Summary
Un metodo semplice per ottenere cloni delle cellule T e NK dai pazienti CAEBV è stato sviluppato con alta efficienza, una piccola quantità di sangue periferico e una basso-dose del-2.
Abstract
Un numero di metodi è state descritto per stabilire linee di cellule NK/T da pazienti con sindrome di linfoma o lymphoproliferative. Questi metodi impiegati le cellule di alimentatore, le cellule NK o T purificate per quanto 10 ml di sangue o un'alto-dose del-2. Questo studio presenta un nuovo metodo con una strategia semplice e potente per stabilire linee delle cellule T e NK, coltivando il periferico del sangue cellule mononucleari (PBMC) con l'aggiunta del-2 di umana ricombinante (rhIL-2) e utilizza più di 2 mL di sangue intero. Le cellule possono proliferare rapidamente in due settimane ed essere mantenute per più di 3 mesi. Con questo metodo, 7 linee NK o cellula T sono state stabilite con un alto tasso di successo. Questo metodo è semplice, affidabile e applicabile alla creazione di linee cellulari da più casi di linfoma a cellule NK/T o CAEBV.
Introduction
Virus di Epstein - Barr (EBV) è onnipresente e infetta non solo le cellule di B, ma anche T e cellule natural killer (NK), che provoca una serie di malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, quali hemophagocytic EBV-associati lymphohistiocytosis, Idroa vacciniforme-come linfoma, extranodal linfoma a cellule NK/T, tipo nasale e NK aggressivo delle cellule di leucemia1,2,3. Tra questi è attivo EBV (SCAEBV) la malattia cronica severa, che è incidente principalmente in Asia orientale, e che è ora considerato un LPD causati dall'espansione clonale di EBV-infettate T o NK cellule4,5,6, 7, ma senza l'immunodeficenza apparente presenti nella mononucleosi contagiosa (IM)-come i sintomi compreso febbre, epatosplenomegalia, linfoadenopatia e disfunzione del fegato con insistenza o periodica, nonché alto EBV-DNA carico nella sangue periferico8,9. Pazienti con CAEBV hanno una prognosi difficile10,11e la relativa patogenesi e il ruolo dell'EBV è poco chiaro. Pertanto, le linee derivate da malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T cellulari e linfomi sono molto utili come modelli cellulari per chiarire il meccanismo di EBV indotta da proliferazione NK o cellula T e la sua relazione con alta incidenza di leucemia o linfoma.
Ad oggi, parecchie linee cellulari sono state stabilite con diverse tecniche12,13,14,15,16. Una linea di cellule NK umana, NK-YS, è stata fondata da leucemia/linfoma a cellule NK, di co-coltura con una linea di cellule stromali di topo come alimentatore e in presenza di rhIL-2 ad una concentrazione di 20U per mL15. Kai3 era un'altra linea di cellule NK stabilita da pazienti con un'allergia grave zanzara o SCAEBV con linea cellulare autologo linfoblastoidi (LCL), cellule di B trasformate da EBV, come le cellule di alimentatore e aggiunta di rhIL-2 a 100U/mL16. SNK6 e SNT8 sono stati derivati da tessuti tumorali di pazienti di linfoma a cellule NK/T nasali con l'aggiunta della alto-dose di rhIL-2 (700U/mL)12. Con tecnica simile, la cella di SNK-1 era da pazienti CAEBV, coltivati da PBMC rimuovendo le cellule di T e aggiungendo 700U/mL rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 sono stati stabiliti tramite la rimozione di CD4 + e CD8 + cellule18. Finora, altre linee cellulari delle cellule T e NK dai pazienti EBV-NK/T LPD sono stati sviluppati con questo metodo19.
