Summary
Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.
Abstract
Vários métodos têm sido descritos para estabelecer linhas de células NK/T de pacientes com síndrome de linfoma ou linfoproliferativa. Estes métodos empregados alimentador células, purificado de células NK ou T com tanto quanto 10 mL de sangue ou uma dose elevada de Il-2. Este estudo apresenta um novo método com uma estratégia simples e poderosa para estabelecer linhas NK e células T pelo cultivo do periférico sangue células mononucleares (PBMC) com a adição de Il-2 humana recombinante (rhIL-2) e usa tão pouco quanto 2 mL de sangue total. As células podem proliferar rapidamente em duas semanas e ser mantidas por mais de 3 meses. Com este método, 7 linhas de NK, ou células T se estabeleceram com uma elevada taxa de sucesso. Este método é simples, confiáveis e aplicáveis ao estabelecimento de linhagens celulares de mais casos de linfoma de células CAEBV ou NK/T.
Introduction
Vírus de Epstein - Barr (EBV) é onipresente e infecta não apenas as células B, mas também T e as células killer naturais (NK), que faz com que um número de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, tais como hemofagocítica EBV-associados hemophagocytosis, hydroa vaciniforme, como linfoma, linfoma de células T/NK extranodal, tipo nasal e NK agressiva células leucemia1,2,3. Entre estes é crônica ativa EBV (SCAEBV) doença grave, que é incidente principalmente no leste da Ásia, e que é agora considerado um LPD causada pela expansão clonal de infectadas por EBV T ou NK células4,5,6, 7, mas sem a aparente da imunodeficiência presentes na mononucleose infecciosa (IM)-como sintomas que incluem febre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia e disfunção hepática persistentemente ou periódica, bem como alta EBV-DNA carregar na sangue periférico8,9. Pacientes com CAEBV têm um prognóstico pobre10,11e sua patogênese e desconhece-se o papel do EBV. Portanto, cela linhas derivadas de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T e linfomas são muito úteis como modelos de celular para esclarecer o mecanismo de EBV induzida proliferação NK, ou células T e a sua relação com alta incidência de leucemia ou linfoma.
Até à data, foram estabelecidas várias linhagens celulares com diferentes técnicas12,13,14,15,16. Uma linhagem de células NK humana, NK-YS, estabeleceu-se de leucemia/linfoma de células NK, por co cultivo com uma linhagem de células do estroma do rato como alimentador e na presença de rhIL-2 em uma concentração de 20U por mL15. KAI3 era uma outra linha de célula NK estabelecida de pacientes com alergia severa mosquito ou SCAEBV com linha de células autólogas lymphoblastoid (LCL), células B, transformadas por EBV, como células de alimentador e adição de rhIL-2 em 100U/mL16. SNK6 e SNT8 foram derivados de tecidos de tumor da nasais pacientes de linfoma de células NK/T pela adição de altas doses de rhIL-2 (700U/mL)12. Com uma técnica semelhante, a célula de SNK-1 foi de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC, removendo as células T e adicionando 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 foram estabelecidas através da remoção de CD4 + e CD8 + células18. Até agora, outras linhas de celular de células T e NK de pacientes EBV-NK/T LPD foram todos desenvolvidas com este método de19.
As desvantagens dos métodos existentes acima mencionados incluem o emprego de células do alimentador, a exigência de uma alta dose de IL-2, a utilização de sangue tanto quanto 10 mL ou a purificação de células NK/T, que é muito desafiador na clínica devido a a necessidade de verificar quais os tipos de célula que EBV Latentemente infecta antes de começar a cultura. Como CAEBV ocorre principalmente em crianças na Ásia, 10 mL sangue não é fácil de adquirir em todas as regiões. Neste estudo, nós desenvolvemos um novo método simples com uma elevada taxa de sucesso para estabelecer linhas NK e/ou células T pelo cultivo PBMC de pacientes CAEBV, usando uma dose baixa de rhIL2 e um volume de 2 mL de sangue total sem células de alimentador. Os resultados deste método provaram sua eficiência elevada e economia de tempo.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética do Instituto de genética e biologia do desenvolvimento, da Academia Chinesa de Ciências, e o protocolo segue as diretrizes institucionais para o bem-estar humano.
Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema de fluxo de trabalho.
1. isolamento de PBMC de pacientes CAEBV
- Purificar o primário PBMC de 2 mL de sangue total de pacientes CAEBV por gradiente (por exemplo, Ficoll-placa) centrifugação seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, o degelo criopreservado PBMC de nitrogênio líquido com meio RPMI 1640.
- Adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) de suspensão de células 18 µ l, espere 3 min para manchar as células, a suspensão de transferência para a placa de contador de células e medir concentração e viabilidade com um contador de célula automatizada das células.
- Preparar a suspensão de células em uma densidade de 2-3 × 106 células/mL suplementado com meio de cultura RPMI 1640 completo contendo 20% de soro humano (calor inativado a 56 ° C), 2 mM L-glutamina e antibióticos (estreptomicina 100 de µ g/mL, 100 penicilina U/mL). 1 mL de suspensão PBMC por bem em placas de cultura de células 24 poços de semente.
- Adicione 150 U rhIL-2 por bem.
- Colocar as placas de cultura numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C.
- No dia 2, observar a morfologia celular sob um microscópio (ampliação de X 200); as células estão em boas condições quando eles são brilhantes e redondos.
2. a expansão das células e as células viáveis de numeração
- Observar a morfologia celular sob um microscópio (ampliação de X 200) e monitorar a condição do crescimento celular, numerando as células antes de alterar o médio: adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) de suspensão de células 18 µ l e calcular a concentração das células (ver 1.2, Figura 2).
- Descartar a 500 µ l de meio em uma placa de 24 e adicionar 500 µ l completa cultura meio fresco. Adicione 150U rhIL-2 por bem.
- Mude o meio duas vezes por semana como no passo 2.2.
- Traçar a curva de crescimento de célula (Figura 3).
- Quando a concentração de células viáveis excede 5 × 106/mL, divida células em novos poços na concentração de 1 a 2 × 106 células/mL em cada poço. Este processo demora de 2 a 4 semanas.
3. célula fenotipagem por citometria de fluxo
- Quando as células têm se expandido, colete 1 × 106 células para determinar os fenótipos de linhas celulares. Centrifugar as células a 240 x g por 5 min à temperatura ambiente (células NK/T irão precipitar no fundo do tubo).
- Desprezar o sobrenadante, lave a precipitação pela adição de 7 mL de PBS. Centrifugue por 5 min a 240 x g , à temperatura ambiente. Repeti uma vez.
- Adicionar 200 µ l de soro humano para cada tubo, misture bem e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar as células a 240 x g por 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 × 106/mL com PBSA frio (PBS+0.2%BSA). Divida células em 5 tubos, cada tubo contendo 2 × 105 células.
- Células de centrífuga a 240 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com PBSA buffer ou PBSA contendo 10 µ l PE (ou PE-Cy7) e 10 µ l FITC rotulado anticorpos para manchar os receptores celulares de células T ou NK no gelo como é indicado pela Figura 4. Células suspendidas com buffer PBSA são usadas como um controle negativo.
- Incube as células com anticorpos para 20-30 min no gelo no escuro.
- Lavar as células duas vezes com frio PBSA, re-suspender as células com 300 µ l PBSA frio.
- Analise o fenótipo da célula com um citômetro de fluxo.
- Configure o citômetro de fluxo, na condição de "Criar planilha". Configure o modelo experimental com uma trama de pontos que exibe a dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC).
- Carregar o isotipo controle tubo para otimizar as tensões SSC e FSC e otimizar o valor de limiar do FSC para eliminar detritos sem interferir com a população de células de interesse. Exclua todos os parâmetros, exceto o FSC, SSC, FITC, PE e PE-Cy7.
- Realize a compensação usando o isotipo controle e um único controlo positivo em cada grupo de análise de 2 cores.
- Carregar amostras e criar HLA-DR VS CD19, CD4 CD8 VS, CD56 VS CD16 e CD3 VS CD16 lotes do ponto mostrando diferente população de células.
Nota: PBMC foram utilizados para realizar a compensação usando o controle negativo/isotype e o único controle positivo. 2-cor imunofluorescência com citômetro de fluxo foi usada rotineiramente para analisar a expressão de marcadores de superfície. Os anticorpos seguintes estão incluídos: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3, conjugado com ficoeritrina (PE) e anti-CD19 conjugados com PE-Cy7.
4. expansão e criopreservação de células NK/T
- Mude o meio quando for concluída a análise do fenótipo celular. Retire metade do líquido sobrenadante cuidadosamente e evite tocar as células na parte inferior da placa. Adicione o mesmo volume de meio de cultura fresco contendo 300 U/mL rhIL-2 para as placas da célula.
- Mudar metade do meio de cada 3 dias (como 2.2) até a célula clusters são claramente visíveis sob o microscópio (Figura 2). Normalmente, este processo leva 2-3 semanas.
