Summary
Vi illustrere en ligetil metode til at udlede murine primære makrofager fra knoglemarven cellerne og en enkel metode til at forberede BSA-fedtsyre konjugater. Så vi demonstrere at mættede fedtsyrer kan fremkalde makrofag celledød, og sådanne celledød er positivt associeret med cellulære ophobning af ceramid niveauer.
Abstract
Makrofager udtrykke meget epidermal fedtsyre-bindende protein og fedt fedtsyre-bindende protein. De aktivt optagelse mættede og umættede fedtsyrer, som kan spille en afgørende rolle i reguleringen af deres immun funktioner. Talrige undersøgelser har vist, at forskellige fedtsyrer, mættede eller umættede, kan have forskellige konsekvenser for cellevækst og funktion. Men tilgange bruges til fedtsyre forberedelse varierer, hvilket kan føre til ikke-fysiologiske resultater. Serum albumin, en naturlig transportør for fedtsyrer i pattedyr perifert blod, anbefales for at danne et kompleks med Natriumsalt af fedtsyrer konjugat at studere fedtsyre funktion i pattedyrceller, hvilket minimerer toksiciteten af fedtsyre sæbe. Således er en enkel, relativt hurtig opvarmning og sonicating metode udviklet og præsenteret her for BSA-fatty syre konjugat dannelse. Vi beskriver en protokol, ved hjælp af mættede fedtsyrer, især stearic syrer til at fremkalde alvorlige celledød i mus knoglemarv afledt makrofager. Vi viser yderligere, mættede fedtsyre-induceret celledød er positivt associeret med akkumulerede cellulære ceramid niveauer. Denne metode kan udvides til undersøgelser af virkningen af fedtsyre på andre pattedyrsceller.
Introduction
Fedtsyrer spiller en afgørende rolle i energimetabolisme og i syntesen af membran fosfolipider i forskellige typer af celler. Fedtsyrer har en lav vandig opløselighed. Passende forberedelse af fedtsyre er af afgørende betydning for at studere de biologiske funktioner af fedtsyrer i pattedyrsceller. Når fedtsyrer er tilberedt med ethanol, kan mange fedtsyrer vise deres giftige sæbe (vaskemiddel) effekt på cellemembranen, selv ved relativt lave koncentrationer1. Som en naturlig, store transporter til frie fedtsyrer i serum betragtes serum albumin som en god luftfartsselskab for fedtsyre levering i vitro for fedtsyre funktion assays2,3,4. Men detaljerne i forberedelsen af fedtsyre og serum albumin konjugat er normalt ikke tilgængelig selvom mange forskningspapirer ved hjælp af fedtsyrer er blevet offentliggjort.
Makrofager udtrykke meget epidermal fedtsyre-bindende protein og fedt fedtsyre-bindende protein5,6,7,8. De aktivt optagelse mættede og umættede fedtsyrer, som kan regulere deres immun funktioner. For at studere virkningerne af fedtsyrer på makrofager og andre celler, var forskellige metoder af fedtsyre forberedelse anvendt1,7,9. Ved hjælp af passende rede fedtsyre/serum albumin konjugater for at undersøge virkningen af fedtsyrer på makrofag funktion er af afgørende betydning at opnå biologisk meningsfuld data. Undersøgelser af virkningen af fedtsyrer på makrofag funktion kan give grundlæggende viden og potentielle terapeutiske mål vedrørende fedtsyre metabolisme i makrofag-involveret sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollen blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Louisville.
1. mus knoglemarv afledt makrofager (BMDMs)
- aflive en 6 til 8 uger gamle, sunde vildtype mus ved hjælp af CO 2. Pin det ned til en skum bord og spray det med 70% ethanol, indtil det er gennemblødt. Fjerne skinneben/lårben ben med saks og pincet. Læg dem i en petriskål med 5 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Udføre alle procedurer under sterile forhold.
- Skar begge ender af skinnebenet/lårben ben med en saks i en steril vævskultur hætte. Skylle ben med en 25 G kanyle med PBS + 2% føtal bovint serum (FBS) i en 15 mL tube.
- Centrifugeres knoglemarven cellerne på 500 x g, 4 ºC i 5 min.
- Resuspenderes celle i 1 mL rød blod celle lysisbuffer til lyse røde blodlegemer (RBC) for mindre end 1 min. Dilute straks med 9 mL 1 x PBS. Centrifuge igen som i trin 1.3. Dekanteres analysere.
- Celle resuspenderes i 10 mL 1 x PBS, filtrere cellesuspension gennem en steril 40 μm nylon mesh ind i en anden 15 mL rør til at fjerne celle debris/klumper. Centrifuge igen som i 1.3. Dekanteres analysere.
