Summary
Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.
Abstract
Eine Reihe von Methoden wurden beschrieben, NK/T-Zell-Linien von Patienten mit Lymphom oder Lymphoproliferative Syndrome zu etablieren. Diese Methoden angewendet Feeder-Zellen, gereinigten NK oder T-Zellen mit mehr als 10 mL Blut oder eine hohe Dosis von IL-2. Diese Studie stellt eine neue Methode, eine leistungsstarke und einfache Strategie zu etablieren, dass NK und T-Zell-Linien durch Kultivierung der peripheren Mononukleäre Zellen (PBMC) Blut mit dem Zusatz von rekombinanten menschlichen Il-2 (RhIL-2) und weniger als 2 mL Vollblut verwendet. Die Zellen können in zwei Wochen schnell vermehren und für mehr als 3 Monate gehalten werden. Mit dieser Methode wurden 7 NK oder T-Zell-Linien mit einer hohen Erfolgsquote eingerichtet. Diese Methode ist einfach, zuverlässig und für Schaffung Zelllinien aus mehr Fälle von CAEBV oder NK/T-Zell-Lymphom.
Introduction
Epstein - Barr-Virus (EBV) ist allgegenwärtig und befällt nicht nur B-Zellen, sondern auch T und natürlichen killer (NK)-Zellen, wodurch eine Reihe von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen (LPD) und Lymphom/Leukämie, wie z. B. EBV-assoziierten hemophagocytic Lymphohistiocytosis, Hydroa Vacciniforme-wie Lymphom, extranodal NK/T-Zell-Lymphom, nasale Art und aggressive NK Zell-Leukämie1,2,3. Unter diesen ist schwerer chronisch aktive EBV (SCAEBV) Erkrankung, die einfallenden vor allem in Ostasien, und das gilt jetzt als ein LPD verursacht durch klonale Expansion von EBV-infizierte T oder NK Zellen4,5,6, 7, aber ohne die scheinbare Immunschwäche präsentieren in infektiöse Mononukleose (IM)-wie Symptomen wie Fieber, Hepatosplenomegalie, Lymphadenopathie und Leberfunktionsstörungen, anhaltend oder wiederkehrend sowie hohen EBV-DNA in die peripheren Blut8,9. Patienten mit CAEBV haben eine schlechte Prognose10,11, und seine Pathogenese und die Rolle der EBV ist unklar. Daher Zellinien von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen abgeleitet und Lymphome sind sehr hilfreich, wie Zellmodelle für Klärung des Mechanismus der EBV NK oder T-Zell-Proliferation und seine Beziehung mit hoher Inzidenz von Leukämie induziert oder Lymphom.
Bislang wurden mehrere Zellinien mit verschiedenen Techniken12,13,14,15,16eingerichtet. Eine menschliche NK-Zell-Linie, NK-YS, entstand von NK-Zellen-Lymphom/Leukämie, durch Kultivierung zusammen mit einer Maus Stromazellen Zelllinie als Zubringer und in Anwesenheit von RhIL-2 in einer Konzentration von 20U pro mL15. KAI3 war ein weiterer NK-Zell-Linie gegründet von Patienten mit einer schweren Moskito-Allergie oder SCAEBV mit autologen Lymphoblastoid Zelllinie (LCL), B-Zellen durch EBV, als Feeder-Zellen und Zugabe von RhIL-2 bei 100U/mL16verwandelt. SNK6 und SNT8 wurden von Tumorgewebe des nasalen NK/T Zelle Lymphom Patienten abgeleitet, durch Zugabe von Hochdosis-RhIL-2 (700U/mL)12. Mit ähnlicher Technik war die SNK-1 Zelle von CAEBV Patienten, kultiviert von PBMC durch T-Zellen entfernen und Hinzufügen von 700U/mL RhIL-213,17. SNT13 und SNT15 wurden durch Entfernen von CD4 + und CD8 + Zellen18gegründet. Bisher wurden alle anderen T-Zellen und NK-Zell-Linien von EBV-NK/T LPD Patienten mit dieser Methode19entwickelt.
