Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiplexed immunofluorescens analys och kvantifiering av Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Studera tumören närmiljön kan identifiera prediktiva eller prognostiska biomarkörer för kliniskt svar på immunterapi. Presenteras här, är en innovativ metod baserad på i situ fluorescens Multispektral avbildning för att analysera och räkna automatiskt olika subpopulationer av CD8+ T celler. Denna reproducerbara och tillförlitlig teknik är lämplig för stor kohort analyser.

Abstract

Immunceller är viktiga komponenter i den tumör närmiljön och påverka tumörtillväxt och evolution i alla skeden av carcinogenes. Särskilt, är det nu väl etablerat att det immuna infiltrera i mänskliga tumörer kan korrelerar med prognos och svar på behandling. Analysen av det immuna infiltrera i den tumör närmiljön har blivit en stor utmaning för klassificering av patienter och behandlingssvaret.

Samtidig uttrycket av hämmande receptorer såsom Program Cell Death Protein 1 (PD1; även känd som CD279), cytotoxiska T-lymfocyter associerade Protein 4 (CTLA-4), T-Cell immunglobulin och Mucin som innehåller göra Protein-3 på (Tim-3; även känd som CD366) och lymfocyter Aktivering gen 3 (Lag-3; även känd som CD223), är ett kännetecken för T-cell utmattning. Vi utvecklat ett multiparametric i situ -immunofluorescens färgning för att identifiera och kvantifiera på cellnivå samtidig uttrycket av dessa hämmande receptorer. På en retrospektiv serie frysta vävnad av renal cell carcinom (RCC), använda en fluorescens Multispektrala bildteknik tillsammans med en bild analys programvara, det konstaterades att samtidig uttryck av PD-1 och Tim-3 på tumören infiltrerar CD8+ T celler korreleras med en dålig prognos hos RCC. Till vår kunskap, Detta representerar den första studien som visar att detta automatiserade multiplex i situ teknik kan ha viss klinisk relevans.

Introduction

I de senaste åren, har immunterapi vuxit fram som en mycket lovande behandling för många typer av cancer, inklusive RCC. Särskilt, immunterapi baserat på hämning av hämmande kontrollpunkter som PD-1 och CTLA-4 har rapporterats vara kliniskt effektivt1,2,3,4,5, 6. monoklonala antikroppar mot CTLA-4, PD-1 eller Program död Ligand 1 (PD-L1) redan har godkänts i flera cancerformer och leda till långvariga kliniska svaren i mer än 20% av patienterna7. Dock inte alla patienter responders, kostnaden för behandling är hög, och dessa behandlingar är giftiga, leder till potentiella allvarliga autoimmuna-liknande biverkningar. Utmaningen är därför att identifiera prediktiva markörer till dessa nya immunterapier. Graden av mutationer i tumören, uttrycket av PD-L1 eller nivåerna av intratumoral CD8+ T cell infiltration har rapporterats korrelera med kliniskt svar. Den här associeringen är dock fortfarande för svag för att rekommendera användning av dessa kliniska biomarkörer i klinisk praxis utom testet följeslagare för PD-L1 före administreringen av Pembrolizumab i icke-small cell lung cancer (NSCLC) patienter8 ,9,1011,12. Det har visats att samtidig uttrycket av många hämmande receptorer som PD-1, Tim-3, lagg-3, och CTLA-4, inducerar en cell utmattning fenotyp och resistens mot behandling13,14,15. Eftersom perifert blod inte är representativt för den tumör mikromiljö, är det av stort intresse att analysera de fenotypiska egenskaperna hos de celler i situ. PD-1 och Tim-3 Co uttrycker T-celler är kända för att vara funktionellt nedsatt celler i flera sammanhang13,16,17. I denna studie, den prognostiska effekten av samtidig uttrycket av de två hämmande receptorerna PD-1 och Tim-3 på CD8+ T celler bedömdes.

Upp förrän nu, studera samtidig uttrycket av flera markörer på tumören infiltrerar lymfocyter (TILs) har främst utförts av flödescytometri Flödesanalys, vilket gör det nödvändigt att arbeta på färska tumörer och därför att den utgör hinder retrospektiva analyser. Endast en färgning i taget kan utföras med konventionella i situ färgning, och karakterisering av den celltyp som tillsammans uttrycker markörerna är inte möjligt. Till exempel uttrycks PD-L1 av många celltyper av den tumoral mikromiljö, vilket gör det svårt att definiera av konventionella immunohistokemi analys vilka celler som uttrycker PD-L1 är desto mer relevant för korrelat studier. I detta arbete, vi utvecklat en innovativ i situ multiparametric immunofluorescens metod med dator-inventering för att korrelera samtidig uttrycket av PD-1 och Tim-3 av tumören infiltrerar CD8+ T-celler med kliniska resultat i RCC. Denna teknik har flera fördelar, inklusive möjligheten att analysera på en enda cellnivå och flera markörer på samma gång använder en Multispektrala kamera som kan fånga begränsade intervall > 10 nm genom flytande kristall filter18. Förfarandet är dessutom automatisk som möjliggör en Inter operator reproducerbarhet och en förkortad analys jämfört med manuella tekniker19. I fältet cancer rapporterat flera studier övertygande flera färgningar av immun molekyler som PD-1, PD-L1 och CD8 i Merkel-cell carcinoma, lungcancer, och huvud och hals cancer20,21,22, 23. det automatisera celltalet är möjligt med utbildning av användaren (fenotypning steg). Fluorescensen mäts i olika cell fack (kärnor, cytoplasman och membran).

