Summary
Denne protokollen viser vi bruk av føljetong-delen elektron tomografi å belyse mitokondrie strukturen i Drosophila indirekte flight muskel.
Abstract
Mitokondrier er mobilnettet kraftstasjoner som produserer ATP, lipider og metabolitter, i tillegg til å regulere kalsium homeostase og celle død. Den unike cristae-rik dobbel membran ultrastructure av denne organeller er elegant arrangert for å utføre flere funksjoner ved å partisjonere biomolecules. Mitokondrielt ultrastructure er nært forbundet med ulike funksjoner; men er de fine detaljene av disse struktur-funksjon relasjoner bare begynnelsen beskrives. Her viser vi bruk av føljetong-delen elektron tomografi å belyse mitokondrie strukturen i Drosophila indirekte flight muskel. Seriell-delen elektron tomografi kan tilpasses til å studere noen cellestruktur i tre-dimensjoner.
Introduction
Elektronmikroskop er et verdifullt verktøy å studere strukturelle sammenheng med subcellular samlinger og organelles som utfører cellulære prosesser. Metoder har blitt utviklet for å beholde ultrastructure av vev eller celler ved kjemiske fiksering med aldehyder eller ved høyt trykk frysing (HPF) etterfulgt av fryse substitusjon (FS)1,2. Innebygd prøven blokkene kan deretter delt, beiset og observert med en overføring elektronmikroskop (TEM). HPF prøven kan også behandles under cryo-betingelse som cryo-skjæring eller fokusert ion strålen (FIB) fresing og observert av cryo-EM3,4.
Selv om tynt-seksjonen EM gir informativ morfologiske innsikt, kan 2D bildene bare avsløre ultrastructure av et bestemt tverrsnitt. Hvordan ultrastructure er organisert i et 3D-volum forblir skjult. For å visualisere mobilnettet ultrastructure i tre dimensjoner, ble et elektron tomografi metoden utviklet der rekke tilt bilder ble kjøpt og tilbake anslått for å generere en tomographic rekonstruksjon5 (figur 1). En dobbel tilt serie kan samles av roterende prøven 90° og anskaffe en andre tilt-serien. Dette vil minimere mangler kileformet artefakter som skyldes begrenset utvalg vinkler og forbedre oppløsningen til tomogram.
Her beskriver vi bruk av seriell-delen elektron tomografi å studere mitokondrie ultrastructure av Drosophila indirekte flight muskel (IFM)6,7,8,9 . For å få 3D rekonstruksjoner dekker hele mitokondrier (ca 2,5 µm-tykk), ble seriell delene innhentet fra Drosophila IFM vev blokker. Tomograms i hver del ble samlet med automatisk samling programvare. Tomographic rekonstruksjoner ble generert og føljetong tomograms sluttet med IMOD pakken å få en rekonstruert volumet av en hel mitokondrie. De sammenføyde tomograms ble analysert av 3D-programvare. Tettheter på mitokondrie cristae var segmentert for å generere en segmentering modell som avslørte organisasjonen i tre-dimensjoner.
Protocol
1. delen Drosophila vev ved hjelp av en vibrerende blad mikrotom
- Bedøve Drosophila på is og fordype hver enkelt fly i 1 mL av 4% lavt Smeltepunkt agarose fosfat buffer. Tillate agarose å størkne på is. Vanligvis ble 4-6 fluer behandlet.
- Bruk en vibrerende blad mikrotom delen agarose gel innebygde Drosophila i skiver med 100 µm tykkelse og oppsluke etappe, den stabiliserende løsning som inneholder 2,5% glutaraldehyde inne 0.1 M fosfatbuffer.
Merk: Vibratome snitting foretrekkes fordi vev arkitektur er mer intakt sammenlignet med andre metoder. Alternativt kan dissekere pinsett brukes å analysere IFM i etappe, den stabiliserende løsningen inneholder 2,5% glutaraldehyde inne 0.1 M fosfatbuffer.
2. Forbered EM eksemplarer av høytrykks frysing og fryse substitusjonsbehandling (HPF/FS) metode
- Vask vev inndelinger i 3 dråper (~ 150 µL) fosfat bufferen, etterfulgt av 2 dråper (~ 100 µL) fosfat bufferen med 20% BSA. Plass deler i gull stativer for HPF fylt med buffer og 20% BSA.