Die Nachteile der oben erwähnten vorhandenen Methoden gehören die Beschäftigung von Feeder-Zellen, das Erfordernis einer hohen Dosis von IL-2, die Auslastung von mehr als 10 mL Vollblut oder die Reinigung von NK/T-Zellen, die sehr anspruchsvoll in der Klinik die Notwendigkeit der Überprüfung, welche Arten von Zellen, dass EBV latent infiziert vor Beginn der Kultur. Als CAEBV vor allem bei Kindern in Asien tritt, ist 10 mL Blut nicht einfach, in allen Regionen zu erwerben. In dieser Studie haben wir eine neue einfache Methode mit einer hohen Erfolgsquote, NK und/oder T-Zell-Linien zu etablieren, durch Kultivierung PBMC von CAEBV Patienten mit niedrig dosierten rhIL2 und ein Volumen von 2 mL Vollblut ohne Feeder-Zellen entwickelt. Die Ergebnisse dieser Methode haben ihre hohe Effizienz und Zeitersparnis bewiesen.
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Protocol
Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Institut für Genetik und Entwicklungsbiologie, chinesische Akademie von Wissenschaften, genehmigt und das Protokoll folgt den institutionellen Richtlinien für menschliches Wohlergehen.
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des Workflows.
1. Isolierung von PBMC von CAEBV Patienten
- Primäre PBMC von 2 mL Vollblut von CAEBV Patienten durch den Farbverlauf (z.B.Ficoll-Plakette) zu reinigen Zentrifugation, die Anweisungen des Herstellers. Alternativ kryokonserviert Tauwetter PBMC von flüssigem Stickstoff mit RPMI 1640 Medium.
- 18 µL Zellsuspension 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzufügen, 3 min. zu beflecken Zellen, das Fahrwerk an die Zelle Gegenplatte übertragen und messen die Zellen Konzentration und Rentabilität mit einem automatisierten Zelle Zähler warten.
- Bereiten Sie die Zellsuspension bei einer Dichte von 2-3 × 106 Zellen/mL mit kompletten RPMI 1640 Kulturmedium mit 20 % humanem Serum (Hitze inaktiviert bei 56 ° C), 2 mM L-Glutamin ergänzt und Antibiotika (100 µg/mL Streptomycin, 100 U/mL Penicillin). Samen 1 mL PBMC Suspension pro Bohrloch in 24 wohlen Zellplatten Kultur.
- Fügen Sie 150 U RhIL-2 pro Bohrloch.
- Legen Sie die Kultur-Platten in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Am 2. Tag beobachten Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop (200 X Vergrößerung); Zellen sind in einem guten Zustand, wenn sie hell und rund sind.
2. Ausbau der Nummerierung der lebensfähigen Zellen und Zellen
- Die Zellmorphologie unter dem Mikroskop (200 X Vergrößerung) zu beobachten und überwachen den Zustand des Zellwachstums durch Nummerierung der Zellen vor dem Wechsel Medium: 18 µL Zellsuspension 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzu, und die Zellen Konzentration zu berechnen (siehe 1.2, Abbildung 2).
- 500 µL des Mediums in einer 24-Well-Platte zu verwerfen, und 500 µL frische komplette Kulturmedium hinzufügen. Fügen Sie 150U RhIL-2 pro Bohrloch.
- Verändern Sie zweimal in der Woche wie in Schritt 2.2 das Medium.
- Ziehen Sie die Zelle Wachstumskurve (Abbildung 3).
- Überschreitet der lebensfähigen Zellen Konzentration 5 × 106/mL, teilen Sie sich Zellen in neue Brunnen in einer Konzentration von 1 – 2 × 106 Zellen/mL in jede Vertiefung. Dieser Vorgang dauert ca. 2-4 Wochen.
3. Zelle Phänotypisierung von Durchflusszytometrie
- Wenn Zellen erweitert haben, sammeln Sie 1 × 106 Zellen um die Phänotypen der Zell-Linien zu bestimmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 240 X g für 5 min bei Raumtemperatur (NK/T-Zellen werden an der Unterseite des Rohres Niederschlag).
- Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie den Niederschlag durch Zugabe von 7 mL PBS. Zentrifuge für 5 min bei 240 X g bei Raumtemperatur. Einmal wiederholen.
- Jedes Rohr 200 µL Humanserum hinzufügen, gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren Sie Zellen bei 240 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen bei 1 × 106/mL mit kalten PBSA (PBS+0.2%BSA). Teilen Sie Zellen in 5 Röhren auf, jedes Röhrchen mit 2 × 105 Zellen.
- Zentrifuge Zellen bei 240 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und wieder auszusetzen, die Zellen mit PBSA Puffer oder PBSA mit 10 µL PE (oder PE-Cy7) und 10 µL FITC beschriftet Antikörper, die Zell-Rezeptoren von T oder NK-Zellen auf dem Eis zu beflecken, wie Abbildung 4angegeben ist. Zellen mit PBSA Puffer ausgesetzt sind als Negativkontrolle verwendet.