- Resuspenderes celle i 15 mL Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 med 5% FBS og 10 μg/mL gentamicin, plade celler i en 100-mm vævskultur parabol på 37 o C inkubator for 60 min. forsigtigt swirl parabol, tegne den flydende celler, og tæller dem.
- Plade 6 x 10 6 celler i en 100-mm fad med 12 mL makrofag differentiere media (RPMI 1640 med 5% FBS og 10 μg/mL gentamicin, blandet med 30% L929 konditioneret media 10) med 10 ng/mL rekombinant musen makrofager koloni-stimulerende faktor (M-CSF) for 2 dage.
- Efter dyrkning i 2 dage i et 37 ° C kuvøse med 5% CO 2, foder hver tallerken med 6 mL frisk makrofag differentiere medier med 10 ng/mL M-CSF.
- På dag 5, tager 8 mL af de gamle medier ud uden at forstyrre cellerne og tilsæt 10 mL frisk makrofag differentiere medier med 10 ng/mL M-CSF.
- På dag 7, høste de knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) ved hjælp af en celle løfteren.
Bemærk: Vedlagte makrofager kan også adskilles med 5 mL 1 mM EDTA i 1 x PBS for 5-10 min efter at fjerne float celler og vask plade to gange med 5 mL 1 x PBS. Centrifugeres celler som i trin 1.3. resuspend dem i frisk makrofag differentiere medier og tælle dem med en hemocytometer.- Bekræft BMDMs ' fænotype ved flowcytometri som beskrevet 5. Forberede afledte musen makrofager i en vis koncentration for følgende undersøgelser.
2. BSA-fatty syre konjugat forberedelse
- Forbered 2 mM BSA i steril PBS. Eksempelvis vejer 6,65 g BSA, tilføje 30 mL 1 x PBS til at opløse, derefter tilføje flere PBS indtil 50 mL, skalering komponenter for at gøre 2 mM BSA i 1 x PBS.
- Forbered 5 mM individuelle Natriumsalt af fedtsyrer i 2 mM BSA. Opvarmning til 37 ° C eller højere, hvis det er nødvendigt, og blandingen af 2 mM BSA og Natriumsalt af fedtsyrer der sonikeres indtil en klar løsning opnås.
Bemærk: I forhold til umættede fedtsyrer, mættede fedtsyrer har brug for en højere temperatur og mere sonikering tid til opløse. - Filter den fede-syre-BSA løsning gennem et 0,22 μm filter, prøve det i 1,5 mL sterilt microcentrifuge rør, og gemme dem på 4 ° C til kort tids brug eller ved-20 ° C til langtidsopbevaring. Ingen nedbør bør iagttages efter opbevaring på 4 ° C i køleskabet.
3. Mættede fedtsyrer fremkalde celle død af musen knoglemarv afledt makrofager
- plade BMDMs i en 24-godt vævskultur plade med 0,4 x 10 6 /mL i makrofag differentiere media.
- Behandling af celler med 0,4 mM palmitinsyre og stearinsyre i 16-24 timer ved 37 ° C kuvøse med 5% CO 2. Bruge BSA som den negative kontrol.
- Høste celler med en celle løfteren efter behandling og spin-ned celler på 500 x g, 4 ºC i 5 min.
- Pletten celler med Annexin V-Alexa 488 og 7-aminoactinomycin D (7-AAD) i 100 μL annexin V binding buffer i 15 min. ved stuetemperatur.
- Fortyndes prøven med 200 µL af annexin binding buffer, blandes forsigtigt, og derefter holde prøver på is efter inkubationstiden.
- Analyserer de farvede celler så hurtigt som muligt ved flow flowcytometri 5. Annexin V-Alexa 488 opdages i FITC kanal og 7-ald registreres i PerCP/PerCP-Cy5.5 kanal.
4. Intracellulære ceramid farvning
- efter fedtsyre behandling, høste celler som trin 3.3. Derefter lave celler i 4% PARAFORMALDEHYD i 30 min.
- Vaske prøve med 1 mL 1 x PBS, spin ned som trin i 3.3, og den dekanteres.
- Pletten celler med anti-ceramid primære antistof (1:200 fortynding) i 100 μl 1 x permeabilization buffer i 30 min.
- Vask og spin ned cellerne igen som i trin 4.2.
- Pletten celler med anti-mus IgM sekundær antistof (1: 500 fortynding) i 100 μl 1 x permeabilization buffer i 30 min.
- Vask og spin ned cellerne igen som i trin 4.2. Tilsæt 250 μL 1 x PBS og analysere de farvede celler af flow flowcytometri 5.
