Summary
Vi illustrerar en okomplicerad metod för att härleda murina primära makrofager från benmärgsceller och en enkel metod att förbereda BSA-fettsyra konjugat. Då visar vi att mättade fettsyror kan inducera makrofag celldöd, och sådana celldöd är positivt associerad med cellulära ackumulering av ceramid nivåerna.
Abstract
Makrofager uttrycker mycket epidermal fettsyra-bindande protein och fett fettsyra-bindande protein. De aktivt upptag mättade och omättade fettsyror, som kan spela en avgörande roll i regleringen av deras immun funktioner. Många studier har visat att olika fettsyror, mättade eller omättade, kan ha olika effekt på cellernas tillväxt och funktion. Metoder som används för fettsyra förberedelse varierar dock, vilket kan leda till icke-fysiologiskt resultat. Serumalbumin, en naturlig bärare för fettsyror i däggdjur perifert blod, rekommenderas för att bilda ett konjugat komplex med natriumsaltet av fettsyror att studera fettsyra funktion i däggdjursceller, sålunda minimizing toxiciteten av fettsyra tvål. Således, en enkel, relativt snabb uppvärmning och sonicating metod utvecklas och presenteras här för BSA-fatty acid konjugat bildandet. Vi beskriver ett protokoll med mättade fettsyror, särskilt stearinsyra syror att inducera allvarliga celldöd i mus benmärg härrör makrofager. Vi visar vidare att mättade fettsyror-inducerad celldöd är positivt associerade med ackumulerade cellulära ceramid nivåerna. Denna metod kan förlängas för studier av effekterna av fettsyra på andra däggdjursceller.
Introduction
Fettsyror spelar en avgörande roll i energiomsättningen och i syntesen av fosfolipidmembran i olika typer av celler. Fettsyror har en låg vattenlöslighet. Lämplig preparering av fettsyra är av avgörande betydelse för att studera de biologiska funktionerna av fettsyror i däggdjursceller. När fettsyror är beredda med etanol, kan många fettsyror Visa deras giftiga tvål (tvättmedel) effekt på cellmembranet, även vid relativt låga koncentrationer1. Som en naturlig, större transportör för fria fettsyror i serum anses serum albumin vara en bra bärare för fettsyra leverans i vitro för fettsyra funktion analyser2,3,4. Men är detaljerna i utarbetandet av fettsyra och serumalbumin konjugat oftast inte tillgänglig trots att många forskningsrapporter med fettsyror har publicerats.
Makrofager uttrycker mycket epidermal fettsyra-bindande protein och fett fettsyra-bindande protein5,6,7,8. De aktivt upptag mättade och omättade fettsyror som kan reglera deras immunförsvar fungerar. För att studera effekterna av fettsyror på makrofager och andra celler, var olika metoder för fettsyra beredning tillämpad1,7,9. Använda lämpligt beredda fettsyra/serum albumin konjugat för att undersöka effekterna av fettsyror på makrofag funktion är av avgörande betydelse att få biologiskt meningsfulla data. Studier om effekterna av fettsyror på makrofag funktion kan ge grundläggande kunskaper och potentiella terapeutiska mål avseende fettsyra metabolism i makrofag-inblandade sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollet godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Louisville.
1. mus benmärgen härrör makrofager (BMDMs)
- Euthanize en 6-8 vecka-gamla, friska vilda typ mus använda CO 2. Fästa den ner till en skum ombord och spraya den med 70% etanol tills den är blöt. Ta bort tibia/lårbenet ben med pincett och sax. Lägg dem i en petriskål med 5 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Utför alla procedurer under sterila förhållanden.
- Skar upp båda ändarna av tibia/lårbenet ben med en sax i en steril vävnadsodling huva. Spola på benet med en 25 G nål med PBS + 2% fetalt bovint serum (FBS) in i en 15 mL tub.
- Centrifugera i benmärgsceller vid 500 x g, 4 ° C i 5 min.
- Resuspendera cellpelleten i 1 mL röd blod cell lysisbuffert att lysera röda blodkroppar (RBC) för mindre än 1 min. Dilute omedelbart med 9 mL 1 x PBS. Centrifugera igen som i steg 1.3. Dekantera supernatanterna.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 mL 1 x PBS, filtrera cellsuspensionen genom en steril 40 μm nylon mesh i en annan 15 mL röret ta bort cell skräp/klumpar. Centrifugera igen som i 1.3. Dekantera supernatanterna.
- Omsuspendera cellpelleten i 15 mL Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 med 5% FBS och 10 μg/mL gentamicin, tallrik cellerna i en 100 mm vävnadsodling maträtt på 37 o C inkubator för 60 min. snurra försiktigt skålen, ta ut den flytande celler och räkna dem.
- Platta 6 x 10 6 celler i en 100 mm maträtt med 12 mL makrofag att differentiera media (RPMI 1640 med 5% FBS och 10 μg/mL gentamicin, blandat med 30% L929 luftkonditionerade media 10) med 10 ng/mL rekombinant mus makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (M-CSF) för 2 dagar.
- Efter odling för 2 dagar i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2, mata varje maträtt med 6 mL färsk makrofag att differentiera media med 10 ng/mL M-CSF.
- På dag 5, ta 8 mL av det gamla mediet ut utan att störa cellerna och tillsätt 10 mL färsk makrofag att differentiera media med 10 ng/mL M-CSF.
- Dag 7, skörda benmärg-derived makrofager (BMDMs) använder en cell lyftare.
Obs: Bifogad makrofager kan också särskiljas med 5 mL 1 mM EDTA i 1 x PBS för 5-10 min efter att ta bort float cellerna och tvätta två gånger med 5 mL 1 x PBS. Centrifugera cellerna som i steg 1.3. Omsuspendera dem i färska makrofag att differentiera media och räkna dem med en hemocytometer.- Bekräfta BMDMs ' fenotyp av flödescytometri som beskrivs 5. Förbereda härledda musen makrofager i en viss koncentration för följande studier.
2. BSA-fatty Acid konjugat förberedelse
- förbereda 2 mM BSA i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Exempelvis väger 6,65 g BSA, tillsätt 30 mL 1 x PBS att upplösa, sedan lägga till fler PBS förrän 50 mL, skalning komponenter för att göra 2 mM BSA i 1 x PBS.
- Förbered 5 mM enskilda natriumsalt av fettsyror i 2 mM BSA. Värm till 37 ° C eller högre, om nödvändigt, och Sonikera blandningen av 2 mM BSA och natriumsalt av fettsyror tills en klar lösning erhålls.
Obs: Jämfört med omättat fett, mättade fettsyror behöver en högre temperatur och mer ultraljudsbehandling tid för upplösning. - Filter fettsyror-syra-BSA lösningen genom ett 0,22 μm filter, alikvot den i 1,5 mL steril mikrocentrifug rör, och lagra dem vid 4 ° C för kort sikt användning eller vid-20 ° C för långtidslagring. Ingen nederbörd bör observeras efter lagring vid 4 ° C i kylskåpet.
3. Mättade fettsyror inducerar Cell Death av mus benmärgen härrör makrofager
- platta BMDMs i en 24-väl vävnadsodling tallrik med 0,4 x 10 6/ml i makrofag att differentiera media.
- Behandla cellerna med 0,4 mM palmitinsyra och stearinsyra för 16 till 24 h vid en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Använda BSA som den negativa kontrollen.
- Skörda cellerna med en cell lyftare efter behandling och snurra ner cellerna vid 500 x g, 4 ° C i 5 min.
- Färga cellerna med Annexin V-Alexa 488 och 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 100 μL annexin V bindande buffert för 15 min i rumstemperatur.
- Späd provet med 200 µL av annexin-bindande buffert, blanda försiktigt, sedan hålla proverna på is efter inkubationstiden.
- Analysera de färgade cellerna så snart som möjligt genom flödet flödescytometri 5. Annexin V-Alexa 488 upptäcks i FITC kanal och 7-AAD upptäcks i PerCP/PerCP-Cy5.5 kanal.
4. Intracellulära Ceramide färgning
- efter fettsyra behandling, skörda cellerna som i steg 3.3. Sedan fixa cellerna i 4% PARAFORMALDEHYD för 30 min.
- Tvätta provet med 1 mL 1 x PBS, snurra ner som steg i 3.3 och Dekantera supernatanten.
- Färga celler med anti-ceramide primär antikropp (spädning 1: 200) i 100 μL 1 x permeabilisering buffert för 30 min.
- Tvätt och spinn ner cellerna igen som i steg 4.2.
- Färga celler med antimus IgM sekundär antikropp (1: 500 utspädning) i 100 μL 1 x permeabilisering buffert för 30 min.
- Tvätt och spinn ner cellerna igen som i steg 4,2. Lägg 250 μL 1 x PBS och analysera de färgade cellerna genom flödet flödescytometri 5.