Här, olika undergrupper av tumör-infiltrera CD8+ T celler uttrycker PD-1 och/eller Tim-3 i en stor kohort av RCC räknades och resultaten var korrelerade med kliniska gravitation noter och överlevnad parametrar. Det var också möjligt att analysera membran fluorescensintensitet med den cellulära upplösningen med menar fluorescens intensitet (MFI) data som i flödescytometri. Såvitt vi vet, representerar detta första rapportering prognostiska studieresultaten använder denna Multispektrala bildteknik baserat antal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av den lokala etiska kommittén (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Informerat samtycke erhölls från de deltagare som ingår i kohorterna.

1. vävnadsprover

  1. Samla RCC vävnadsprover på operationsdagen. Hantera kirurgiska preparatet vid rumstemperatur (patologiavdelningen).
  2. Samla en tumör prov av ungefärligt 0.5 x 0.5 cm x 0,5 cm storlek i ett torrt rör. Snapin frysa i flytande kväve och lagra vid-80 ° C.
  3. Coat proverna i optimal skärtemperatur förening. Avsnitt proverna med en kryostat vid-20 ° C i 4-6 µm tjocka sektioner. Låt proverna lufttorka på bilder för 12 h och direkt lagra dem vid-80 ° C för att undvika uttorkning.
  4. Kontrollera kvaliteten på provet genom att visa en Hematoxylin och Eosin målat avsnitt.

2. in Situ immunofluorescens färgning av TILs

  1. Riktlinjer för förfarandet
    1. Utföra alla experimentella åtgärder vid rumstemperatur.
    2. För alla steg, utföra spädningarna med Tris buffert saltlösning (TBS, se Tabell för material).
    3. Gör tvätten i TBS för alla steg utom efter primär antikropp ruvning. För de senare använda Tris buffert saltlösning Tween20 (TBST, se Tabell för material). Se kompletterande Tabell1för buffert sammansättning och beredning.
    4. Använda en fuktkammare för antikropp inkubationer och en färgning burk för tvätt.
    5. Låt inte avsnittet torka ut under förfarandet.
  2. Förbehandling
    1. Tina i bilden som innehåller vävnadsprov och noggrant torka i bilden runt preparatet med en pappershandduk. Avgränsa området reaktion som innehåller vävnaden med en hydrofoba barriär penna (se Tabell för material). Torka i 2 min.
    2. Fixa proverna i 100% aceton för 5 min, torka i 2 min, och tvätta med TBS i 10 min.
  3. Mättnad och blockad
    1. Förbehandla bilderna i 10 min med 3 droppar av avidinen 0,1%, tryck eller flick bilden för att distribuera metoden och avlägsna luftbubblor, och sedan behandla i 10 min med 3 droppar av biotin 0,01% (se Tabell för material), tryck eller flick. Tvätta med TBS.
    2. Utföra en Fc receptorer blockad. Tillsätt 100 µL av en 5% volym/volym av normala serum utspätt i TBS. använda serumet från samma värdart som märkt sekundära eller tertiary antikroppen (se Tabell för material). här, användes åsna serum. Inkubera i 30 min.
    3. Under inkubationstiden, kort snurra den anti-CD8 och PD-1 Tim-3 antikroppar (Tabell för material). Förbered blandningen av primära antikroppar i TBS som beskrivs i kompletterande tabell2.
  4. Immuno-färgning för CD8, PD-1 och Tim-3
    1. Förbered blandningen primär antikropp. Se Tabell för material och kompletterande tabell2 för de antikroppar som används (anti-CD8, PD-1, Tim-3 och deras motsvarande sekundära antikroppar) och deras koncentrationer.
    2. Tryck eller flick återstående åsna serum (lades till i steg 2.3.2). Inkubera i bilderna med 100 µL av den icke-märkt primära antikroppar mix för 1 h i en fuktig kammare.
    3. Under inkubationstiden, kort snurra den cyanin 5 anti-kanin, AF488-anti-get och biotinylerade anti-mus-antikroppar och Förbered blandningen av sekundära antikroppar som beskrivs i kompletterande tabell2.
    4. Tvätta objektglasen i TBST för 5 min. torr bilderna.
    5. Inkubera i bilderna med 100 µL av de sekundära antikropparna i 30 min i en fuktig kammare.
    6. Förbered blandningen av tertiär antikropp som innehåller Cy3-streptividin som beskrivs i kompletterande tabell2.
    7. Tvätta objektglasen i TBS för 10 min. torr bilderna.
    8. Inkubera i bilderna med 100 µL av tertiär antikropp blandningen i 30 min.
    9. Tvätta objektglasen i TBS för 10 min. torr bilderna.
  5. Cell montering
    1. Montera bilder i en 4', 6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid DAPI-innehållande montering medium (1,5 µg/mL DAPI) med ett täckglas som är kompatibel för fluorescensmikroskopi (se Tabell för material).
      Obs: Som en negativ kontroll för varje experiment, användes en bild med isotyp-matchade antikroppar i samma koncentration som motsvarande antikroppar. För denna färgning använt vi Mus IgG1, kanin IgG och get IgG negativa kontrollen antikroppar (se Tabell för material). Som positiv kontroll använde vi mänskliga hyperplasic tonsill som är kända för att vara positivt för de testa markörerna, för varje experiment. En typisk färgning beskrivs i resultaten (figur 1). Mono-färgning av CD8, PD-1, och Tim-3 bör utföras individuellt (en färgning per bild) med samma förbehandling och utan DAPI. En bild i samma experimentella villkor utan någon antikropp och endast DAPI monteringsmedium bör också utföras. En bild bör avbildas med identiska experimentella förhållanden utan någon antikropp och utan DAPI.