- Inkubation der Zellen mit Antikörpern für 20-30 min auf Eis im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalten PBSA, wieder auszusetzen, die Zellen mit 300 µL kalter PBSA.
- Analysieren Sie die Zelle Phänotyp mit einem Durchflusszytometer.
- Richten Sie den Flow Cytometer in "Arbeitsblatt erstellen" Zustand. Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Dot-Plot, der forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC) anzeigt.
- Laden Sie der Isotype Kontrollröhrchen um den FSC und SSC Spannungen zu optimieren und optimieren Sie den FSC-Schwellenwert um Ablagerungen zu beseitigen ohne Beeinträchtigung der Zellpopulation von Interesse. Löschen Sie alle Parameter mit Ausnahme von FSC, SSC, FITC, PE und PE-Cy7.
- Führen Sie die Isotype-Steuerung und einer einzigen positiven Kontrolle in jeder Gruppe 2-Farbanalyse mit Ausgleich.
- Laden Sie Proben und erstellen Sie HLA-DR VS CD19 CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 und CD3 VS CD16 Punkt plottet zeigt verschiedene Bevölkerung der Zellen.
Hinweis: PBMC wurden verwendet, um mit negativen/Isotype Steuerungen und einzigen positiven Ausgleich durchzuführen. 2-Farben-Immunfluoreszenz mit Durchflusszytometer war routinemäßig verwendet, um den Ausdruck der Oberflächenmarker zu analysieren. Die folgenden Antikörper sind enthalten: Anti-HLA-DR, Anti-CD4, Anti-CD16 konjugiert mit Fluorescein erfolgt (FITC), Anti-CD8, Anti-CD56, CD3 konjugiert mit Phycoerythrin (PE) und Anti-CD19 konjugiert mit PE-Cy7.
4. Ausbau und Kryokonservierung von NK/T-Zellen
- Ändern Sie das Medium, wenn die Zelle Phänotyp-Analyse abgeschlossen ist. Sorgfältig entfernen Sie die Hälfte des Überstands und berühren Sie die Zellen an der Unterseite der Platte. Fügen Sie die gleiche Menge an frischem Nährmedium mit 300 U/mL RhIL-2 zu den Zellplatten.
- Die Hälfte des Mediums ändern alle 3 Tage (als 2.2) bis die Zelle Cluster sind deutlich sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 2). In der Regel dauert dieser Vorgang ca. 2-3 Wochen.
- Transfer der Zellen vom 24-Well Platten zum T25 Kulturflaschen nach dem Mischen verschiedenster Brunnen derselben Linie. Doppelte Volumen Kulturmedium wie es gelb bis das Volumen des Mediums wird erweitert um 10-15 mL. Fügen Sie RhIL-2 mit der Konzentration von 150 U/mL.
- Ändern mittlere 24 h vor dem Einfrieren nach 2-3 Wochen wachsen, wenn die Zelle Masse mit bloßem Auge beobachtet werden kann. Messen Sie Zellkonzentration mit einer Zelle Zähler.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 240 X g und wieder auszusetzen Sie Zelle Pellet bei einer Dichte von 5-10 x 106 Zellen/mL mit gefrorenen Vorratslösung der fötalen Rinderserum 90 % und 10 % Dimethylsulfoxide (DMSO) enthält. Mit einer Rate von 1 ° C / Min. bis-80 ° C eingefroren und dann direkt in flüssigen Stickstoff übertragen.
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Representative Results
Nach 3 Tagen während der Einrichtung von Zelllinien Kultur, beginnen die polymorphen Zellen erscheinen (Abbildung 2). Nach 7 Tagen wachsen Zellen schnell, da sowohl die Anzahl als auch die Lebensfähigkeit der Zellen mit einer hohen Rate (Abbildung 3) erhöht werden. Kleine Gruppen von Zellen sind deutlich sichtbar nach 10-14 Tagen wächst, wenn die Zellkonzentration 3-6 × 106überschreiten kann. In diesem Zeitraum sollten die Zellen durch Teilung in zwei oder drei Vertiefungen der Platte Kultur erweitert werden. Etwa einen Monat später wird einmal die Zelle Nummer erreicht 3-5 × 107, die Anzahl der hoch genug ist, für die Erhaltung.
Eine weitere wichtige Frage ist, wann die Phänotypen Zellen erfolgreich kultiviert worden sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass T (L196) und NK (M296) Zellen von oben (Abbildung 4) beschriebenen Verfahren gezüchtet werden können und Zelllinien mit dieser Technik hergestellt werden konnte, wie die Zellen länger als 3 Monate in gutem Zustand wuchs.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows. Am ersten Tag war Antikoagulans Blut von CAEBV Patienten gesammelt, dann PBMC wurden isoliert und kultiviert mit 1640 Medium mit 20 % humanem Serum und 150U/mL RhIL-2. Die NK/T-Zellen wurden bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2angebaut. Nach 2-4 Wochen züchten begann die Zellen zu schnell wachsen. Wenn die Konzentration 5 × 106 /mL überschritten, wir in ca. 2-3 Brunnen in Konzentration von 2 × 106Zellen aufgeteilt. Fortsetzung der Kulturkreis für ca. 2-3 Wochen, wurden Zellen übertragen von 24-Well-Platte in T25 Kolben als Zellcluster deutlich sichtbar unter dem Mikroskop waren. Tiefgefrieren Zellen wenn die Zelle Masse mit bloßem Auge beobachtet werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: zelluläre morphologische Veränderungen bei der Kultivierung. Zellen werden kultiviert und für die angegebene Anzahl an Tagen beobachtet. Polymorphe Zellen (die Pfeile darauf hingewiesen) waren eindeutig nach 3-7 Tagen unter dem Mikroskop sichtbar, und Zellen zu schnell nach 7-14 Tage Kultur zu wachsen begann. Die ursprüngliche Vergrößerung für Lichtmikroskopie war 200X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: die Wachstumskurven der Zellproliferation. Nach 7 Tagen Kultivierung, Zellen zu schnell wachsen (A) begann und mit hoher Rentabilität (B). Konzentration und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden durch eine automatisierte Zelle Zähler mit dem folgenden Verfahren gemessen: 18 µL Zellsuspension zum Beizen 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzu, 3 min warten, das Fahrwerk auf die Zelle Gegenplatte übertragen, und Messen der Zellen Konzentration und die Zellviabilität mit einem automatisierten Zelle Zähler. Die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen der drei Replikate. L196, Z290, M296, L311 sind die Namen der vier Zell-Linien. Die ab Konzentration, Wachstumskurve zu messen ist ca. 3 × 106. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Anspritzung Strategie für Flow-Zytometrie-Analyse von Zelllinien L196 und M296. PBMC wurden für die Anpassung der FSC und SSC Spannungen verwendet. Die Ansammlung von Live- und einzelne Lymphozyten wurde für P1 im FSC und SSC Plot bewachte. Die Isotype Kontrolle und einzelne Positivkontrollen wurden zur Entschädigung führen. Vier Paare von 2-Farben-Immunfluoreszenz konjugierten Antikörper Färbung wurden verwendet, um den Ausdruck der Oberflächenmarker zu analysieren. Anti-HLA-DR und Anti-CD19 wurden zur B-Zellen erkennen während Anti-CD3, Anti-CD4 und Anti-CD8 T-Zellen erkennen verwendet wurden. Anti-CD16 und Anti-CD56 wurden verwendet, um die NK-Zellen zu definieren. (A) ist der Phänotyp der L196 CD19-HLA-DR + CD16-CD8 + CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, der wichtigsten Zellentyp ist. (B) M296 ist CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, die wichtigsten Zelltyp ist CD16 + CD56 +. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Protokoll wurde eine neuartige Technik für den Aufbau von NK/T-Zell-Linien aus dem Vollblut von CAEBV Patienten entwickelt. Im Vergleich mit den bisherigen Verfahren, ist der Hauptvorteil dieser Methode seiner Einfachheit und seiner Forderung nach nur ein kleines Volumen des Blutes, während es eine hohe Erfolgsquote und gute Bedingungen der Zellviabilität aufweist. Darüber hinaus können NK/T-Zell-Linien eingerichtet werden, durch Kultivierung PBMC ohne festzustellen, dass die Zelltypen der EBV latent infiziert im Voraus, wie die Ermittlung mehr Blut und Zeit vor der Kultivierung verbrauchen würde. Alternativ Zell-Linien können analysiert werden und unterschiedliche Phänotypen von Zellen mit Durchflusszytometrie nach Zelle Zeile Gründung gereinigt werden können. Außerdem wird die Methode verwendet eine niedrige Dosis von RhIL-2 und braucht keine Feeder-Zellen. Mit dieser Methode haben wir 7 Zelllinien aus 8 CAEBV Patienten entwickelt und konserviert sie innerhalb eines Monats. Derjenige, der nicht in einer Zelllinie entwickelt wurde kann für mehr als 5 Monate ohne signifikante Verbreitung lebendig erhalten werden, und Gründe dafür benötigen weitere Exploration.
Es ist notwendig zu beachten, dass Zellwachstum streng abhängig von der Anwesenheit von rekombinanten menschlichen Il-2, die im Einklang mit früheren Berichten20,21; mit keinen menschlichen Il-2 sterben die Zellen in 3 Wochen. Offenbar ist eine hohe Qualität von IL-2 für Zellproliferation, obwohl die Faktoren, die die proliferative Kapazität der Zellen in Vitro noch geklärt werden müssen. Die Dosis von IL-2 erforderlich ist variabel zwischen verschiedenen Zelllinien, beispielsweise 50U/mL ist zufriedenstellend, die Verbreitung von M296 beizubehalten. Die wirtschaftliche und zuverlässige Konzentration für den Aufbau von NK/T-Zell-Linien ist jedoch nicht in der Studie wurde; 150 U/mL ist ausreichend für den Erfolg.
Das wichtigste ist dabei der Zelle Kultivierung der Elemente beeinflussen Zellwachstum die Lebensfähigkeit des primären PBMC. Um Erfolg zu gewährleisten, sollte die PBMC so frisch wie möglich sein. Zweifellos, Zellkonzentration ist ein wichtiger Faktor erfolgreicher Kultivierung, daher des Schwellenwerts sollte nicht niedriger als 105 pro mL. Wenn die gesamte Zellzahl isoliert aus der Probe weniger als 10 ist6, mit einem Mini-Zelle Platte weiterhin eine angemessene Zellkonzentration eine Alternative in der ursprünglichen Kultur. Darüber hinaus konnte NK und T-Zell-Linie mit sogar eine begrenzte Menge an peripherem Blut hergestellt werden, wenn die hämolytische Reaktion mit PBMC zu bereichern, wie wir bereits,22 berichtet. Wie im Protokoll beschrieben, ist die menschlichen Serum ein weiterer wichtiger Faktor für das Überleben der Zelle zu Beginn der Kultur. Wir spekulieren, dass einige unbekannten Zutaten bestehen im Serum die abwesend oder fötalen Rinderserum unterschiedlich und sind notwendig für T/NK-Zell-Proliferation.
Es gibt zwei Einschränkungen der Methode. Erstens gibt es mehrere unbeantwortete Fragen über diese Methode, wie z. B. wie und warum EBV die NK oder T infiziert-Zellen in Vivo, die Mechanismen des NK/T Zelle Wachstum und Proliferation in-vitro-und welche Zelle sein können in Zelllinien in gegründet ein Patient. Obwohl wir nicht kontrollieren konnte, der Zelltyp und Reinheit, die nicht von der Methode ermittelt werden, könnte diese Faktoren abhängig von den Zellen, die bei Patienten EBV infiziert. Mit diesem Protokoll konnte in Zelllinien, NK und T-Zellen hergestellt werden, obwohl diese Methode nicht bevorzugt eine Art Kultur könnte. Dennoch gibt es eine dominierende Gruppe dieser Zellen. Zweitens gab es ein Bericht, der NK und T-Zell-Klone von Patienten mit LPD oder NK/T Lymphom, Zell-Linien festgestellt werden konnte, während andere für mehrere Monate17aufrechterhalten werden könne. Zellen gewonnen, die in der vorliegenden Studie können weit über 3 Monate vermehren, aber, ob sie auf unbestimmte Zeit vermehren konnte überprüft werden müssen.
Fazit: mit dieser Methode erhalten Sie leicht mehr Zell-Linien aus CAEBV oder NK/T-Lymphome mit eine begrenzte Menge an Blut und einen Low-Dose von IL-2 ohne Feeder-Zellen. Diese Zelllinien werden dazu beitragen, das Studium der EBV Hartnäckigkeit in NK/T-Zellen und Pathogenese der EBV assoziiert, Leukämie oder Lymphom.
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Disclosures
D.Z., X.Z. und X.C. sind Co-Erfinder auf Patentanmeldungen für Einsatzmöglichkeiten dieser Methode zur Festsetzung von NK/T-Zell-Linien und die Zell-Linien, die in dieser Studie festgestellt. D.Z., X.Z. und X.C. erklären, keine finanziellen Interessenkonflikte in dieser Arbeit. Die verbleibenden Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Schlüssel Projekte der chinesischen Akademie der Wissenschaften (KFZD-SW-205), strategische biologische Ressourcen Technologie-Support-System der chinesischen Akademie der Wissenschaften (CZBZX-1 und ZSSB-004) und durch Zuschüsse vom National Science Foundation of China (unterstützt 81401640) und Shanghai Natural Science Fund (14ZR1434800).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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