Gli svantaggi dei metodi esistenti di cui sopra comprendono l'impiego di cellule di alimentatore, il requisito di un alto-dose del-2, l'utilizzazione di quanto 10 mL di sangue intero o la purificazione delle cellule di NK/T, che è molto impegnativo in clinica a causa la necessità di verificare quali tipi di cella che EBV latente infetta prima di iniziare a cultura. Come CAEBV si verifica principalmente nei bambini in Asia, 10 mL di sangue non è facile acquisire in tutte le regioni. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo metodo semplice con un alto tasso di successo per stabilire linee NK e/o cellula T coltivando PBMC dai pazienti CAEBV utilizzando una basso-dose di rhIL2 e un volume di 2 mL di sangue intero senza cellule di alimentatore. I risultati di questo metodo hanno dimostrato la sua elevata efficienza e risparmio di tempo.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Istituto di genetica e biologia dello sviluppo, Accademia cinese delle scienze, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per benessere umano.
Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica del flusso di lavoro.
1. isolamento di PBMC dai pazienti CAEBV
- Purificare il primario PBMC da 2 mL di sangue intero di pazienti CAEBV di sfumatura (ad es., Ficoll-placca) centrifugazione seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, scongelare PBMC crioconservati da azoto liquido con medium RPMI 1640.
- Aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) alla sospensione di cellule di µ l 18, attendere per 3 min a macchiare le cellule, trasferire la sospensione per la contropiastra di cella e misurare la concentrazione delle cellule e la redditività con un contatore di cellule automatizzato.
- Preparare la sospensione cellulare ad una densità di 2-3 × 106 cellule/mL completati con terreno di coltura RPMI 1640 completo contenente 20% di siero umano (calore inattivato a 56 ° C), 2 mM L-Glutammina e gli antibiotici (100 µ g/mL di streptomicina, 100 U/mL di penicillina). Semi di 1 mL di sospensione PBMC per pozzetto in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti.
- Aggiungere 150 U rhIL-2 per pozzetto.
- Posizionare le piastre di coltura in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Il giorno 2, osservare la morfologia delle cellule al microscopio (ingrandimento X 200); le cellule sono in buone condizioni quando sono luminose e rotondo.
2. espansione delle cellule e le cellule vitali di numerazione
- Osservare la morfologia delle cellule al microscopio (ingrandimento X 200) e controllare la condizione della crescita delle cellule numerando le celle prima di cambiare mezzo: aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) alla sospensione di cellule di µ l 18 e calcolare la concentrazione delle cellule (Vedi 1.2, Figura 2).
- Scartare 500 µ l del mezzo in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 µ l fresco completo colturale. Aggiungere 150U rhIL-2 per pozzetto.
- Modificare il mezzo due volte a settimana come descritto al punto 2.2.
- Disegnare la curva di crescita delle cellule (Figura 3).
- Quando la concentrazione delle cellule vitali supera 5 × 106/mL, dividere le celle in nuovi pozzi ad una concentrazione di 1-2 × 106 cellule/mL in ciascun pozzetto. Questo processo richiede 2-4 settimane.
3. cellula Phenotyping tramite flusso Cytometry
- Quando le cellule sono espansi, raccogliere 1 × 106 cellule per determinare i fenotipi delle linee cellulari. Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a temperatura ambiente (cellule NK/T precipiterà nella parte inferiore del tubo).
- Eliminare il supernatante, lavare la precipitazione con l'aggiunta di 7 mL di PBS. Centrifugare per 5 min 240 x g a temperatura ambiente. Ripetere una volta.
- Aggiungere 200 µ l di siero umano in ogni provetta, mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 × 106/ml con PBSA fredda (PBS+0.2%BSA). Dividere le celle in 5 provette, ogni provetta contenente 2 × 105 celle.
- Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule con buffer di PBSA o PBSA contenente 10 µ l PE (o PE-Cy7) e 10 µ l FITC etichettato anticorpi per macchiare i recettori delle cellule T o NK sul ghiaccio come indicato dalla Figura 4. Cellule sospese con buffer di PBSA sono utilizzate come controllo negativo.
- Incubare le cellule con anticorpi per 20-30 min su ghiaccio al buio.
- Lavare le cellule due volte con PBSA freddo, risospendere le cellule con 300 µ l PBSA freddo.
- Analizzare il fenotipo delle cellule con un citometro a flusso.