- Laste utvalget som inneholder operatører i høytrykks fryser i henhold til brukerhåndboken.
- Etter frysing, slipp bærere fra abonnenten under flytende nitrogen og overføre til en fryse-substitusjon enhet kjølt ned til-140 ° C.
- Utføre fryse-substitusjon protokollen som vist i tabell 1, med FS cocktail som inneholder 2% glutaraldehyde, 2% osmium tetroxide og 0,1% uranyl acetate på aceton.
- Nøye fjerne de fra bærere med en nål og bygge eksemplarer i harpiks ved romtemperatur. Danner harpiks ved 65 ° C i 16 h.
Merk: FS protokoller bør endres for å forberede andre typer prøver. HPF/FS foretrekkes å bevare ultrastructure og minimere tap av mobilnettet innholdet.- Alternativt bruke en kjemisk fiksering protokoll. Fastsette prøver med 2,5% glutaraldehyde over natten, vask med buffere og deretter ordne med 1% osmium tetroxide for 2 h. vaske og tørke med stigende konsentrasjoner av etanol og deretter infiltrere og bygge eksemplarer i Spurrs harpiks før polymerizing ved 65 ° C 16 h.
3. klargjør fortsettelsene-deler av de Electron stengte
- Trim prøven blokkene for å avsløre den ønskede blokk ansiktet som inneholder vev.
- Pretreat gull partikler (10 nm i diameter) med 1% BSA for 30 min. vask og suspendere gull partikler i PBS buffer. Overlappe gull partikler på kobber spor nett belagt med karbon film å opprette fiducial markører.
- Sjekk under TEM å ha tilstrekkelig fiducial markører (minst 5-10-markører) i synsfeltet tomografi oppkjøpet.
- Kuttet føljetong deler, 200-250 nm i tykkelse ved hjelp av en ultramicrotome.
- Samle føljetong deler på sporet rutenett med en perfekt løkke for tynne snitt.
- Stain delene med Reynolds bly citrate i 10 min.
- Overlappe et ekstra lag av fiducial gull partikler på delene.
4. samle dobbel-tilt Electron tomografi
- Laste rutenettet på en dual-aksen tomografi holderen og sett inn transmission elektron mikroskop opererer på 200 kV.
- Juster mikroskopet på eucentric fokus.
- Definer den automatiske samling programvaren. Juster og justere elektronstråle på multi-skala tenkelig innstillingen. Se brukerhåndboken for operasjonen detalj10 (figur 2).
- Få kameraet mørke og lyse referansene i et tomt område uten karbon filmen tomografi samling innstillingen.
- Samle et rutenett atlas ved lav forstørrelse. Velg mitokondrier på seriell deler som mål for tomografi samling.
- Anskaffe en tilt-serien fra 60 ° til + 60 ° med 2 graders intervaller på aksen-en for hvert mål.
Merk: Tilt vinkler vil være mekanisk begrenset av utformingen av prøveholderen. Abonnenten vil blokkere bjelken i høy tilt vinkler. - For å samle den andre tilt-serien, kan du rotere prøveholderen 90°. Kjøpe en ny atlas. Velg tilsvarende posisjoner og erverve tilt serien på aksen-B for hvert mål.
Merk: Andre programvarepakker, som SerialEM og Xplore3D, er tilgjengelige for automatisk datainnsamling.
5. rekonstruere 3D Tomograms og Segment sub-volumer med programvare
- Rekonstruere tomograms dual-aksen tilt bilder ved hjelp av IMOD programvare11.
- Se brukerhåndboken for operasjonen detaljer.
- Justere individuelle tilt serien med plasseringen av gull fiducial markører. Rekonstruere tomograms ved metoden tilbake projeksjon eller metoden samtidige iterativ rekonstruksjon teknikk (SIRT) for både akse-A og akse-B henholdsvis (Figur 3).
- Kombinerer tomograms av akse og akse-B til å generere en dobbel-tilt tomogram med redusert mangler kile gjenstand.
- Delta sammen dobbel-tilt tomograms av føljetong å få rekonstruksjoner dekker hele mitokondrie volum. Modell gapene mellom føljetong delene av programmet IMOD.
