים בעבודה זו. המחברים הנותרים להכריז שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה את מפתח פרוייקטים של סינית האקדמיה למדעים (KFZD-SW-205), אסטרטגי ביולוגי משאבי טכנולוגיית מערכת תמיכה של סינית האקדמיה למדעים (CZBZX-1 ו- ZSSB-004), ועל ידי מענקים של קרן המדע הלאומית של סין ( 81401640) שנגחאי קרן מדעי הטבע (14ZR1434800).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Tags

תא T אימונולוגיה זיהום גיליון 133 שורות תאי NK קווים דלקת כרונית EBV פעיל il-2 PBMC דם אנושי רקומביננטי
שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T.,… More

Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter