Summary
Een eenvoudige methode voor het verkrijgen van T-cel en NK klonen van CAEBV patiënten werd ontwikkeld met hoog rendement, een kleine hoeveelheid van perifeer bloed en een lage dosis van IL-2.
Abstract
Een aantal methoden zijn beschreven om NK/T cellijnen van patiënten met lymfoom of proliferatieve syndroom geweest. Deze methoden die feeder cellen, gezuiverde NK of T cellen met maar liefst 10 mL bloed of een hoge dosis van IL-2. Deze studie presenteert een nieuwe methode met een krachtige en eenvoudige strategie om NK en T cel lijnen door het kweken van de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met de toevoeging van recombinante menselijke IL-2 (rhIL-2), en zo weinig als 2 mL bloed gebruikt. De cellen kunnen verspreiden snel in twee weken en worden gehandhaafd voor meer dan 3 maanden. Met deze methode 7 NK of T cel lijnen gelegd met een hoog slagingspercentage. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar, en die van toepassing zijn tot het vaststellen van cellijnen van meer gevallen van CAEBV of NK/T-cel lymfoom.
Introduction
Epstein - Barr virus (EBV) is alomtegenwoordig en infecteert niet alleen B-cellen, maar ook T en natural killer (NK) cellen, waardoor een aantal EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten (LPD) en lymfoom/leukemie, zoals EBV-geassocieerde hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-achtige lymfoom, extranodal NK/T-cel lymfoom, nasale type en agressieve NK-cel leukemie1,2,3. Daaronder is ernstige chronische actieve EBV (SCAEBV) ziekte, die vooral in Oost-Azië incident, en die wordt nu beschouwd als een LPD veroorzaakt door klonen expansie van EBV-geïnfecteerde T of NK cellen4,5,6, 7, maar zonder de schijnbare immunodeficiëntie presenteren in klierkoorts (IM)-als symptomen waaronder koorts, hepatosplenomegaly, lymfadenopathie en lever dysfunctie aanhoudend of productlevering, evenals hoge EBV-DNA laden de perifeer bloed8,9. Patiënten met CAEBV hebben een slechte prognose10,11, en de pathogenese en de rol van de EBV is onduidelijk. Daarom, cellijnen afgeleid van EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten en lymfomen zijn zeer behulpzaam als cel modellen voor verduidelijking van het mechanisme van EBV NK of T-cel proliferatie en haar relatie met een hoge incidentie van leukemie geïnduceerde of lymfoom.
Tot op heden zijn verschillende cellijnen opgericht met verschillende technieken12,13,14,15,16. Een menselijke NK cellijn, NK-YS, ontstond uit de NK-cel lymfoom/leukemie, door samen met een muis stromale cellijn kweken als feeder, en in aanwezigheid van rhIL-2 bij een concentratie van 20U per mL15. KAI3 was een andere NK cellijn opgericht met ingang van patiënten met een ernstige mug allergie of SCAEBV met autologe lymphoblastoid cellijn (LCL), B-cellen getransformeerd door EBV, als feeder cellen en toevoeging van rhIL-2 at 100U/mL16. SNK6 en SNT8 werden afgeleid van tumor weefsels van nasale NK/T-cel lymfoom patiënten door toevoeging van hoge dosis van rhIL-2 (700U/mL)12. Met soortgelijke techniek was de SNK-1 cel van CAEBV patiënten, gekweekt uit PBMC door verwijderen van T-cellen en het toevoegen van 700U/mL van rhIL-213,17. SNT13 en SNT15 werden opgericht door CD4 +- en CD8 + cellen18te verwijderen. Tot nu toe, werden andere T-cel en NK cellijnen van EBV-NK/T LPD patiënten alle ontwikkeld met deze methode19.