- Transferi as células de placas de 24 poços para frascos de cultura T25 após a mistura de diferentes poços da mesma linhagem. Dobro do volume do meio de cultura é o que parece amarelo até o volume do meio de expande para 10-15 mL. Adicione rhIL-2 com a concentração de 150 U/mL.
- Mudar o médio 24 h antes de congelar após 2-3 semanas, crescendo, quando a célula massa pode ser observada a olho nu. Medir a concentração de células com um contador de célula.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 5 min à 240 x g e ressuspender o pellet de células em uma densidade de 5-10 x 106 células/mL com a solução de estoque congelada que contém 90% de soro fetal bovino e 10% dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a uma taxa de 1 ° C / min a-80 ° C e depois transferir diretamente para o nitrogênio líquido.
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Representative Results
Depois de 3 dias cultura durante o estabelecimento de linhas de células, as células polimórficas começam a aparecer (Figura 2). Após 7 dias, as células crescem rapidamente, como o número e a viabilidade das células aumentam em uma taxa elevada (Figura 3). Pequenos grupos de células são claramente visíveis após 10-14 dias de crescimento, quando a concentração de células pode exceder 3-6 × 106. Neste período, as células devem ser alargadas pela divisão em dois ou três poços da placa de cultura. Um mês depois, uma vez o atinge número celular 3-5 × 107, a contagem é alta o suficiente para preservação.
Outra questão importante é determinar os fenótipos quando as células têm sido cultivadas com sucesso. Nossos resultados indicam que T (L196) e células NK (M296) podem ser cultivadas pelo método descrito acima (Figura 4), e linhas celulares poderiam ser estabelecidas com esta técnica, como as células cresceram mais de 3 meses em boas condições.
Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho. No primeiro dia, anticoagulante sangue foi coletado de pacientes CAEBV, em seguida, PBMC foram isoladas e cultivadas com meio de 1640 contendo 20% de soro humano e 150U/mL de rhIL-2. As células NK/T foram cultivadas a 37 ° C, na presença de 5% de CO2. Após 2-4 semanas de cultivo, as células começaram a crescer rapidamente. Quando a concentração exceder 5 × 106 /mL, dividimos as células em 2-3 poços na concentração de 2 × 106. Continuando a cultura para 2-3 semanas, as células foram transferidas da placa de 24 T25 aferido quando aglomerados de células foram claramente visíveis sob o microscópio. Cryopreserve células quando a célula massa pode ser observada a olho nu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: as mudanças morfológicas celulares no processo de cultivo. As células são cultivadas e observadas para o número de dias indicado. Células polimórficas (as setas apontadas) eram visíveis sob o microscópio claramente após 3-7 dias, e as células começaram a crescer rapidamente depois da cultura de 7-14 dias. A ampliação original para microscopia de luz foi de 200 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: as curvas de crescimento da proliferação celular. Após 7 dias de cultivo, as células começaram a crescer rapidamente (A) e com alta viabilidade (B). Concentração e viabilidade das células foram medidos por um contador de célula automatizada com o seguinte procedimento: adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) para 18 µ l de suspensão de células para a coloração, espere 3 min, a suspensão de transferência para a placa de contador de células e medir as células concentração e a viabilidade celular com um contador de célula automatizada. As barras de erro são os desvios-padrão de três réplicas. L196, Z290, M296, L311 são os nomes de quatro linhas de célula. A concentração inicial para medir a curva de crescimento é de aproximadamente 3 × 106. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representante gating estratégia para análise de citometria de fluxo da linha celular L196 e M296. PBMC foram usados para ajustar tensões FSC e SSC. O aglomerado de linfócitos ao vivo e único foi fechado para P1 na trama do FSC e SSC. O isotipo controle e único controles positivos foram utilizados para realizar a compensação. Quatro pares de imunofluorescência 2 cores conjugada anticorpo coloração foram usado para analisar a expressão de marcadores de superfície. Anti-HLA-DR e anti-CD19 foram usados para detectar células B, Considerando que o anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8 foram usados para detectar células T. Anti-CD16 e anti-CD56 foram usados para definir as células NK. (A) o fenótipo de L196 é CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, o tipo de célula principal é CD8 +. (B) M296 é CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, o tipo de célula principal é CD16 + CD56 +. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, desenvolveu uma nova técnica para o estabelecimento de linhas de células NK/T do sangue inteiro de pacientes CAEBV. Comparado com os métodos existentes, a grande vantagem deste método é sua simplicidade e sua exigência de apenas um pequeno volume de sangue, enquanto que apresenta uma elevada taxa de sucesso e boas condições de viabilidade celular. Além disso, as linhas de células NK/T podem ser estabelecidas por PBMC de cultivo sem determinar os tipos de célula, o EBV Latentemente infectada com antecedência, como a determinação consumiria mais sangue e tempo antes de cultivo. Alternativamente, linhas de células podem ser analisadas e diferentes fenótipos das células podem ser purificados com citometria de fluxo após a criação de linha de celular. Além disso, o método usa uma dose baixa de rhIL-2 e precisa de células sem alimentador. Com este método, desenvolvemos 7 linhas de célula de 8 pacientes CAEBV e criopreservado-los dentro de um mês. Aquele que não foi desenvolvido em uma linha de celular pode ser mantida viva por mais de 5 meses sem proliferação significativa, e as razões por trás disso precisam de exploração mais adicional.