- Impostare il citometro a flusso nella condizione di "Creare il foglio di lavoro". Impostare il modello sperimentale con una trama di puntino che visualizza forward scatter (FSC) contro dispersione laterale (SSC).
- Caricare il tubo di controllo di isotipo per ottimizzare le tensioni FSC e SSC e ottimizzare il valore di soglia FSC per eliminare i detriti senza interferire con la popolazione delle cellule di interesse. Elimina tutti i parametri tranne FSC, SSC, FITC, PE e PE-Cy7.
- Eseguire la compensazione utilizzando il controllo di isotipo e un singolo controllo positivo in ogni gruppo di analisi di 2 colori.
- Caricare i campioni e creare HLA-DR VS CD19, puntino VS CD4 CD8, CD16 VS CD56 e CD3 VS CD16 diagrammi che mostrano diversa popolazione di cellule.
Nota: PBMC sono stati utilizzati per eseguire la compensazione utilizzando il controllo negativo/isotipo e il singolo controllo positivo. 2-colore immunofluorescenza con citometro a flusso è stato utilizzato ordinariamente per analizzare l'espressione di marcatori di superficie. Le dotazioni comprendono i seguenti anticorpi: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 coniugato con isotiocianato di fluorescina (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 coniugato con ficoeritrina (PE) e anti-CD19 coniugato con PE-Cy7.
4. espansione e crioconservazione delle cellule di NK/T
- Modificare il mezzo quando viene completata l'analisi del fenotipo delle cellule. Rimuovere la metà del surnatante delicatamente ed evitare di toccare le cellule nella parte inferiore della piastra. Aggiungere lo stesso volume di fresco mezzo di coltura contenente 300 U/mL rhIL-2 per le piastre di cella.
- Modificare la metà del mezzo ogni 3 giorni (come 2.2) fino a quando la cella cluster sono chiaramente visibili al microscopio (Figura 2). In genere, questo processo richiede 2-3 settimane.
- Trasferire le cellule da 24 pozzetti per matracci di cultura T25 dopo la miscelazione di diversi pozzetti della stessa stirpe. Doppio del volume di terreno di coltura come si diventa giallo fino a quando il volume del mezzo si espande a 10-15 mL. Aggiungere rhIL-2 con la concentrazione di 150 U/mL.
- Modificare media 24 h prima del congelamento dopo 2-3 settimane di crescita, quando la cella di massa può essere osservato ad occhio nudo. Misurare la concentrazione di cellule con un contatore di cellule.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 240 x g e risospendere il pellet cellulare ad una densità di 5-10 x 106 cellule/mL con la soluzione di riserva congelata contenente siero bovino fetale di 90% e 10% dimetilsulfossido (DMSO). Congelare a un tasso di 1 ° C / min a-80 ° C e poi trasferire direttamente in azoto liquido.
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Representative Results
Dopo 3 giorni cultura durante l'istituzione di linee cellulari, le cellule polimorfiche cominciano ad apparire (Figura 2). Dopo 7 giorni, le cellule crescono rapidamente, come il numero e la vitalità delle cellule sono aumentati ad un ritmo elevato (Figura 3). Piccoli grappoli di cellule sono chiaramente visibili dopo 10-14 giorni in crescita, quando la concentrazione di cellule può superare i 3-6 × 106. In questo periodo, le cellule dovrebbero essere ampliate dalla divisione in due o tre pozzetti della piastra di coltura. Circa un mese più tardi, una volta i numero raggiunge cella 3-5 × 107, il conteggio è abbastanza alto per la conservazione.
Un altro tema importante è quello di determinare i fenotipi quando le cellule sono state coltivate con successo. I nostri risultati indicano che T (L196) e cellule NK (M296) possono essere coltivate con il metodo descritto sopra (Figura 4), e linee cellulari potrebbero essere stabilite con questa tecnica, come le cellule si sono sviluppate più di 3 mesi in buone condizioni.
Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro. Il primo giorno, sangue dell'anticoagulante è stato raccolto dai pazienti CAEBV, poi PBMC erano isolate e coltivate con il supporto di 1640 contenente siero umano al 20% e 150U/mL di rhIL-2. Le cellule NK/T sono state coltivate a 37 ° C in presenza di 5% CO2. Dopo 2-4 settimane di coltura, le cellule cominciarono a crescere rapidamente. Quando la concentrazione supera 5 × 10 6/ml, abbiamo diviso le cellule in 2-3 pozzi alla concentrazione di 2 × 106. Continuando la cultura per 2-3 settimane, le cellule furono trasferite dalla piastra a 24 pozzetti in matraccio da T25 quando mazzi delle cellule erano chiaramente visibili al microscopio. Crioconservare celle quando la cella di massa può essere osservato ad occhio nudo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: i cambiamenti morfologici cellulari nel processo di coltura. Le cellule sono coltivate e osservate per il numero di giorni indicato. Cellule polimorfiche (le frecce puntate) erano visibili al microscopio chiaramente dopo 3-7 giorni, e cellule cominciarono a crescere rapidamente dopo cultura 7-14 giorni. L'ingrandimento originale per microscopia chiara era 200 X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: le curve di crescita di proliferazione delle cellule. Dopo 7 giorni di coltura, le cellule cominciarono a crescere rapidamente (A) e con alta redditività (B). Concentrazione e la vitalità delle cellule sono stati misurati da un contatore di cellule automatizzato con la seguente procedura: aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) a 18 µ l di sospensione cellulare per la macchiatura, attendere 3 minuti, trasferire la sospensione per la contropiastra di cella e misurare delle cellule concentrazione e l'attuabilità delle cellule con un contatore di cellule automatizzato. Le barre di errore sono le deviazioni standard di tre repliche. L196, Z290, M296, L311 sono i nomi di quattro linee cellulari. La concentrazione iniziale di misurare la curva di crescita è di circa 3 × 106. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante gating strategia per analisi di citometria a flusso delle linee cellulari L196 e M296. PBMC sono stati utilizzati per la regolazione tensioni FSC e SSC. Il cluster dei linfociti dal vivo e singoli era stato eliminato per P1 nella trama FSC e SSC. Il controllo di isotipo e singoli controlli positivi sono stati utilizzati per eseguire la compensazione. Quattro paia di colorazione di immunofluorescenza di 2 colori coniugato anticorpo sono stati utilizzati per analizzare l'espressione di marcatori di superficie. Anti-HLA-DR e anti-CD19 erano utilizzati per rilevare le cellule di B, mentre anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 sono stati utilizzati per rilevare le cellule T. Anti-CD16 e anti-CD56 sono stati utilizzati per definire le cellule NK. (A) il fenotipo di L196 è CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, il tipo di cella principale è CD8 +. (B) M296 è CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, il tipo di cella principale è CD16 + CD56 +. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, è stata sviluppata una nuova tecnica per l'istituzione di linee di cellule NK/T dal sangue intero dei pazienti CAEBV. Confrontato con i metodi esistenti, il principale vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e la sua esigenza di solo un piccolo volume di sangue, mentre esibisce un alto tasso di successo e buone condizioni di attuabilità delle cellule. Inoltre, linee di cellule NK/T possono essere stabilite coltivando PBMC senza determinare i tipi di cellule EBV latente infettati in anticipo, come la determinazione consumerebbe più sangue e tempo prima coltura. In alternativa, linee cellulari possono essere analizzate e fenotipi differenti delle cellule possono essere purificati con citometria a flusso dopo l'istituzione di linea cellulare. Inoltre, il metodo utilizza una bassa dose di rhIL-2 e ha bisogno di nessun cellule di alimentatore. Con questo metodo, abbiamo sviluppato 7 linee cellulari da 8 pazienti CAEBV e crioconservati loro entro un mese. Quello che non è stato sviluppato in una linea cellulare può essere mantenuto vivo per più di 5 mesi senza proliferazione significativa, e le ragioni dietro questo bisogno di ulteriore esplorazione.