Bemærk: Se den detaljerede reagenslisten i tabellen udstyr og reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fedme øger frie fedtsyrer koncentrationer i serum. Som professionelle fagocytter tage makrofager aktivt op fedtsyrer til at opretholde vært homøostase. Under disse processer, kan overbelastet lipider fremkalde makrofag celledød. Med henblik herpå kulturperler vi BMDMs i vitro med fede niveauer af kosten fedtsyrer og målte makrofag celledød ved hjælp af flow cytometric farvning. I forhold til kontrolelementet BSA, mættede fedtsyrer, induceret navnlig stearic syrer, betydelig celledød i BMDMs. døde celler blev vist som dobbelt positive populationer plettet af Annexin V og 7-ald (figur 1a-b). Af note fremkalde umættede fedtsyrer ikke betydelige makrofag celle død5. Data tyder den giftige virkning af forhøjede niveauer af frie mættede fedtsyrer i vivo.
På samme måde, ved hjælp af en makrofag cellelinie hvis rentabilitet var modtagelige for behandling af enten palmitinsyre syrer eller stearic syrer5, fandt vi, at makrofager modtagelighed for palmitinsyre-induceret celledød blev også berørt af antallet af celler i kultur (figur 2a). Kort sagt på de samme kulturelle betingelser, de mere makrofager i brønde, mindre celledød fremkaldt af fedtsyrerne. Derudover blev palmitinsyre-induceret celledød positivt associeret med akkumulerede niveauer af cellulære ceramider (figur 2b). Når makrofager blev kulturperler i en high-density tilstand, medium næringsstoffer blev forarmet hurtigere energimetabolisme, disse celler var mindre modtagelige for palmitinsyre-induceret celledød i forhold til makrofager kulturperler i low-density betingelse. Derimod når celler blev udsat for et næringsstof-beriget betingelse (f.eks., fedme), kan overskydende fedtsyrer blive metaboliseret til at producere giftige ceramider, hvilket førte til fedtsyre-induceret celledød. Således kan celle kulturelle betingelser bringe variation til resultaterne af mættede fedtsyre-induceret celledød.
Figur 1: høj koncentration af fedtsyrer, især stearic syrer, fremkalde makrofag celledød. BMDMs (dag 7) blev forgyldt som 0,4 x 106/mL i frisk makrofag differentiere medier. Efter celle vedhæftet fil til 0,5-1 h, BMDMs blev behandlet med udpegede koncentrationen af hver fedtsyre for 24 h. medier alene og BSA blev brugt som negative kontroller. Efter behandling, blev celler ophævet og høstet, så spundet ned på 500 g i 5 min. ved 4 ° C. Celler var plettet med 7-ald og Annexin V Alexa 488 i 100 μL annexin binding buffer for 15 min. Tilføje en anden 200 μl annexin binding buffer i hver prøve før flow flowcytometri analyse. (A) Demonstration af flow flowcytometri data i celler induceret af fedtsyrer. (B) Resumé af celledød induceret af fedtsyrer. Fejllinje repræsenterer prøve SD. Celledød induceret af palmitinsyre (PA) og især stearinsyre (SA) er statistisk signifikant i forhold til BSA kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: tilgængeligheden af medier næringsstoffer virkninger makrofager modtagelighed for palmitinsyre induceret celledød. (A) celle ernæring status påvirker dens tolerance over for mættede fedtsyre-induceret stress. (B) celle modtagelighed for mættede fedtsyre induceret celledød er stærkt korreleret med akkumulerede cellulære niveauer af ceramid. Medier næringsstof gradient blev opnået ved dyrkning af vildtype makrofag cellelinie 1 m, 2M, 4M og 8M (M = 1 x 106) i 6-mm petriskåle med 6 mL RPMI 1640 med 5% FBS og 10 μg/mL gentamicin for 18 hr. Medier farve er mere gult på grund af flere næringsstoffer udtynding, når et større antal celler er kulturperler i opvasken. Mere end 90% af celler er stadig meget levedygtig. De vedlagte levedygtige celler blev løftet af pipettering efter at have siddet i PBS i 5 min og re kulturperler straks på 0.2x106/mL i friske medier i 24-godt plader. Celler blev behandlet straks med 0,4 mM palmitinsyre til 18 h med BSA som kontrol for hver kilde (næringsstof gradient) af celler. Derefter blev alle behandlede celler høstet og farves med 7-ald for celledød eller farves med intracellulære ceramid. Spontan celledød (7-ald +) procenter var mindre end 8,6%. Behandling specifikke celledød blev anslået % forskel i 7-ald + mellem behandling og sin egen BSA styre (en). Behandling specifikke ceramid niveau blev anslået gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI) forskellen mellem behandling og sin egen BSA kontrol (b). Dette eksperiment blev gentaget, og repræsentative data præsenteres. Fejllinje repræsenterer stikprøve SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En god forberedelse af fedtsyre løsning er af afgørende betydning at studere den biologiske funktion af fedtsyrer. Neutralisering af fedtsyrer øger dets Opløselighed i vandig opløsning. Natrium salte af fedtsyrer, især mættede fedtsyrer, er dog stadig af lav Opløselighed i vand eller PBS så vi observeret. Én metode er at bruge 95-100% ethanol til at hjælpe opløse fedtsyre1. Brug denne metode, kan højere toksicitet for celler observeres selv ved lavere koncentrationer for mindre giftige umættede fedtsyrer. En anden måde at forberede fedtsyre løsning er at udnytte methyl-β-cyclodextrin levering system, således at fedtsyrer har optimale betingelser, resterende i opløsning i deres monomere form9,11. Fedtsyrer forberedt med en sådan metode syntes at have normale funktion, men udfører metoden er kompliceret. Virkningen af methyl-β-cyclodextrin på cellevækst er, at høj koncentration kan føre til celle død12. For mættede stearic og palmitinsyre syrer bruges en høj temperatur (60 oC) til at hjælpe med oploesning9.