3. fluorescens analys och automatiserade celltal

  1. Bild förvärv med automatiserade mikroskopet
    1. Skapa ett protokoll.
      1. Slå på automatiska Mikroskop mjukvaran och fluorescens Upplysaren.
      2. I menyraden, klicka på ”File”, ”skapa protokollet”, Välj ”DAPI”, ”FITC” och ”TRITC”.
      3. ”Nästa”, ”vävnad avsnitt”, och klicka på ”nästa”, ”protokollets namn”. Välj ett namn, till exempel ”CD8-PD-1-Tim-3”, klicka ”Nästa” och ”spara”.
      4. Placera en bild manuellt på scenen.
      5. I menyraden, klicka på ”setup”, ”inställningar”. Klicka på ”Ange hem Z” i det nya fönstret.
      6. Justera exponeringstid med en positiv kontroll glida dvs en CD8, PD-1 och Tim-3 triple-färgade med DAPI provet.
      7. I reglagelisten Klicka på ”Ange exponering”.
      8. Justera exponeringstiden för varje filter tills en tillräcklig men inte mättar signal erhålls.
      9. För monokroma imaging, utföra följande:
      10. Välj förvärv och välj DAPI filter under 'autofokus'.
      11. I ”scan område gräns”, flytta den objektiva övre till det övre vänstra hörnet av bilden. Klicka på ”Markera”. Gör samma sak för det nedre högra hörnet.
        Obs: Detta steg delimitates området av låg effekt imaging (LP imaging) på 4 X; Tänk på att placera märket väl så att de omger alla prover av serien.
      12. För hög effekt (HP) imaging, utföra följande:
      13. Under 'Autofokus', väljer du ”DAPI”.
      14. Under 'Förvärv' band, väljer du ”DAPI”, ”FITC”, ”Cy3” och ”Cy5”. Klicka på ”OK”. Klicka på ”File”, ”spara protokoll” på menyraden.
    2. Skanna bilder.
      1. Fyll protokollet genom att klicka på ”File”, ”läsa in protokollet” från menyraden. Klicka på ”Start”.
      2. Ange 'Lab ID' (mapp för bildlagring). Ange bild-ID för att identifiera bilden. Klicka på ”Nästa”.
      3. Klicka på ”monokrom Imaging” (för att skanna hela bilden under ljusa fält ljus och förvärva sekventiell bilder med hjälp av en 4 x-objektiv).
        Obs: Detta ger en gråskala översikt över bilden.
      4. Klicka på ”hitta preparatet”. Välj området av vävnad som ska skannas med låg upplösning (4 x): håll 'Ctrl'-tangenten och klicka på ett fält som använder markören för att markera eller avmarkera fält (figur 2A).
      5. Klicka på ”LP Imaging” (4 x imaging) för fluorescerande röd blågrön bild förvärvandet av varje fält.
      6. För HP fältet urval, hålla ned ”CTRL” och klicka på ett fält som använder markören för att markera eller avmarkera fält som motsvarar området i vävnader som kommer att skannas på hög upplösning (20 x). Välj 5 fält (figur 2B).
      7. Klicka på ”HP Imaging” (20 x imaging) för en Multispektrala bild förvärvandet av varje fält (figur 2 c).
      8. Klicka på ”datalagring” för att lagra bilder i mappen som valdes i början i Lindberg.
        Obs: Processen är sammanfattat och illustreras i figur 2. För varje steg (vävnad upptäckt, fältet urval) kan en algoritm ökas och utbildade av användaren för en helt automatiserad skanningsprocess.
  2. Fluorescens bildanalys och automatisk cell räknar med kopplade analysprogramvara
    1. Bygg det spektrala biblioteket.
      1. Öppna programvaran bild analys.
      2. Öppna ”bygga bibliotek” på den vänstra panelen. Under 'Ladda bild', klicka på ”Bläddra” och välj en mono-färgade bild (t.ex., CD8/cyanin 5).
      3. Välj fluorophore, (t.ex., cyanin 5). Klicka på ”extract”. Klicka på ”Spara” för att lagra i biblioteket. Klicka på ”Spara”.
      4. Upprepa samma process för PD-1, Tim-3 och DAPI mono-färgade presentationer för att integrera spektrumet av varje fluorophore sevärdheter.
        Obs: Bygga det spektrala biblioteket integrerar spektrumet för varje fluorophore används för specifika vävnaden (här, njure), men 'syntetiska' bibliotek som redan finns kan användas. Autofluorescens spektrumet är strikt i förhållande till vävnaden, är det viktigt att utföra ett auto-fluorescens och spektrala bibliotek per projekt.
    2. Skapa ett nytt projekt.
      1. Från menyraden, klicka på ”Arkiv”, ”nytt projekt”. Välj ”cell segmentering” i fliken ”hitta funktionen'. Välj ”fenotypning” i fliken 'Fenotypning'. Klicka på ”Skapa”.
      2. Integrera de representativa bilderna i projektet.
        1. Klicka på ”Öppna bild” i fliken 'Arkiv'. Välj 10 till 30 representativa bilder av hela serien. Lägga till icke-färgade bilden för att ta bort autofluorescens. På den högra panelen: Välj bibliotek källkod. Välj fluorophore och de som motsvarar den spektrala bibliotek som tidigare byggt.
      3. Ta bort vävnad autofluorescens, klicka ”AF” knappen och välj sedan området av autofluorescens i tomma bilden.
      4. Bild behandling och sammansatt bild generation.
        1. Klicka på ”Förbered alla” för att integrera fluorescens biblioteket och autofluorescens spektra att generera den sammansatta bilden (figur 3). Klicka på ikonen 'öga' att öppna panelen 'Visa editor' och välj de data som visas: Välj markörer CD8, PD-1, Tim-3 och DAPI. Ta bort autofluorescens. Följ stegen presenteras av programvaran.
      5. Segmentera cellerna.
        1. Om du vill segmentera cellerna, i 'Fack', Välj ”kärnor” och ”membran”. I fliken ”kärnor” att som den nukleära motfärg DAPI.
        2. På fliken 'Högsta och minsta storlek (px)' Ange ”40” och ”176” som minsta och största storlek, respektive. För 'Minimum' signal, ange ”0.13”. I ”Split” fliken, ange ”2,60”. I ”kärnor” fliken, ange ”0.81”. Välj ”Använd membran signal till stöd segmentering”.
        3. Klicka på ”segmentera celler” på den nedre delen av skärmen. Kontrollera segmentering av kärnor och hinnor av celler och igen med olika parametrar om det inte matchar den DAPI och membran fluorescensen av cellerna.
          Obs: Programvaran kan identifiera cellerna med den nukleära DAPI färgning och baserat på Cellstorlek. Justera cell parametrar (storlek, split, pixlar) enligt projektet.
      6. Fenotyp cellerna.
        1. Klicka på ”Lägg till” i fliken 'Fenotyp'. Skapa cell fenotyp kategorier: CD8 (blue dot) / CD8-PD-1 (röd prick) / CD8-PD-1-Tim-3 (grön punkt) / andra (svart prick) (figur 4).
        2. Välj fler än 5 exempel på cellerna i varje kategori. Klicka på ”träna klassificerare”.
          Obs: Detta genererar en statistisk klassificering algoritm av programvaran.
        3. Klicka på ”fenotyp alla” för att erhålla fenotypen av varje cell.
          Obs: Programvaran ger fenotypen av en cell med ett konfidensintervall (CI) noggrannhet.
        4. Förbättra algoritmen genom utbildning programvaran tills skillnaden mellan ögat och automatiserade count är samstämmiga (felet < 5%). Välja en CI som är godtagbart för cellerna i intresse.
          Obs: Vi valde att göra utbildningen på grundval av 55% CI som acceptabel.
      7. Spara algoritm och projekt.
      8. Under 'Arkiv' väljer du ”projekt”. Name it och klicka på ”Spara”.
    3. Utföra batch analys av serien.
      1. Välj ”Batch analys”. Välj projektet. Lägga till bilderna för att analysera. Välj en mapp för lagring av data. Klicka på ”Kör”. Kontrollera kvaliteten på den sammansatta bilden. Verifiera fenotypning för alla bilder i serien.
        Obs: Kopplat bild analys mjukvaran integrerar alla cell fack (membran/cytoplasman/kärnor) signaler. Fenotypning steget är avgörande om än utbildning av algoritmen kan vara ett tidskrävande steg. Samtliga uppgifter från varje bild är i en .txt fil. Alla data i en cell (särskilt dess fenotyp som ges med dess CI) är på en rad. För varje bild utfördes bild förvärv och efterföljande räknas på 5 fält.
  3. Integrationen av rådata och generering av det automatisera celltalet
    1. Beräkna data med ett statistiskt program.
      1. Beräkna alla data från 5 bilderna motsvarar fälten 5 analyseras för 1 patient. Använda en statistisk plattform, och har erfarna statistiker, Datahanteraren eller en dataexpert som utför analysen. Bygga ett skript som automatiskt räknar cellerna beroende på deras fenotyp, välja de CI > 55%.
      2. Sätta alla .txt filer av serien i samma mapp.
    2. Extrahera data.
      1. Lägga alla .txt filer i en mapp. Kör skriptet automatisk inbyggd steg 3.3.1. Öppna CSV-filen skapas av skriptet R. Spara som .xl format. Utdata samlar antalet celler för varje fenotyp (dvsCD8 ensam, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) för varje patient.
      2. Beräkna det genomsnittliga antalet celler för varje patient per fält: dividera antalet celler per antalet fält (dvs.5) att normalisera antalet celler för varje patient per fält.
      3. Beräkna andelen bland totalt CD8 celler på PD-1+ + T celler och bland totalt CD8 celler på PD-1+ Tim-3+ + T celler. Se figur 5 Sammanfattning av detta steg.
        Obs: R-språket (eller annan programmering programvara val) krävs korrekt skapa och kör kommandon, och så en erfaren användare eller statistiker/data scientist är viktigt. R programmet kan beräkna data på samma patient, men namnet 5 .txt filer med en patient ska ha en identisk början, motsvarar en unik identifierare som patient.
  4. Statistisk analys
    1. Använda statistisk programvara för statistisk analys av resultaten.
    2. Utföra lämpliga statistiska analyser med hjälp av en statistiker.
      1. Användning av icke-parametriska Wilcoxons undertecknade rank test för jämförelse av PD-1 MFI mellan två cell fenotyper (figur 6). Korrelera de kovariat och histologiska egenskaper med en Pearsons chi2 test.
      2. Använda en Kaplan-Meier-metod för att uppskatta progressionsfri överlevnad, och Cox regressionsmodeller att uppskatta kovariat effekterna på tid-till-händelse utfall, såsom överlevnad och överlevnad.
      3. Överväga p-värden lägre än 0,05 som betydande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använda det allmänna protokoll som beskrivs ovan, vi syftar till att kvantifiera intratumoral CD8+ T celler tillsammans uttrycker de hämmande receptorerna PD-1 och Tim-3 i frysta vävnader från patienter med RCC, och att korrelera resultaten med kliniska resultat25.