Obs: Se detaljerad reagens listan i tabellen av utrustning och reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fetma ökar koncentrationerna av fria fettsyror i serum. Som professionella fagocyter ta makrofager aktivt upp fettsyror till upprätthålla värd homeostas. Under dessa processer, kan överbelastade lipider inducera makrofag celldöd. I detta syfte odlade vi BMDMs i vitro med feta kosten fettsyror och uppmätta makrofag celldöd använder flöde flödescytometrisk färgning. Jämfört med kontrollen BSA, mättade fettsyror, inducerad i synnerhet stearinsyra syror, betydande celldöd av BMDMs. döda celler visades som dubbelt positivt populationer färgas av Annexin V och 7-AAD (figur 1a-b). Notera inducerar omättade fettsyror inte betydande makrofag cell död5. Uppgifter tyder toxiska effekter av förhöjda nivåer av fria mättade fettsyror i vivo.
På samma sätt upptäckte med en makrofag cellinje vars lönsamhet var mottagliga för behandling av antingen palmitinsyra syror eller stearinsyra syror5, vi att makrofager känslighet för palmitinsyra-inducerad celldöd påverkades också av antalet celler i kulturen (figur 2a). Enkelt uttryckt, på samma kulturella villkor, fler makrofager i brunnarna, det mindre celldöd som induceras av fettsyrorna. Palmitinsyra-inducerad celldöd var dessutom positivt associerade med ackumulerade nivåer av cellulära ceramider (figur 2b). När makrofager odlades i en hög densitet skick, medellång näringsämnen tömdes snabbare för energiomsättning, dessa celler var mindre känsliga för palmitinsyra-inducerad celldöd jämfört med makrofager odlade i en låg densitet skick. Däremot när celler utsattes för ett näringsämne-berikad tillstånd (t.ex., fetma), kan överskott fettsyror vara metaboliseras för att producera giftiga ceramider, vilket ledde till fettsyra-inducerad celldöd. Således, cell kulturella förhållanden väcka variation till resultaten av mättade fettsyror-inducerad celldöd.
Figur 1: hög koncentration av fettsyror, särskilt stearinsyra syror, inducera celldöd makrofag. BMDMs (dag 7) var klädd som 0,4 x 106/ml i färska makrofag att differentiera media. Efter cell fäste för 0,5-1 h, BMDMs behandlades med utsedda koncentrationen av varje fettsyra för 24 h. Media ensam och BSA användes som negativa kontroller. Efter behandling, var celler lyfte och skördas, då snurrade ner på 500 g för 5 min vid 4 ° C. Cellerna var fläckad med 7-AAD och Annexin V Alexa 488 i 100 μL annexin-bindande buffert för 15 min. Lägg sedan till en annan 200 μL annexin-bindande buffert varje prov innan Flödesanalys flödescytometri. (A) Demonstration av flödesdata flödescytometri av celler som induceras av fettsyror. (B) Sammanfattning av den celldöd som orsakas av fettsyror. Felstapel representerar prov SD. Celldöd som orsakas av palmitinsyra (PA) och särskilt stearinsyra (SA) är statistiskt signifikant jämfört med BSA kontrollens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tillgången till media näringsämnen påverkar makrofager känslighet för palmitinsyra inducerad celldöd. (A) Cell näring status påverkar dess tolerans för mättad fettsyra-inducerad stress. (B) cellernas mottaglighet till mättade fettsyror inducerad celldöd är starkt korrelerade med ackumulerade cellulära nivåer av ceramide. Media näringsämnen övertoningen uppnåddes genom odling vildtyp makrofag cell linjen vid 1M, 2M, 4M och 8M (M = 1 x 10-6) i 6-mm petriskålar med 6 mL RPMI 1640 med 5% FBS och 10 μg/mL gentamicin för 18 hr. Media färgen är mer gul på grund av mer näringsmässig utarmning när ett större antal celler odlas i maträtter. Mer än 90% av cellerna är fortfarande mycket livskraftig. De bifogade viabla cellerna var lyfte av pipettering efter att ha suttit i PBS för 5 min och åter odlade omedelbart på 0.2x106/ml i färska media i 24 brunnar. Celler behandlades omedelbart med 0,4 mM palmitinsyra för 18 h med BSA som kontroll för varje källa (näringsämnen gradient) celler. Sedan var alla behandlade cellerna skördas och färgas med 7-AAD för celldöd eller färgas med intracellulära ceramide. Spontan celldöd (7-AAD +) var mindre än 8,6%. Behandling specifika celldöd uppskattades som % skillnaden i 7-AAD + mellan behandling och egen BSA styra (a). Behandling specifika ceramide nivån uppskattades som genomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) skillnaden mellan behandling och egen BSA kontroll (b). Experimentet upprepades, och representativa uppgifter presenteras. Felstapel representerar urval SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korrekt beredning av fettsyra lösning är av avgörande betydelse att studera den biologiska funktionen av fettsyror. Neutralisering av fettsyra ökar dess löslighet i vattenlösning. Natriumsalter av fettsyror, särskilt mättade fettsyror, är dock fortfarande av låg löslighet i vatten eller PBS som vi observerade. En metod är att använda 95-100% etanol för att upplösa fettsyra1. Med den här metoden kan högre toxicitet för celler observeras även vid lägre koncentrationer för mindre giftiga omättade fettsyror. Ett annat sätt att förbereda fettsyra lösning är att utnyttja metyl-β-cyklodextrin som ett leveranssystem så att fettsyror har optimala förhållanden, kvar i lösning i deras monomera form9,11. Fettsyror som tillagas med sådan metod verkade ha normal funktion, men genomför metoden är komplicerad. Effekterna av metyl-β-cyklodextrin på celltillväxt är att hög koncentration kan leda till cell död12. För mättade stearinsyra och palmitin syror används en hög temperatur (60 oC) att hjälpa till med lösbarhet9.