Da serum albumin er en væsentlig fedtsyre-bindende protein i ekstracellulære væske, som hjælper i transport af fedtsyrer i lymfe- og vaskulære, er det foretrukket som den naturlige carrier for funktionelle studier af fedtsyrer. For at undgå lav opløseligheden af fedtsyre salt i vandig opløsning, ultralydbehandling vil i høj grad lette konjugation af fedtsyrer med BSA, således medvirken i fedtsyre oploesning. Det tager meget længere tid (timer) til solubilize de mættede fedtsyrer end de umættede fedtsyrer (30 min) med samme mængde volumen og koncentration. Selv om varme og ultralydbehandling er kritisk for BSA-fatty syre konjugering, er en høj temperatur (mindre end 50 oC) foreslået for får klare BSA-PA, BSA-SA konjugat løsninger og lav temperatur er stærkt anbefales til solubilizing umættede fedtsyrer på grund af deres følsomhed over for oxidation ved høj temperatur. 5:2 kindtand forholdet for fedtsyrer til BSA anses god i forhold til 3:1 eller 6:1 molar nøgletal, der blev udgivet7. Dette kan sikre mindre helt fri fedtsyre i den opklaring hen til undgå toksiciteten af fedtsyre sæbe. BSA-fedtsyrer tilberedt på denne måde synes at være stabile løsninger (ingen nedbør, i hvert fald) ved 4 ° C i mindst 3 måneder som vist i deres funktionalitet på makrofag celledød. Seal hætten af tube hvis forberedt fedtsyrer er ikke at blive brugt i en lang periode.
Når en klar løsning på BSA-fedtsyre i PBS er opnået, er ensartede resultater fra fedtsyre behandling mere sandsynligt berettiget. Sultende og velnærede makrofager besvare imidlertid ganske anderledes fedtsyre behandling, især mættede fedtsyrer. Makrofager med overskydende næringsstoffer er mere modtagelige for mættede fedtsyre-induceret celledød end sulter eller sultet dem fordi sulten celler kan metabolisk afgifte de mættede fedtsyrer på grund af deres overlevelse og vækst anmodning. Sådanne celledød er stærkt forbundet med akkumulerede cellulære ceramid niveauer. Af note opstår ceramid toksicitet kun når intracellulære ceramid niveauer nå en bestemt tærskel. For at sikre ensartede resultater fra fedtsyre behandlet makrofager eller enhver anden form for celler, bør være kulturperler celler med friske medier med rigelige næringsstoffer. Sub-optimale celle kultur betingelser kunne resultere i sub-optimale data.
Samlet, disse protokoller give meget tiltrængte detaljer for at studere virkningerne af fedtsyrer på makrofager af andre laboratorier. Sammenlignet med andre metoder, genererer denne direkte tilgang BSA-fatty syre konjugater uden at bruge en ekstra opløsningsmidler som ethanol. Det mest udfordrende skridt er at udarbejde nøjagtige, stabil BSA-fatty syre, fordi sonikering genererer varme og det er svært at kontrollere temperaturen. Heldigvis, umættede fedtsyrer er nemme at tilberede i en kort tid og forbliver stabilt, mens mættede fedtsyrer synes at stå relativt høje temperaturer, fordi de mættede og modstandsdygtigt over for oxidation i en sådan tilstand. Vi har hidtil ikke observeret nogen spørgsmål eller begrænsning med BSA-fatty syre konjugater tilberedt på denne måde. Ændring af vores protokollen ville være nødvendigt, hvis mere følsomme eksperimenter er nødvendige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen finansielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvis ved University of Louisville start-up midler og National Cancer Institute (Bethesda, MD) giver R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J.
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