Optimering av CD8/PD-1/Tim-3 färgningen:

Olika arter av antikroppar (mus, kanin och get, se Tabell av Material) valdes för att undvika kors reaktion mellan de olika antikropparna. Protokollet har validerats på en tonsill, som är en organiserad lymfoid vävnad. PD-1 färgning kunde hittas i den stilbildande centren (figur 1), medan CD8 och Tim-3 färgning förekommer kring den stilbildande centren. Observation av denna typiska färgning verifieras detta protokoll. Färgningen validerades också på vävnad av intresse (njure).

Avsaknad av signal av primär antikropp inkuberas med sin icke-motsvarande sekundär antikropp (inga data anges) bekräftades. Att analysera exakt fluorescens färgningen och göra särskilda spektrala bibliotek, enskilda bilder ensamma var fläckade av varje markör (CD8, PD-1, Tim-3 eller DAPI) i vävnaden av intresse (njure). En icke-färgade bild under samma förhållanden är nödvändigt att extrapolera autofluorescens av vävnad. Färgningen analyserades av automatiserade mikroskopet, som integrerade spectrums av de olika fluorophores; varje markör var väl differentierade och ingen överlappning av markörer observerades (figur 3).

Kvantitativa och kvalitativa egenskaper hos CD8 + Infiltrera i 87 RCC patienter:

Resultaten visade att ungefär hälften av CD8+ T cells express PD-1 (medelvärde 53,9%; SE: 30,49%) och ungefär en tredjedel var dubbel positiv PD-1+ Tim-3+ (medelvärde 38.16%; SE: 28.11%). Tim-3 uttryck utan PD-1 uttryck upptäcktes i mindre än 3% av CD8+ T cells (inga data anges). Det genomsnittliga antalet CD8+ T cell subpopulations var: Summa CD8+ T cells 116,5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T cells 89.32 (SE: 191,8), PD-1+ Tim-3+ 66,9 (SE: 143), och PD-1+ Tim-3– CD8 + T cells 22,38 (SE: 57,5) per fält. Det totala antalet intratumoral CD8+ T celler var positivt korrelerade med procentandelen av PD-1+ Tim-3+ på CD8+ T celler.

Funktionell karakterisering av CD8 + T Cells beroende på deras fenotyp PD-1 och Tim-3:

PD-1 uttryck nivå är känt för att vara korrelerade med T-cell utmattning så vi nästa som syftar till att mäta PD-1 uttryck på CD8 celler+ T enligt Tim-3 uttryck status. Som genomsnittlig fluorescensintensiteten hos de olika fluorokromer rapporteras på cellnivå, en liten serie av patienter analyserades manuellt för mobildata: resultaten visade en korrelation av PD-1 membran MFI med undertypen cell. PD-1 fluorescerande intensitet var uppmätta (figur 6) på cellnivå på PD-1+ Tim-3+ kontra PD-1+ Tim-3– CD8+ T celler (en panel) och på patienten individnivå efter att integrera dessa olika cell-signaler på en vävnad avsnitt. I en serie 9 patienter fann en jämförelse med Wilcoxon parat test att PD-1 MFI är högre när Tim-3 uttrycks Co, förstärka funktionella relevansen av Tim-3 uttryck (B panel).

Uttryck av PD-1 och Tim-3 ligander på ytbehandla av tumörcellerna från flera Co färgning:

Som T-cell utmattning medieras via receptorn/ligand interaktion, bedömde vi uttrycket av PD-1 och Tim-3 ligander (PD-L1 och galektinbindande-9 (Gal-9), respektive) på nedsatt tumörceller som identifierats av pan-Keratin färgning. Positivitet definieras som en cut-off på 10 procent av tumörceller som uttrycker markören: (i) 58 av 87 patienter (66%) var positiva för PD-L1; (ii) alla 15 tumörerna analyseras var positiva för Gal-9 (figur 7A, B).