É necessário notar que o crescimento celular é estritamente dependente da presença de recombinante humano Il-2, que é consistente com os anteriores relatórios2120,; com nenhum humano Il-2, as células vão morrer daqui a 3 semanas. Evidentemente, uma alta qualidade de Il-2 é essencial para a proliferação celular, embora os fatores que determinam a capacidade proliferativa de células em vitro ainda precisam ser esclarecido. A dose de Il-2 necessária é variável entre linhas de célula diferente, por exemplo, 50U/mL é satisfatória para manter a proliferação de M296. No entanto, a concentração mais econômica e confiável para o estabelecimento de linhas de células NK/T não tiver sido apresentada no estudo; com efeito, 150 U/mL é suficiente para o sucesso.
Neste processo de cultivo celular, dos elementos que afetam o crescimento de células, a viabilidade de PBMC primário é o mais importante. Para garantir o sucesso, o PBMC deve ser tão fresco quanto possível. Sem dúvida, concentração de célula é um fator importante que afetam o sucesso de cultivo, portanto o valor de limiar deve ser não inferior a 105 por mL. Se o número total de célula isolado da amostra for menor que 106, usando uma mini placa de celular para manter uma concentração adequada de célula é uma escolha alternativa na cultura inicial. Além disso, linha NK e células T pode ser instituída até uma quantidade limitada de sangue periférico quando usando a reação hemolítica enriquecer PBMC, como já relatado anteriormente,22. Conforme descrito no protocolo, o soro humano é outro fator chave para a sobrevivência da célula no início da cultura. Nós especulamos que alguns ingredientes desconhecidos existem no soro que estão ausentes ou diferentes em soro fetal bovino e são necessários para a proliferação de células T/NK.
Há duas limitações do método. Primeiro, existem várias perguntas sem resposta sobre esse método, tais como como e por que o EBV infecta o NK ou T células in vivo, os mecanismos do NK/T célula crescimento e proliferação em vitro, e que tipos de célula podem ser estabelecidas em linhas de células em um paciente. Embora nós não podia controlar o tipo de célula e pureza, que não são determinados pelo método, estes fatores podem ser dependentes das células que EBV infecta em pacientes. Com este protocolo, células NK e T podem ser estabelecidas em linha de celular, embora esse método não poderia cultura preferencialmente um tipo. No entanto, há um grupo dominante dessas células. Em segundo lugar, havia um relatório que clones de NK e células T de pacientes com LPD ou linfoma T/NK pôde ser estabelecida para linhas de celular, enquanto outros poderiam ser mantidos por vários meses17. As células obtidas no presente estudo podem proliferar bem mais de 3 meses, no entanto se eles poderiam proliferar indefinidamente precisa ser validado.
Em resumo, usando este método, mais linhas de células de CAEBV ou NK/T linfomas podem ser facilmente obtidas com uma quantidade limitada de sangue e uma baixa dose de Il-2 sem células de alimentador. Estas linhas de célula irão contribuir para o estudo da persistência de EBV em células T/NK e patogênese de EBV associado a leucemia ou linfoma.
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Disclosures
D.Z., X.Z. e X.C. são co-inventores em pendentes pedidos de patentes cobrindo potenciais usos deste método para o estabelecimento de linhas de células NK/T e a linha celular estabelecida neste estudo. D.Z., X.Z. e X.C. declaram sem interesses financeiros concorrentes neste trabalho. Os restantes autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela projetos chave da Academia Chinesa de Ciências (KFZD-SW-205), estratégico biológicos recursos tecnologia sistema de suporte de chinês Academia de Ciências (CZBZX-1 e ZSSB-004) e por doações de (Fundação Nacional de ciência da China 81401640) e o fundo de ciências naturais (14ZR1434800) de Shanghai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
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