De nadelen van de hierboven genoemde bestaande methoden omvatten de tewerkstelling van feeder cellen, de eis van een hoge dosis IL-2, of het gebruik van maar liefst 10 mL bloed, de zuivering van NK/T-cellen, die is een grote uitdaging in de kliniek worden de noodzaak om te verifiëren welke soorten cel dat EBV latent infecteert vóór begin aan cultuur. Zoals CAEBV treedt vooral op bij kinderen in Azië, is 10 mL bloed niet makkelijk te verwerven in alle regio's. In deze studie ontwikkelden we een nieuwe eenvoudige methode met een hoog slagingspercentage om NK en/of T cel lijnen door PBMC kweken van CAEBV patiënten met een lage dosis van rhIL2 en een volume van 2 mL van volbloed zonder feeder cellen. De resultaten van deze methode gebleken zijn hoge efficiëntie en tijdwinst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Instituut voor genetica en ontwikkelingsbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen, en het protocol volgt de institutionele richtsnoeren voor menselijk welzijn.
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de werkstroom.
1. isolatie van in PBMC van CAEBV patiënten
- Zuiveren van primaire PBMC van 2 mL van de volbloed van CAEBV patiënten door verloop (bijvoorbeelddensiteitgradiënt-plaque) centrifugeren na instructies van de fabrikant. Als alternatief, ontdooi cryopreserved PBMC van vloeibare stikstof met RPMI 1640 medium.
- Voeg 2 µL van trypan blauw (0,4%) naar 18 µL celsuspensie, 3 min wachten om vlekken van cellen, spoel de suspensie op de plaat van de teller cel en meten van de concentratie en de levensvatbaarheid met een geautomatiseerde cel teller de cellen.
- Voorbereiden van de celsuspensie bij een dichtheid van 2-3 × 106 cellen/mL aangevuld met volledige RPMI 1640-kweekmedium dat 20% menselijk serum (warmte geïnactiveerd bij 56 ° C), 2 mM L-glutamine, en antibiotica (100 µg/mL streptomycine, 100 U/mL penicilline). Zaad 1 mL PBMC schorsing per putje in 24-well cel cultuur platen.
- Voeg 150 U rhIL-2 per putje.
- Plaats de platen van de cultuur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Op dag 2, het observeren van de morfologie van de cel onder een microscoop (200 X vergroting); cellen zijn in goede conditie wanneer ze licht en ronde zijn.
2. uitbreiding van de cellen en de nummering van de levensvatbare cellen
- Observeren van de morfologie van de cel onder een microscoop (200 X vergroting) en de voorwaarde van celgroei controleren door de nummering van de cellen voordat u wijzigt medium: 2 µL van trypan blauw (0,4%) aan 18 µL celsuspensie toevoegen en bereken de concentratie de cellen (zie 1.2, Figuur 2).
- Verwijderen van 500 µL van het medium in een 24-well-plate, en toevoegen van 500 µL verse volledige kweekmedium. 150U rhIL-2 per putje toevoegen.
- Wijzig het medium twee keer per week zoals in stap 2.2.
- Trekken de cel groeicurve (Figuur 3).
- Wanneer de levensvatbare cellen concentratie groter is dan 5 × 10-6/mL, verdeel cellen in nieuwe putten met een concentratie van 1-2 × 10-6 cellen/mL in elk putje. Dit proces duurt 2-4 weken.
3. cel fenotypering door Stroom Cytometry
- Wanneer cellen hebben uitgebreid, verzamelen van 1 × 10-6 cellen om te bepalen van de fenotypen van cellijnen. Centrifugeer bij 240 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur cellen (NK/T cellen neerslaat op de onderkant van de buis).
- Verwijder het supernatant, wassen van de neerslag door 7 mL PBS toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 240 x g bij kamertemperatuur. Eenmaal herhaald.
- 200 µL menselijk serum toevoegen aan elke buis, meng goed en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Centrifugeer cellen bij 240 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen bij 1 × 10-6/mL met koude PBSA (PBS+0.2%BSA). Verdeel cellen in 5 buizen, elke buis met 2 × 105 cellen.
- Centrifuge cellen bij 240 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met PBSA buffer of PBSA met 10 µL PE (of PE-Cy7) en 10 µL FITC label antilichamen om vlekken van cel receptoren van T of NK cellen op ijs, zoals is aangegeven in Figuur 4. Cellen met PBSA buffer geschorst worden gebruikt als een negatieve controle.
- Incubeer de cellen met antilichamen voor 20-30 min op ijs in het donker.
- Wassen van de cellen tweemaal met koude PBSA, resuspendeer de cellen met 300 µL koude PBSA.
- Analyseer het fenotype van de cel met een cytometer van de stroom.
- De Flow Cytometer in 'Werkblad maken' voorwaarde instellen. De experimentele sjabloon met een dot-perceel waarin vooruit scatter (FSC) versus kant scatter (SSC) instellen.
- Laad de isotype controle buis voor het optimaliseren van de FSC en SSC spanningen, en optimaliseren van de FSC-drempelwaarde te elimineren puin zonder zich te mengen met de bevolking van de cel van belang. Verwijder alle parameters staan, behalve de FSC, WS, FITC, PE en PE-Cy7.
- Compensatie met behulp van het besturingselement isotype en een enkele positieve controle in elke groep 2-kleur analyse uit te voeren.
- Laden van monsters en maak HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 en CD3 VS CD16 dot plots tonen verschillende bevolking van cellen.
Opmerking: PBMC werden gebruikt voor het uitvoeren van compensatie met behulp van het negatief/isotype-besturingselement en de enkele positieve controle. 2-kleur immunofluorescentie met stroom cytometer werd routinematig gebruikt voor het analyseren van de expressie van oppervlakte markers. De volgende antistoffen zijn inbegrepen: anti-HLA-DR, anti-CD4 anti-CD16 geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 geconjugeerd met phycoerythrin (PE) en anti-CD19 geconjugeerd met PE-Cy7.
4. uitbreiding en cryopreservatie van NK/T cellen
- Het medium veranderen nadat de cel fenotype analyse is voltooid. Verwijder de helft van het supernatans dat voorzichtig en raak de cellen aan de onderkant van de plaat. Voeg een gelijk volume verse kweekmedium dat 300 U/mL rhIL-2 aan de platen van de cel.
- De helft van het medium wijzigen om de 3 dagen (als 2.2) tot de cel clusters zijn duidelijk zichtbaar onder de Microscoop (Figuur 2). Dit proces duurt doorgaans 2-3 weken.
- Overbrengen in de cellen van 24-Wells-platen T25 cultuur kolven na het mengen van verschillende putjes van de dezelfde bloedlijn. Verdubbel de hoeveelheid kweekmedium het gele blijkt tot het volume van het medium breidt uit naar 10-15 mL. RhIL-2 met de concentratie van 150 U/mL toevoegen.
- Middellange 24u wijzigen voordat u bevriezing na 2-3 weken groeien, wanneer de cel massa met het blote oog kan worden waargenomen. Maatregel cel concentratie met een teller van de cel.
- De celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g centrifugeren en resuspendeer de pellet cel bij een dichtheid van 5-10 x 106 cellen/mL met de bevroren stockoplossing waarin foetale runderserum 90% en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Bevriezen met een snelheid van 1 ° C per min tot-80 ° C en breng direct in vloeibare stikstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 3 dagen cultuur tijdens de totstandbrenging van cellijnen, wordt de polymorfe cellen beginnen te verschijnen (Figuur 2). Na 7 dagen groeien cellen snel, zoals het aantal en de levensvatbaarheid van cellen worden verhoogd met een hoge snelheid (Figuur 3). Kleine clusters van cellen zijn duidelijk zichtbaar na 10-14 dagen groeien, wanneer de concentratie van de cel kan groter zijn dan 3-6 × 10-6. In deze periode, moeten cellen worden uitgebreid door de opsplitsing in twee of drie putjes van de plaat van de cultuur. Ongeveer een maand later, zodra de cel nummer bereikt 3-5 × 107, de telling is hoog genoeg voor behoud.
Een ander belangrijk punt is het bepalen van de fenotypen wanneer cellen hebben met succes werden gekweekt. Onze resultaten wijzen erop dat T (L196) en NK (M296) cellen kunnen worden gekweekt door de methode hierboven (Figuur 4) beschreven, en cellijnen kunnen tot stand worden gebracht met deze techniek, naarmate de cellen meer dan 3 maanden in goede conditie.
Figuur 1: schematische weergave van workflow. Op de eerste dag, werd anticoagulatie bloed bijeengezocht uit CAEBV patiënten, dan PBMC werden geïsoleerd en gekweekt met 1640 medium dat 20% menselijk serum en 150U/mL rhIL-2. De NK/T-cellen werden gekweekt bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2. Na 2-4 weken kweken, begon de cellen te snel groeien. Wanneer de concentratie 5 × 10-6 /mL overschreden, verdeeld we cellen in 2-3 putten bij concentratie van 2 × 10-6. Voortzetting van de cultuur voor 2-3 weken, werden cellen overgebracht van de 24-well-plaat in de maatkolf van T25 wanneer cel clusters duidelijk zichtbaar onder de Microscoop waren. Cryopreserve cellen wanneer de cel massa met het blote oog kan worden waargenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: cellulaire morfologische veranderingen in het proces van culturing. Cellen worden gekweekt en waargenomen gedurende het aangegeven aantal dagen. Polymorfe cellen (de pijlen wees) waren zichtbaar onder de Microscoop duidelijk na 3-7 dagen, en cellen begon te groeien snel na 7-14 dagen cultuur. De oorspronkelijke vergroting van de lichte microscopie was 200 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de groeikrommes van celproliferatie. Na 7 dagen van kweken, cellen begon te groeien snel (A) en met hoge levensvatbaarheid (B). Concentratie en de levensvatbaarheid van de cellen werden gemeten door een geautomatiseerde cel teller met de volgende procedure: Voeg 2 µL van trypan blauw (0,4%) naar 18 µL celsuspensie voor kleuring, 3 min wachten, spoel de suspensie aan de cel teller plaat en meten van de cellen concentratie en de levensvatbaarheid van de cellen met een geautomatiseerde cel teller. De foutbalken worden de standaarddeviaties van drie replica's. L196, Z290, M296, L311 zijn de namen van vier cellijnen. De beginconcentratie te meten van de groeicurve is ongeveer 3 × 10-6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger gating strategie voor stroom cytometry analyse van cellijnen, L196 en M296. PBMC werden gebruikt voor het aanpassen van FSC en SSC spanningen. Het cluster van live en één lymfocyten was omheinde voor P1 in de FSC en SSC plot. Isotype controle en enkele positieve controles werden gebruikt voor het uitvoeren van compensatie. Vier paar 2-kleur immunofluorescentie geconjugeerd antilichaam kleuring werden gebruikt voor het analyseren van de expressie van oppervlakte markers. Anti-HLA-DR en anti-CD19 werden gebruikt voor het detecteren van B-cellen, overwegende dat anti-CD3, anti-CD4 en anti-CD8 werden gebruikt om het detecteren van T-cellen. Anti-CD16 en anti-CD56 werden gebruikt voor het definiëren van NK-cellen. (A) het fenotype van L196 is CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, de belangrijkste celtype is CD8 +. (B) M296 is CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, de belangrijkste celtype is CD16 + CD56 +. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol, heeft een nieuwe techniek voor de vaststelling van NK/T cellijnen van volbloed van CAEBV patiënten ontwikkeld. Vergeleken met de bestaande methoden, is het grote voordeel van deze methode zijn eenvoud en zijn eis van slechts een kleine hoeveelheid bloed, terwijl het vertoont een hoog slagingspercentage en goede voorwaarden voor de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien kunnen NK/T cellijnen worden vastgesteld door het kweken van PBMC zonder eerst te controleren de celtypes het EBV latent geïnfecteerd van tevoren, als de bepaling zou verbruiken meer bloed en tijd voor het kweken. Uitwijkmogelijkheid, cellijnen kunnen worden geanalyseerd en verschillende fenotypes van cellen met stroom cytometry na lijn celinstelling gezuiverd kunnen worden. Bovendien, de methode maakt gebruik van een lage dosis rhIL-2 en moet geen feeder-cellen. Met deze methode hebben we ontwikkeld 7 cellijnen van 8 CAEBV patiënten en cryopreserved ze binnen een maand. Degene die niet zijn uitgegroeid tot een cellijn levend kan worden gehandhaafd voor meer dan 5 maanden zonder significante verspreiding, en de redenen achter dit moeten verdere exploratie.
Het is noodzakelijk om op te merken dat de celgroei is strikt afhankelijk van de aanwezigheid van recombinante menselijke IL-2, die met de eerdere verslagen20,21 strookt; met geen menselijke IL-2, zullen de cellen sterven in 3 weken. Blijkbaar, is een hoge kwaliteit van IL-2 is essentieel voor celproliferatie, hoewel de factoren die bepalend zijn voor de proliferatieve capaciteit van cellen in vitro moeten nog worden verduidelijkt. De dosis van IL-2 vereist is variabel tussen verschillende cellijnen, bijvoorbeeld, 50U/mL is voldoende om de verspreiding van M296. Echter, is niet de goedkoopste en meest betrouwbare concentratie voor de vaststelling van NK/T cellijnen voorgelegd in de studie; inderdaad, 150 U/mL is voldoende voor succes.
In dit proces van het kweken van de cel, van de elementen op het gebied van celgroei, is de levensvatbaarheid van primaire PBMC het belangrijkste. Om succes te verzekeren, moet de PBMC zo vers mogelijk. Ongetwijfeld, concentratie van de cel is een belangrijke factor die succesvolle kweken, daarom moet de drempelwaarde niet lager dan 105 per mL. Als het getal van de cel totaal geïsoleerd uit het monster minder dan 10 is is6, met behulp van een mini goed cel plaat te handhaven van een voldoende cel concentratie een alternatieve keuze in oorspronkelijke cultuur. Bovendien kon T-cel en NK-lijn met zelfs een beperkte hoeveelheid perifeer bloed worden vastgesteld bij het gebruik van de hemolytische reactie te verrijken PBMC schreven we eerder22. Zoals beschreven in het protocol, is de menselijk serum een andere belangrijke factor voor de overleving van de cel aan het begin van de cultuur. Wij speculeren dat sommige onbekende ingrediënten bestaan in het serum die zijn afwezig of anders in de foetale runderserum en zijn noodzakelijk voor T/NK celproliferatie.
Er zijn twee beperkingen van de methode. Ten eerste, er zijn verschillende onbeantwoorde vragen over deze methode, zoals hoe en waarom EBV de NK of T infecteert cellen in vivo, de mechanismen van de NK/T cel groei en verspreiding in vitroen welke soorten cel kunnen worden vastgesteld in cellijnen in één patiënt. Hoewel wij kunnen geen controle over de celtype en zuiverheid, die zijn niet bepaald door de methode, zijn deze factoren mogelijk afhankelijk van de cellen die EBV in patiënten infecteert. Met dit protocol, kunnen NK en T cellen worden opgericht in cellijnen, hoewel deze methode kon niet bij voorkeur cultuur één type. Er is echter een overheersende groep van deze cellen. Ten tweede, er was een verslag die T-cel en NK klonen van patiënten met LPD of NK/T lymfoom kon worden vastgesteld om cellijnen, terwijl anderen konden worden gehandhaafd voor verscheidene maanden17. Cellen die zijn verworven in de huidige studie kunnen vermenigvuldigen ruim 3 maanden, maar of zij kunnen vermenigvuldigen voor onbepaalde tijd moeten worden gevalideerd.
Kortom, met behulp van deze methode, kunnen meer cellijnen van CAEBV of NK/T lymfomen gemakkelijk verkregen worden met een beperkte hoeveelheid bloed en een lage dosis van IL-2 zonder feeder cellen. Deze cellijnen zal bijdragen tot de studie EBV persistentie in NK/T cellen en pathogenese van EBV bijbehorende leukemie of lymphoma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.Z., X.Z. en X.C. zijn mede-uitvinders op in afwachting van octrooi-aanvragen die betrekking hebben op mogelijke toepassingen van deze methode voor de vaststelling van NK/T cellijnen en de cellijnen gevestigd in deze studie. D.Z., X.Z. en X.C. verklaren geen concurrerende financiële belangen bij dit werk. De resterende auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de sleutel projecten van Chinese Academie van Wetenschappen (KFZD-SW-205), strategische biologische middelen technologie steunregeling van Chinese Academie van Wetenschappen (CZBZX-1 en ZSSB-004) en door subsidies van de National Science Foundation of China) 81401640) en Shanghai natuurwetenschappen Fonds (14ZR1434800).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I.
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E.
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