Kliniska effekten av samtidig uttrycket av Tim-3 + PD-1 + på CD8 + T-celler:

Tumör nod metastaser (TNM) scoring, Fuhrman grade, tumörens storlek och UISS Poäng är histologiska egenskaper (i kombination med kliniska Poäng för UISS) används för att definiera värdet prognos av primära RCC. En positiv korrelation observerades mellan de nummer och/eller andelen tumör-infiltrera CD8+ T celler uttrycker PD-1 och Tim-3 (men inte uttrycker endast PD-1 utan Tim-3) med alla dessa parametrar (tabell 1). I linje med detta mer nedsättande fenotyp, RCC patienter med CD8+ T celler tillsammans uttrycker PD-1 och Tim-3 ovan procentandelen median (34,7) var mer benägna till återfall (p = 0.046; HR 2,9; 95% KI: 1,02-8.21). Denna korrelation observerades inte med procentandelen av PD-1 på CD8+ T cells oberoende av Tim-3 status (tabell 2). Visades också en korrelation mellan andelen CD8+ T celler tillsammans uttrycker PD-1, Tim-3 och 36 månader totala överlevnaden (inga data anges). Vi validerat också den tredubbla immunfärgning på tonsill paraffin vävnader (figur 1).

Figure 1
Figur 1: CD8-PD-1-Tim-3 immunfärgning på en tonsill paraffin-inbäddat vävnad. Paraffin inbäddade vävnad sektioner i stället för frysförvarade sektioner valdes för trippel immunfärgning. Efter dewaxing och rehydrering tillämpades samma protokoll av färgning tidigare utvecklade för frysförvarade sektioner. CD8+ T celler ligger utanför germinal center och icke-CD8+ T-celler som uttrycker PD-1 är grupperade i germinal center. Mikroskopet förstoringen är 20 x och skalstapeln representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: automatiserad analys av renal cell carcinoma vävnadsprover. Efter vävnad erkännande i ljusa fältet bild (A, skala bar 1 mm), 4 x lupp förstoring låg upplösning imaging i RGB (röd blå grön konventionella fluorescens) används för att markera fälten (B, skala bar 500 µm. Hela Röda torget representerar ett fält. En högupplöst bild (Multispektrala kub fluorescens bild specifika för denna teknik) med 20 x förstoring utförs av mikroskopet Multispektrala visas (C, skala bar 100 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Multispektrala mikroskopi och programvara kopplade analys för generering av en sammansatt bild av en njurcellscancer (20 x lupp förstoring). Hög upplösning raw-bild (A) är en fluorescerande bild av fältet efter Multispektrala skanning av fluorescens filter kuber. Blå signal är AF488, rött är cyanin 5 och grönt är Cyanin3. Kopplingen visar olika färger till exempel gul är en sammanslagning av de tre fluorophores. Denna bild ingår i analysen bildbehandlingsprogram. Spektrala bibliotek integration tillåter en exakt spektrum separation av varje fluorophore och autofluorescens leder till en fluorescerande sammansatt bild (B). Representativa färger väljs av operatören: blå illustrerar cyanin 5 (CD8), Red cyanin 3 (PD-1), grön AF488 (Tim-3). Sammanfoga färger såsom lila används för CD8-PD-1 dubbel positiv. Skalstapeln representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: PD-1 och Tim-3 uttryck på tumör-infiltrera CD8+ T celler på en klarcellig renal cell carcinoma prov analyseras av fluorescens Multispektrala bildteknik (20 x lupp förstoring). (A) CD8 (blått), PD-1 (röd) och Tim-3 (grön) var målat på frysta vävnadssnitt härrör från RCC patienter. Colocalization av dessa tre markörer kan upptäckas genom en sammanslagning av mono-färgning bilderna. Isotypen kontroller utfördes i varje experiment. Skalstapeln representerar 20 µm. gula rutorna identifiera samtidig färgade celler: en Tim-3– PD-1+ CD8 cell och en Tim-3+ PD-1+ CD8-cell. (B) Triple Co färgning för CD8, PD-1, och Tim-3 (samman) visas till vänster med den som anger det gröna är CD8+ T celler tillsammans uttrycker PD-1 och/eller Tim-3. För automatiserad inventering med bild analys programvara, bygger identifiering av cellerna på förekomsten av en nukleär färgning (DAPI); cell segmentering är också baserad på morfometriska egenskaper representerade som röda gränser (mellersta panelen). En algoritm som utbildats av användaren tills concordance med visuella räkna utförs (höger), och efter automatiserade fenotypning, identifierar gröna prickar som CD8+ T celler tillsammans uttrycker PD-1 och Tim-3, röda prickar som CD8+ T celler uttrycker PD-1 utan Tim-3 och blå prickar som CD8+ T celler inte uttrycker PD-1 eller Tim-3. Skalstapeln representerar 20 µm. gula rutan visar PD-1 och/eller Tim-3 uttrycker CD8+ T celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Computing rådata Multispektrala analys. Uppgifterna av greven av varje cell kategori i varje fält (dvs.5 fält/patienten, dvs, 5 .txt-filer) samlas efter bildanalys. Ett R skript kombinerar 5 fält data, endast överväger celler phenotyped med konfidensintervall > 55%. Mikroskopet förstoringen är 20 x och skalstapeln representerar 100 µm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler uttrycker högre nivåer av PD-1 jämfört med PD-1+ Tim-3– CD8+ T celler i njurcellscancer. Intensiteten av PD-1 upptäcks på cellnivå (till vänster) i situ immunofluorescens analys på PD-1+ Tim-3+ och PD-1+ Tim-3– CD8+ T celler. På individnivå (mellersta panelen): resultaten visas för den hela CD8+ T cell delmängder PD-1+ Tim-3+ kontra PD-1+ Tim-3– närvarande på en vävnad avsnitt (dvs, det en patient; Mann-Whitney test). Jämförande analys av genomsnittliga PD-1 intensiteten mättes i en serie av 9 patienter (höger panel) (Wilcoxon test, p-värden lägre än 0,05 ansågs som betydande). Mikroskopet förstoringen är 20 x och skalstapeln representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: PD-L1 och Gal-9 dvs PD-1 och Tim-3 ligander färgning på njurcellscancer. (A) tumör celler identifieras av pan-Keratin färgning. Co färgning av PD-L1 och pan-keratin (en panel) identifierar uttrycket av PD-L1 på tumörceller i 58 patienter ur 87 analyseras. (B) galektinbindande-9 uttrycktes i alla 15 tumörer från RCC patienter analyseras. Positivitet ansågs om minst 10% av cellerna var fläckig för markören analyseras. Isotypen kontroller ingick för varje färgning. Gula rutor representerar positiv tumör (pan-Keratin +) celler för PD-L1 (panel A) eller galektinbindande-9 (panel B). Mikroskopet förstoringen är 20 x och skalstapeln representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