- Trim sluttet tomograms og bin til en ønsket størrelse for volum segmentering.
- Analysere sammenføyde føljetong tomograms med 3D-programvare.
- Se brukerhåndboken for operasjonen detaljer.
- Filtrere tomograms med filtere Gaussian (eller andre ønsket metode) for å forbedre kontrasten av funksjoner og redusere bakgrunnen tettheter.
- Segmentere ultrastructure av mitokondrier manuelt eller automatisk.
- Vis segmentering modeller tillate inspeksjon i 3D.
- Generere filmer ved hjelp av verktøyene i 3D.
Representative Results
Vi brukt føljetong-delen elektron tomografi å analysere strukturfunksjonene av mitokondrie cristae som gjenspeiler sin energiske tilstand og aldring. Vi viste at mitokondrier i Drosophila IFM danner en integrert cristae og matrix nettverk i 3D (Figur 4)7. I tillegg akkumulert mutant fluer med Mitokondrielt DNA replikering feil og en akselerert aldring fenotypen mitokondrier som inneholdt undersider av løk-lignende virvlende kjernen (figur 5)7.
Figur 1: bilde av elektron tomografi rekonstruksjon fra en tilt. I forsøket sendes elektronstråler gjennom et 3D-objekt når objektet er skrå til ulike grader. For hver tilt tilstand, en 2D-projeksjon genereres og tatt med et kamera. 2D anslagene forventes deretter tilbake for å rekonstruere 3D-objektet basert på sentrale skive teoremet. I illustrasjonen vises den samme prosessen for en opprinnelige 2D-bildet som projiseres inn én dimensjon under ulike tilt vinkler. 1D anslagene brukes deretter til å rekonstruere 2D-bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: automatisk datainnsamling. En bilde seer skjerm programvare viser atlas av et spor rutenett som inneholder føljetong inndelinger, multi-skala målretting av mitokondrier og kjøpte tilt bilder. Skala bar = 500 µm (venstre øvre panel), 100 µm (venstre nedre panelet), 1 µm (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Føljetong-delen elektron tomografi av en enkelt mitokondrie i Drosophila indirekte flight muskel. (A) 2D micrographs og (B) 3D tomograms fra føljetong deler som dekker hele volumet av en mitokondrie. (C) sluttet føljetong-delen tomograms er anslått til å opprette en langsgående delen med z-aksen vises loddrett. Spesielt førte vev snitting til tap av materiale, slik at gapene mellom sluttet tomograms. Skala bar = 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: integrert intra-mitokondrier cristae og matrix nettverk i 3D. (A) skiver av mitokondrie elektron tomographic rekonstruksjoner viser veksler mellom lamellær membraner gjennom z-aksen. (B) illustrasjoner av observert cristae bytte mønstre høyre hånd og/eller venstrehendt spiraler. (C) Tomographic segmentering illustrerer en venstrehendt spiral i 3D (D) Cristae bytte mønstre ble analysert og farge gjengitt på segmentering modellen (E, F). Tomographic skive vise lateral matrise confluency (mørke tettheter, merket rød) over cristae membraner (hvit tettheter). (G) segmentering modell av tomogram i (E) viser lateral matrise confluency (i rødt) og representative cristae (i grått). Skala bar = 50 nm (A), 200 nm (C) og 300 nm (D, E, F, G). Tallet var nytt fra Jiang et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: mitokondrier med løk-lignende virvlende kjerner akkumulert i fluer med Mitokondrielt DNA replikering feil under aldring. Representant tomographic skiver og den tilsvarende segmenteringen (høyre panel) viser en tverrsnittvisningen (øverst) og en langsgående-seksjonen visning (nederst) av en virvlende kjerne. Volum segmentering angis av vilkårlig fargegjengivelse å markere virvlende kjernen. Skala bar: 200 nm. Tallet var nytt fra Jiang et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Temp | Tid | Løsning | |||
| 1 | -140 ° C-9 0 ° C | 30 min | Flytende nitrogen | |||
| 2 | -90 ° C | 96 hr | FS cocktail | |||
| 3 | -90 ° C til 60 ° c. | 6 t (5 ° C/t) | FS cocktail | |||
| 4 | -60 ° C | 12 hr | FS cocktail | |||
| 5 | -60 ° C til 25 ° c. | 7 hr (5 ° C/t) | FS cocktail | |||
| 6 | -25 ° C | 12 hr | FS cocktail | |||
| 7 | 25 ° c. 0 ° c | 5 t (5 ° C/t) | FS cocktail | |||
| 8 | 0 ° C | 1 hr x 3 ganger | Aceton | |||
| 9 | Romtemp | Harpiks infiltrasjon | ||||
Tabell 1: Fryse-substitusjon protokollen.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en optimalisert arbeidsflyt for å bruke føljetong-delen elektron tomografi å studere 3D mitokondrie ultrastructure av Drosophila indirekte flight muskel. Bevaring av ultrastructure i eksemplet er den primære tekniske utfordringen for denne typen analyse. For å best bevare ultrastructure to metodologiske ble skritt inkludert. Først samplede vev ved snitting med vibrerende blad mikrotomen for å opprettholde vev arkitekturen som mulig. Andre var en HPF/FS protokoll optimalisert for å bevare organelle ultrastructure under utarbeidelse av innebygde prøven blokker. Prøvene ble frosset under høyt trykk, noe som senker frysepunktet for vann og reduserer dannelsen av iskrystaller som skade ultrastructure1. Prøver så tykk som 0,1 mm kan være vitrified umiddelbart, og deretter utsatt for å fryse substitusjon for å generere prøven blokker for EM analyse. Forbedret bevaring av ultrastructure av HPF/FS ble bemerket, sammenlignet med kjemiske fiksering metoder. Bruker denne rekken av trinn for eksempel forberedelse, ble mitokondrie dobbel membraner og cristae membraner forbedret.
Å skaffe føljetong deler av prøven er den mest utfordrende trinnet av metoden. Som farten elektronstrålene har begrenset penetrasjon makt, tykkelsen på delen er begrenset til enten 250 nm eller 500 nm bruker en TEM opererer på 200 kV eller 300 kV, henholdsvis. Tykkelsen av en mitokondrie kan være mer enn 2 µm, må seriell deler få full volum rekonstruksjoner. Gjenopprette et tilstrekkelig antall serielle deler å strekke seg over en hel organeller er imidlertid en teknisk utfordring. Trimming blokk ansiktet til å være så flat som mulig mellom baser av trapes kan tillate et spor rutenett å imøtekomme flere inndelinger og dekker dermed større volumer. I tillegg øker bruker en perfekt løkke for tynne snitt suksessrate på overføring delene føljetong til rutenettet.
Seriell-delen elektron tomografi kan oppnås med standard EM core utstyr. Metoden har imidlertid noen uunngåelige begrensninger som oppstår fra tekniske begrensninger. En er at materialet er uunngåelig tapt mellom føljetong, la det være mellomrom i sammenføyde gjenoppbyggingen. Andre er mangler kile gjenstand, som oppstår på grunn av begrenset tilt vinkler som er oppnåelig. Denne begrensningen oppstår fordi prøveholderen ikke kan slås i en full rotasjon uten sperring elektronstråle. Til tross for disse begrensningene gir føljetong-delen elektron tomografi tilstrekkelig oppløsning til å avsløre cellular og organelle ultrastructure i 3D.
For mindre skala bildebehandling er cryo-elektron tomografi en ny teknologi som kan brukes til å få strukturen til macromolecular komplekser og sammenstillinger i situ nm eller sub angstrom oppløsning i kombinasjon med sub-tomographic gjenoppbygging3. I dette programmet, er celler tynnet ved snitting eller fokusert ion strålen fresing under flytende nitrogen. Tomograms er samlet under cryo-forhold der molekylære strukturer beholdes nær den opprinnelige tilstanden uten kjemiske fiksering, dehydrering eller innebygging. I den andre enden av skalaen, analysere store vev volumer på bekostning av oppløsning, er føljetong blokk-ansikt skanning elektronmikroskop en tiltalende modalitet selv om det krever en bestemt instrument4.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Studiene ble utført i EM kjernen Institute av mobilnettet og Organismic biologi og cryo-EM kjernen i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Arbeidet ble støttet av Academia Sinica og det meste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