È necessario notare che la crescita delle cellule è strettamente dipendente dalla presenza del-2 ricombinante umano, che è coerente con precedenti rapporti20,21; con nessun-2 umano, le cellule moriranno in 3 settimane. Evidentemente, un'alta qualità del-2 è essenziale per la proliferazione delle cellule, anche se i fattori che determinano la capacità proliferativa delle cellule in vitro devono ancora essere chiariti. La dose del-2 richiesto è variabile tra diverse linee cellulari, per esempio, è soddisfacente per mantenere la proliferazione di M296 50U/mL. Tuttavia, la concentrazione più economica e affidabile per stabilire linee di cellule NK/T non è stata presentata nello studio; Infatti, 150 U/mL è sufficiente per il successo.
In questo processo di coltura delle cellule, degli elementi che interessano la crescita delle cellule, la vitalità di PBMC primario è il più importante. Per garantire il successo, PBMC dovrebbe essere più fresco possibile. Senza dubbio, la concentrazione nelle cellule è un fattore importante che interessa la coltura riuscita, pertanto il valore di soglia deve essere non inferiore a 105 millilitri. Se il numero totale delle cellule isolato dal campione è inferiore a 106, utilizzando una piastra di cella di mini-pozzetti per mantenere una concentrazione adeguata delle cellule è una scelta alternativa nella cultura iniziale. Inoltre, linea delle cellule T e NK potrebbe essere stabilita con anche una limitata quantità di sangue periferico quando usando la reazione emolitica per arricchire PBMC, come abbiamo riferito precedentemente22. Come descritto nel protocollo, il siero umano è un altro fattore chiave per la sopravvivenza delle cellule all'inizio della cultura. Speculiamo che alcuni ingredienti sconosciuti presenti nel siero sono assenti o diversi in siero bovino fetale, che sono necessarie per la proliferazione delle cellule T/NK.
Ci sono due limitazioni del metodo. In primo luogo, esistono diverse domande senza risposta circa questo metodo, ad esempio come e perché EBV infetta la NK o T cells in vivo, i meccanismi del NK/T cell crescita e la proliferazione in vitro, e quali tipi di cella possono essere stabilito in linee cellulari in un paziente. Anche se non abbiamo potuto controllare il tipo di cella e la purezza, che non sono determinati dal metodo, questi fattori potrebbero dipendere le cellule che EBV infetta in pazienti. Con questo protocollo, le cellule NK e T potrebbero essere stabilite in linee cellulari, anche se questo metodo non potrebbe cultura preferenzialmente un tipo. Tuttavia, c'è un gruppo dominante di queste cellule. In secondo luogo, c'era un rapporto che i cloni di cellule T e NK dai pazienti con LPD o linfoma NK/T potrebbe essere stabilito a linee cellulari, mentre gli altri essere conservati per diversi mesi17. Cellule ottenute in studio presente possono proliferare oltre 3 mesi, tuttavia se essi potrebbero proliferare indefinitamente deve essere convalidata.
In sintesi, utilizzando questo metodo, più linee cellulari dai linfomi CAEBV o NK/T possono essere facilmente ottenuti con una quantità limitata di sangue e una basso-dose del-2 senza cellule di alimentatore. Queste linee cellulari contribuirà allo studio della persistenza di EBV in cellule di NK/T e patogenesi di EBV associati leucemia o linfoma.
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Disclosures
D.Z., X.Z. e X.C. sono co-inventori su domande di brevetto che copre potenziali utilizzi di questo metodo per stabilire linee di cellule NK/T e le linee cellulari stabilite in questo studio in. D.Z., X.Z. e X.C. non dichiarare concorrenti interessi finanziari in questo lavoro. Gli autori restanti dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da progetti chiave dell'Accademia cinese delle scienze (KFZD-SW-205), strategico biologico risorse tecnologia sistema di supporto dell'Accademia cinese delle scienze (CZBZX-1 e ZSSB-004) e da sovvenzioni dalla National Science Foundation of China ( 81401640) e fondo di scienze naturali (14ZR1434800) di Shanghai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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