%/CD8+ T-celler PD-1+ PD1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3–
TNM 0,04 0,003 0,22
Furhman 0,01 0,004 0,74
Tumörens storlek 0,08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tabell 1: Samband mellan uttrycket av PD-1 enskilt eller i kombination med Tim-3 på CD8+ T celler och kliniska prognostiska parametrar av RCC patienter: p-värden. Andelen PD-1+, PD-1+ Tim-3+ eller PD-1+ Tim-3– på CD8+ T celler som valts som en kontinuerlig variabel mätt i situ immunofluorescens i kohorten av 87 patienter var korrelerad med olika kliniska parametrar definieras som en binär (TNM, Fuhrman grade, UISS Poäng) eller en kontinuerlig variabel (tumörstorlek). TNM delades in i två grupper: lokaliserad sjukdom (pT1 och pT2) och avancerad sjukdom (pT3, pT4, N+, eller M+). Fuhrman grade definierades som låg (grad I eller II) och hög (klass III eller IV) och UISS Poäng delades in i 3 klasser (0, 1 och 2). P-värden indikerar en signifikant korrelation visas i fetstil.

CD8+ T cell delmängd/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3–
Median (%) 34,7 8,6
Korrelation med PFS P = 0.046 P = 0,8

Tabell 2: Korrelation mellan PD-1 och Tim-3 samtidig uttryck på CD8+ T celler och progression free survival. Två grupper av RCC patienter (n = 87) beroende på andelen PD-1 utan Tim-3 (höger), PD-1 och Tim-3 (vänster) i förhållande till medianen var individualiserad. Sambandet med PFS var gjord med medianen valt som en cut-off. P-värden indikerar en signifikant korrelation visas i fetstil.

Kompletterande Tabell1: buffert sammansättningen av TBS och TBST. TBS används för antikropp mixar och spädningar. För tvättar utförs alla steg med TBS utom de tvättar efter primära antikroppar, där TBST rekommenderas. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande Tabell2: detaljerad antikroppar blanda sammansättning för CD8-PD-1-Tim-3 immunofluorescens färgning. För varje primär, sekundär och tertiär antikropp mixar, ges utspädningen att utföra i motsvarande volym av TBS för en total volym om 1 mL. För en bild är den nödvändiga totala reaktionsvolym 100 µL för en vävnad område 2 cm2. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modifieringar och felsökning:

Den vävnad kvaliteten är en viktig parameter; Det kan enkelt kontrolleras genom hematoxylin och eosin färgning.

En fördel med tekniken är möjligheten att multiplexade infärgning, men för att undvika fluorophore spillover, det rekommenderas för att välja utsläpp våglängder med delta 10 nm minst. Här, eftersom vi hade 4 infärgning inklusive DAPI, valde vi att sprida ut våglängderna (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, cyanin 3:570 nm, cyanin 5:670 nm). Risken för överlappande signaler från olika fluorophores undviks genom att använda programvaran beräkna ren spectrumen av en fluorophore från en blandad utsläpp signal, kombinerat med en automatiserad bildanalys. Mono-färgade glasen också bekräfta frånvaron av överlappning mellan fluorophores och agera som en kompensation för det spektrala biblioteket.

Positivitet för en markör i en cell kan ibland vara svårt att avgöra om färgning/fluorescensen är svag. Den negativa kontrollen som ingår i varje experiment är ett bra sätt att fastställa en tröskel av positivitet.

I kopplat mjukvaran används för att analysera bilder, en scoring steg för att fastställa positivitet i cellen finns, men det bara kan analysera två markörer samtidigt. Eftersom vi kan ha trippel färgning på samma cell (CD8, PD-1 och Tim-3), vi valde det fenotypning steget.

Fenotypning steget kan vara mödosam, särskilt om vilken typ av färgning och bakgrunden är variabel från ett prov till en annan.