Sedan serum albumin är en viktig fettsyra-bindande protein i extracellulär vätska, vilket underlättar transport fettsyra i lymfatiska och vaskulära system, är det gynnade som naturlig bärare för funktionella studier av fettsyror. För att undvika låga löslighet fettsyra salt i vattenlösning, ultraljudsbehandling kommer kraftigt att underlätta konjugationen av fettsyra med BSA, thus medhjälp i fettsyra lösbarhet. Det tar mycket längre tid (timmar) till solubilize de mättade fettsyrorna än de omättade fettsyrorna (30 min) med samma mängd volym och koncentration. Trots värme och ultraljudsbehandling är kritiska för BSA-fatty acid konjugation, föreslås hög temperatur (mindre än 50 oC) för att få klart BSA-PA, BSA-SA konjugat lösningar och en låg temperatur rekommenderas starkt för solubilizing omättade fettsyror på grund av deras känslighet för oxidation vid hög temperatur. 5:2 molar förhållandet av fettsyra till BSA anses vara bra jämfört med 3:1 eller 6:1 molar förhållandet som var publicerade7. Detta kan säkerställa mindre helt-fri fettsyra i lösningen att undvika toxicitet av fettsyra tvål. BSA-fettsyror förberett detta sätt verkar vara stabila lösningar (ingen nederbörd, minst) vid 4 ° C under minst 3 månader som visas i deras funktionalitet på makrofag celldöd. Försegla locket på tuben om beredd fettsyror är inte skall användas under en lång tid.
När en klar lösning av BSA-fettsyra i PBS erhållits, motiveras konsekventa resultat från fettsyra behandling mer sannolikt. Dock reagerar svältande och välnärda makrofager helt olika på fettsyra behandling, särskilt mättade fettsyror. Makrofager med överskottet av näringsämnen är mer mottagliga för mättad fettsyra-inducerad celldöd än svälta eller svultit kära eftersom hungrig celler kan metaboliskt avgifta de mättade fettsyrorna på grund av deras överlevnad och tillväxt begäran. Sådan celldöd är starkt associerad med ackumulerade cellulära ceramid nivåerna. Notera inträffar ceramide toxicitet endast när intracellulära ceramid nivåerna når ett tröskelvärde. För att säkerställa konsekventa resultat från fettsyra som behandlade makrofager eller någon annan typ av celler, bör celler vara odlade med färska media med riklig näring. Suboptimal cell kultur villkor kan leda till suboptimala data.
Sammantaget ger dessa protokoll välbehövliga Detaljer för att studera effekterna av fettsyror på makrofager av andra laboratorier. Jämfört med andra metoder, genererar detta direkt förhållningssätt BSA-fatty acid konjugat utan att använda ett extra lösningsmedel som etanol. Det svåraste steget är att förbereda korrekt, stabil BSA-fatty acid lösning eftersom ultraljudsbehandling alstrar värme och det är svårt att kontrollera temperaturen. Lyckligtvis, omättade fettsyror är lätt att laga i en kort tid och förblir stabila, medan mättade fettsyror verkar stå relativt höga temperaturer eftersom de är mättade och motståndskraftiga mot oxidation i sådant skick. Hittills har vi inte observerat någon fråga eller begränsning med BSA-fatty acid konjugat förberett detta sätt. Ändring av våra protokoll skulle vara nödvändigt om känsligare experiment behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga ekonomiska intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds delvis av University of Louisville start-up fonderna och National Cancer Institute (Bethesda, MD) beviljar R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J.
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