Begränsningar av tekniken:

Även om antalet co-infärgning är en fördel jämfört med konventionella fluorescens, går det inte att analysera många färger såsom flödescytometri. Speciellt när colocalization av flera markörer studeras, vara medveten om för känslighet som är lägre jämfört med konfokalmikroskopi (för 20 x lupp förstoring, cirka 0,5 µm kontra 0.1 µm per pixel för confocal, beroende på märket) och Kontrollera för fluorophore spridningseffekter (kritiska steg inom the protokoll, se nedan).

En stor begränsning i tekniken är formatet raw-data. Rådata är txt-filer som kan vara knepigt att använda. Eftersom programvaran ger en .txt-fil per bild med CI för fenotypen, är manuell behandling av 5 filer per patient av en enorm serie mycket arbetskrävande. Bioinformatik specialist krävs för att beräkna alla data i en statistisk programvara.

Betydelse med avseende på befintliga metoder:

Multiplexade färgning analys är lätt möjligheten. Jämfört med flödescytometri, som analyserar färska prover, gör denna teknik en snabb inventering i en reproducerbar metod för annan cell delmängder närvarande i den tumör mikromiljö, i stora kohorter av frysta prover med ett automatiserat förfarande26 ,27. Kunde vi automatiskt räkna infiltrera CD8+ T celler uttrycker PD-1 och samtidig uttrycker Tim-3 eller inte i fastställandet av RCC. Automatiska räkningen undviker flera fördomar som öga trötthet och icke-reproducerbara räkna, och är inte tidskrävande.

Som den stora kohorten studerade på frysta prov, vi hade retrospektiva uppgifterna så vi kunde länka den absoluta antalet eller andelen av CD8+ T cell undergrupper med biologiska parametrar och kliniskt utfall. Eftersom det finns en viktig heterogenitet immun infiltration från en patient till en annan28, innebär detta en fördel jämfört med fluorocytometry som rapporterar endast MFI och andel men inte infiltration betyget.

Fluorescensintensiteten redovisas kvantitativt för varje cell, och i en annan cell fack (membran/cytoplasman/kärnor), kunde vi bedöma nivån av PD-1 färgning av MFI på membranet. Detta representerar en annan intressant verktyg som liknar flödescytometri. Vi fann att den PD-1+ CD8+ T celler som uttrycker Tim-3 hade högre uttryck av PD-1 och var förknippade med en dålig prognos (inverkan på progressionsfri överlevnad). Till vår kunskap är det den första studien med den här metoden som visar en klinisk betydelse av en viss cell delmängd.

Framtida tillämpningar:

Användningsområdet är enormt. Vi betonade också i lung cancer tumörens mikromiljö en annan specifik cell delmängd: vävnad bosatt minnet T celler kallas TRM (CD103+ CD49a+), och de är korrelerade med en bättre total överlevnad21,29 ,30. I ett annat arbete med denna teknik, vårt team fann att PD-L1 var i ökad utsträckning på tumörceller i en undertyp av lungcancer med en Anaplastisk lymfom Kinas (ALK) ombildning, och detta uttryck var korrelerad med CD8+ T infiltrera10. Denna teknik är lämplig för utvärdering av kritiska biologiska parametrar i flera sammanhang och kan representera ett värdefullt verktyg för biomarkör identifiering. Eftersom xy koordinater ges, är det en av de första verktyg för att studera topografi och cell/cell interaktioner med lätthet31.

Kritiska steg i protokollet:

En av de kritiska steg är optimering av samtidig färgningen, vilket kan vara tidskrävande. Valet av en bra antikropp är avgörande, till exempel flera kloner har testats för Tim-3 i förevarande fall. Dessutom kan olika fluorophores för samma markören ge olika resultat så är det viktigt att prova flera kombinationer. Att undersöka färgning specificitet med antikroppar som inte bör reagera tillsammans rekommenderas. Trots möjligheten att analysera flera fluorophores samtidigt, rekommenderas kontroll för spridningseffekter med mono-färgade glasen. Ett annat viktigt steg är fenotypning steg som bygger på användarhandbok Träning att utföra noggrant.

Totalt representerar användningen av denna multiplexade teknik av en skicklig operatör ett elegant verktyg för att analysera flera cell delmängder av de lokala immun infiltrera, som är av betydelse eftersom perifert blodanalys inte kan vara representativ för den lokala tumören miljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex immunonkologiska (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG finansierades av en gemenskap av Fondation ARC. EV och CD finansierades av en gemenskap av APHP (bourse année recherche). ChB finansieras av en gemenskap av Université Sorbonne Paris Cité (contrat doktorander). Författarna vill tacka Bristol Myers Squibb för sin finansiering i detta projekt. Författarna vill tacka Institutionen för patologi av Hospital Européen Georges Pompidou och Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel och Gisèle Legall). Författarna vill tacka histologi plattformen av PARCC, Hospital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

Immunologi fråga 132 Multiplex i situ Multispektral avbildning immunofluorescens-teknik digital bildbehandling njurcellscancer Tim-3 PD-1 tumör mikromiljö checkpoint-hämmare i situ enda cell analys
Multiplexed immunofluorescens analys och kvantifiering av Intratumoral PD-1<sup>+</sup> Tim-3<sup>+</sup> CD8<sup>+</sup> T celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter