Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण और ठहराव के Intratumoral पीडी-1+ टिम-3+ सीडी+ टी कोशिकाओं

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

ट्यूमर microenvironment का अध्ययन शकुन या immunotherapy करने के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया के पूर्वानुमानित मार्क्स की पहचान कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत है, एक अभिनव सीटू प्रतिदीप्ति multispectral इमेजिंग में पर आधारित पद्धति का विश्लेषण और सीडी+ टी कोशिकाओं के स्वचालित रूप से विभिंन उपआबादी गिनती है । यह प्रतिलिपि और विश्वसनीय तकनीक बड़े पलटन विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

प्रतिरक्षा कोशिकाओं ट्यूमर microenvironment के महत्वपूर्ण घटक है और कैंसरजनन के सभी चरणों में ट्यूमर के विकास और विकास को प्रभावित करते हैं । विशेष रूप से, यह अब अच्छी तरह से स्थापित है कि प्रतिरक्षा मानव ट्यूमर में घुसपैठ निदान और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी कर सकते हैं । ट्यूमर microenvironment में प्रतिरक्षा घुसपैठ का विश्लेषण रोगियों के वर्गीकरण और उपचार के लिए प्रतिक्रिया के लिए एक बड़ी चुनौती बन गया है ।

इस तरह के कार्यक्रम सेल मौत प्रोटीन 1 के रूप में निरोधात्मक रिसेप्टर्स की सह-अभिव्यक्ति (PD1; भी CD279 के रूप में जाना जाता है), साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट जुड़े प्रोटीन 4 (CTLA-4), टी सेल Immunoglobulin और प्रोटीन युक्त Mucin-3 (टिम-3; भी CD366 के रूप में जाना जाता है), और लिम्फोसाइट सक्रियण 3 जीन (अंतराल-3; भी CD223 के रूप में जाना), टी सेल थकावट की एक बानगी है । हम सीटू में एक multiparametric विकसित इम्यूनोफ्लोरेसेंस की पहचान करने और सेलुलर स्तर पर इन निरोधात्मक रिसेप्टर्स के सह अभिव्यक्ति की मात्रा को बढ़ाता है. गुर्दे सेल कार्सिनोमा (आरसीसी) के जमे हुए ऊतक के एक पूर्वव्यापी श्रृंखला पर, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित एक प्रतिदीप्ति multispectral इमेजिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि सीडी के सह-अभिव्यक्ति पीडी-1 और टिम-3 में घुसपैठ के ट्यूमर पर+ टी कोशिकाओं आरसीसी में एक गरीब रोग का निदान के साथ संबंधित है । हमारे ज्ञान के लिए, यह पहले अध्ययन का प्रतिनिधित्व करता है कि सीटू प्रौद्योगिकी में इस स्वचालित मल्टीप्लेक्स कुछ नैदानिक प्रासंगिकता हो सकता है ।

Introduction

पिछले कुछ वर्षों में, immunotherapy आरसीसी सहित कई प्रकार के कैंसर के लिए बहुत आशाजनक उपचार के रूप में उभरा है । विशेष रूप से, पीडी-1 और CTLA-4 जैसे निरोधात्मक चौकियों के अवरोधों पर आधारित immunotherapy को चिकित्सीय रूप से प्रभावी1,2,3,4,5, 6. CTLA के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-4, पीडी-1, या कार्यक्रम मौत Ligand 1 (पीडी-L1) पहले से ही कई कैंसर में अनुमोदित कर रहे हैं और रोगियों के 20% से अधिक में लंबे समय तक चलने नैदानिक प्रतिक्रियाओं के लिए नेतृत्व7. फिर भी, नहीं सभी रोगियों के जवाब हैं, उपचार की लागत अधिक है, और इन उपचार विषाक्त कर रहे हैं, संभावित गंभीर स्व-प्रतिरक्षित साइड इफेक्ट की तरह करने के लिए अग्रणी. इसलिए, मौजूदा चुनौती के लिए उन नए immunotherapies के लिए पूर्वानुमान मार्करों की पहचान है । ट्यूमर में उत्परिवर्तन की दर, पीडी-L1 की अभिव्यक्ति, या intratumoral सीडी+ टी सेल घुसपैठ के स्तर को नैदानिक प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी करने के लिए सूचित किया गया है । हालांकि, इस संघ अभी भी नैदानिक अभ्यास में इन नैदानिक के प्रयोग की सिफारिश कमजोर है पीडी-L1 के लिए साथी के लिए परीक्षण के अलावा गैर में Pembrolizumab के प्रशासन से पहले छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) रोगियों8 ,9,1011,12. यह प्रदर्शन किया गया है कि पीडी-1, टिम-3, लैग-3, और CTLA-4 जैसे कई निरोधात्मक रिसेप्टर्स की सह-अभिव्यक्ति, एक सेल थकावट phenotype और प्रतिरोध के लिए प्रेरित करता है13,14,15. चूंकि परिधीय रक्त ट्यूमर microenvironment का प्रतिनिधि नहीं है, यह उच्च ब्याज की है सीटू मेंकोशिकाओं की phenotypic सुविधाओं का विश्लेषण. पीडी-1 और टिम-3 सह एक्सप्रेस टी कोशिकाओं कई संदर्भों में कार्यात्मक बिगड़ा कोशिकाओं को13,16,17जाना जाता है । इस अध्ययन में दो निरोधात्मक रिसेप्टर्स पीडी-1 और टिम-3 पर सीडी+ टी कोशिकाओं की सह-अभिव्यक्ति के शकुन प्रभाव का आकलन किया गया ।

अब तक, सह का अध्ययन ट्यूमर घुसपैठ पर कई मार्करों की अभिव्यक्ति लिम्फोसाइटों (TILs) मुख्य रूप से प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा किया गया है, यह ताजा ट्यूमर पर काम करने के लिए आवश्यक बनाने और इसलिए precluding पूर्वव्यापी विश्लेषण. सीटू धुंधलाing में पारंपरिक के साथ, एक समय में केवल एक धुंधला प्रदर्शन किया जा सकता है, और सेल प्रकार है कि सह मार्करों व्यक्त की विशेषताओं संभव नहीं है । उदाहरण के लिए, पीडी-L1 ट्यूमर microenvironment के कई कोशिका प्रकार द्वारा व्यक्त किया जाता है, यह मुश्किल पारंपरिक immunohistochemistry विश्लेषण द्वारा परिभाषित करने के लिए जो पीडी-L1 एक्सप्रेस कोशिकाओं correlative अध्ययन के लिए और अधिक प्रासंगिक हैं कर रहे हैं. इस कार्य में, हमने आरसीसी में नैदानिक परिणामों के साथ सीडी+ टी-कोशिकाओं को ट्यूमर के द्वारा पीडी-1 और टिम-3 की सह-अभिव्यक्ति को सहसंबंधित करने के लिए कंप्यूटर-काउंटिंग के साथ सीटू multiparametric इम्यूनोफ्लोरेसेंस पद्धति में एक अभिनव विकसित किया । इस तकनीक को एक ही कक्ष स्तर पर विश्लेषण और एक ही समय में एकाधिक मार्करों एक multispectral कैमरा है कि प्रतिबंधित अंतराल पर कब्जा कर सकते हैं का उपयोग करने की संभावना सहित कई फायदे हैं > 10 एनएम लिक्विड क्रिस्टल फिल्टर के माध्यम से18. इसके अलावा, प्रक्रिया स्वचालित है जो एक अंतर ऑपरेटर reproducibility और एक छोटा विश्लेषण मैनुअल तकनीक19की तुलना में सक्षम बनाता है । कैंसर के क्षेत्र में, कई अध्ययनों पीडी-1, पीडी-L1, और मार्केल में सीडी-सेल कार्सिनोमा, फेफड़ों के कैंसर, और सिर और गर्दन कैंसर20,21,22की तरह प्रतिरक्षा अणुओं के कई दाग कायल की सूचना दी, 23. स्वचालित सेल गणना उपयोगकर्ता (phenotyping कदम) द्वारा प्रशिक्षण के साथ संभव है । प्रतिदीप्ति अलग सेल डिब्बों (नाभिक, कोशिका, और झिल्ली) में मापा जाता है ।

यहाँ, ट्यूमर के विभिन्न सबसेट-घुसपैठ सीडी+ टी कोशिकाओं आरसीसी के एक बड़े पलटन में पीडी-1 और/या टिम-3 व्यक्त की गणना की गई और परिणाम नैदानिक गुरुत्वाकर्षण स्कोर और अस्तित्व के मापदंडों के साथ संबंधित थे. यह भी cytometry में की तरह प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) डेटा मतलब के साथ सेलुलर संकल्प पर झिल्ली प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए संभव था. जहां तक हम जानते हैं, यह इस multispectral इमेजिंग आधारित गणना तकनीक का उपयोग कर शकुन परिणाम रिपोर्टिंग पहले अध्ययन का प्रतिनिधित्व करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया था और स्थानीय नैतिकता समिति (CPP इले डी फ्रांस nr. 2012-05-04) द्वारा अनुमोदित किया गया था. सूचित सहमति साथियों में शामिल भागीदार से प्राप्त किया गया था ।

1. ऊतक सामग्री

  1. सर्जरी के दिन आरसीसी टिशू के नमूने लीजिए । कमरे के तापमान (पैथोलॉजी विभाग) में सर्जिकल नमूना संभाल ।
  2. एक सूखी ट्यूब में लगभग ०.५ cm x ०.५ cm x ०.५ cm आकार का एक ट्यूमर का नमूना लीजिए । स्नैप-८० ° c पर तरल नाइट्रोजन और स्टोर में फ्रीज ।
  3. कोट इष्टतम काटने तापमान यौगिक में नमूने । खंड में एक cryostat के साथ नमूनों-20 डिग्री सेल्सियस में 4-6 µm मोटी वर्गों । 12 एच के लिए स्लाइड पर नमूने हवा शुष्क और सीधे उन्हें सुखाना से बचने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान करते हैं ।
  4. एक Hematoxylin और Eosin दाग अनुभाग देखकर नमूना की गुणवत्ता की जांच करें ।

2. सीटू में इम्यूनोफ्लोरेसेंस TILs का दाग

  1. प्रक्रियागत दिशानिर्देश
    1. कमरे के तापमान पर सभी प्रयोगात्मक चरणों का पालन करें ।
    2. सभी चरणों के लिए, Tris बफर खारा के साथ कमजोर पड़ने प्रदर्शन (टीबीएस; सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन के बाद छोड़कर सभी चरणों के लिए टीबीएस में धो प्रदर्शन । बाद के लिए, Tris बफर खारा Tween20 का प्रयोग करें (TBST, सामग्री की तालिकादेखें) । बफ़र संरचना और पुनर्गठन के लिए पूरक तालिका 1देखें ।
    4. एंटीबॉडी गर्मी और धोने के लिए एक धुंधला जार के लिए एक आर्द्रता चैंबर का प्रयोग करें ।
    5. अनुभाग प्रक्रिया के दौरान बाहर सूखी मत देना ।
  2. pretreatment
    1. गल ऊतक नमूना युक्त स्लाइड और ध्यान से एक कागज तौलिया के साथ नमूना चारों ओर स्लाइड सूखी । Delimitate एक hydrophobic बैरियर कलम के साथ ऊतक युक्त प्रतिक्रिया क्षेत्र ( सामग्री की तालिकादेखें). 2 मिनट के लिए सूखी ।
    2. 5 मिनट के लिए १००% एसीटोन में नमूनों को ठीक, 2 मिनट के लिए सूखी, और 10 मिनट के लिए टीबीएस के साथ धो लो ।
  3. संतृप्ति और नाकाबंदी
    1. 10 मिनट के लिए स्लाइड avidin ०.१% की 3 बूंदों के साथ, नल और/या avidin वितरित करने के लिए स्लाइड झटका और हवा के बुलबुले को हटाने, और फिर 3 बायोटिन की बूंदों के साथ 10 मिनट के लिए इलाज ०.०१% ( सामग्री की तालिकादेखें), टेप करें, और/ टीबीएस से धो लें ।
    2. एक एफसी रिसेप्टर्स नाकाबंदी करते हैं । लागू करें १०० µ एल एक 5% की मात्रा/टीबीएस में पतला एक ही मेजबान प्रजातियों से सीरम का उपयोग करें के रूप में माध्यमिक या तृतीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें)); यहां, गधा सीरम इस्तेमाल किया गया था । 30 मिनट के लिए मशीन ।
    3. मशीन के दौरान, संक्षेप में विरोधी सीडी, पीडी-1, और टिम-3 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) स्पिन । पूरक तालिका 2में वर्णित के रूप में टीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण तैयार करें ।
  4. bliss-सीडी, पीडी-1, और टिम-3 के लिए धुंधला
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें । प्रयुक्त एंटीबॉडी (एंटी सीडी, पीडी-1, टिम-3, और उनके इसी माध्यमिक एंटीबॉडी) और उनकी सांद्रता के लिए सामग्री और पूरक तालिका 2 के लिए तालिका देखें ।
    2. नल और/या शेष गधा सीरम झटका (चरण 2.3.2 में जोड़ा) । एक humidified कक्ष में 1 एच के लिए गैर लेबल प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के १०० µ एल के साथ स्लाइड की मशीन ।
    3. इस मशीन के दौरान, संक्षेप में Cyanine 5 विरोधी खरगोश, AF488-विरोधी बकरी, और biotinylated विरोधी माउस एंटीबॉडी स्पिन, और के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण तैयार पूरक तालिका 2में वर्णित है ।
    4. 5 min. Dry स्लाइड्स के लिए TBST में स्लाइड धो लें ।
    5. एक humidified कक्ष में 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल के साथ स्लाइड की मशीन ।
    6. पूरक तालिका 2में बताए गए अनुसार Cy3-streptavidin युक्त तृतीयक एंटीबॉडी का मिश्रण तैयार करें ।
    7. 10 min. Dry स्लाइड्स के लिए टीबीएस में स्लाइड धो लें ।
    8. 30 मिनट के लिए तृतीयक एंटीबॉडी मिश्रण के १०० µ एल के साथ स्लाइड की मशीन ।
    9. 10 min. Dry स्लाइड्स के लिए टीबीएस में स्लाइड धो लें ।
  5. सेल बढ़ते
    1. एक 4 ' में स्लाइड माउंट, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)-बढ़ते मध्यम (१.५ µ g/एमएल DAPI) युक्त coverslip माइक्रोस्कोपी के लिए संगत प्रतिदीप्ति के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, isotype मिलान एंटीबॉडी के साथ एक स्लाइड इसी एंटीबॉडी के रूप में एक ही एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था. इस धुंधला के लिए, हम माउस IgG1, खरगोश आईजीजी, और बकरी आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम मानव hyperplasic tonsil जो परीक्षण मार्करों के लिए सकारात्मक जाना जाता है इस्तेमाल किया, प्रत्येक प्रयोग के लिए । एक ठेठ धुंधला परिणाम में वर्णित है (चित्रा 1). मोनो-सीडी के धुंधला, पीडी-1, और टिम-3 व्यक्तिगत रूप से प्रदर्शन किया जाना चाहिए (एक स्लाइड प्रति धुंधला) एक ही पूर्व उपचार के साथ और DAPI के बिना. किसी भी एंटीबॉडी और केवल DAPI बढ़ते माध्यम के बिना ही प्रयोगात्मक स्थितियों में एक स्लाइड भी प्रदर्शन किया जाना चाहिए । एक स्लाइड किसी भी एंटीबॉडी बिना और DAPI के बिना समान प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग imaged किया जाना चाहिए ।

3. प्रतिदीप्ति विश्लेषण और स्वचालित सेल गणना

  1. स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ छवि अधिग्रहण
    1. कोई प्रोटोकॉल बनाएं ।
      1. स्वचालित माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और प्रतिदीप्ति प्रकाशक को चालू करें ।
      2. मेनू पट्टी में, पर क्लिक करें "फ़ाइल," "प्रोटोकॉल बनाएं," का चयन करें "DAPI," "FITC," और "TRITC."
      3. क्लिक करें "अगला," "ऊतक अनुभाग," और क्लिक करें "अगला," "प्रोटोकॉल नाम." एक नाम चुनें, उदाहरण के लिए, "सीडी-पीडी-1-टिम-3," क्लिक करें "अगला," और "सहेजें."
      4. किसी स्लाइड को मैंयुअल रूप से स्टेज पर रखें ।
      5. मेनू पट्टी में, "सेटअप", "सेटिंग" क्लिक करें । नई विंडो में "होम जेड सेट करें" क्लिक करे ।
      6. एक सीडी, पीडी-1 और टिम-3 ट्रिपल-DAPI नमूना के साथ सना हुआ एक सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड के साथ जोखिम समय समायोजित करें ।
      7. नियंत्रण पट्टी में क्लिक करें "एक्सपोजर सेट."
      8. एक पर्याप्त लेकिन नहीं संतृप्त संकेत प्राप्त होता है जब तक प्रत्येक फिल्टर के लिए जोखिम समय समायोजित करें ।
      9. मोनोक्रोम इमेजिंग के लिए, निम्न कार्य करें:
      10. अधिग्रहण चुनें और ' ऑटो फोकस ' के तहत DAPI फ़िल्टर चुनें.
      11. "स्कैन क्षेत्र सीमा" में, उद्देश्य स्लाइड के ऊपरी बाएँ कोने पर ऊपरी ले जाएँ । "मार्क" पर क्लिक करें । निचले सही कोने के लिए एक ही मत करो ।
        नोट: यह चरण 4x पर कम पावर इमेजिंग (LP इमेजिंग) के क्षेत्र delimitates; ध्यान रखें कि मार्क को अच्छी तरह से लगाएं ताकि सीरीज के सभी नमूनों को चारों ओर से घेर सके ।
      12. उच्च पावर (HP) इमेजिंग के लिए, निंन कार्य:
      13. ' ' DAPI ' ' के अंतर्गत, चुनें ।
      14. ' अधिग्रहण ' बैंड के अंतर्गत, "DAPI", "FITC", "Cy3", और "Cy5" चुनें. "ठीक" क्लिक करें । मेनू पट्टी पर क्लिक करें "फ़ाइल", "प्रोटोकॉल सहेजें".
    2. स्लाइड स्कैन करें ।
      1. मेनू पट्टी से "फ़ाइल", "लोड प्रोटोकॉल" पर क्लिक करके प्रोटोकॉल लोड । "Start" पर क्लिक करें ।
      2. ' लैब आईडी ' दर्ज करें (छवि भंडारण के लिए फ़ोल्डर स्थान) । स्लाइड पहचानने के लिए स्लाइड ID दर्ज करें । "अगला" क्लिक करें ।
      3. क्लिक करें "मोनोक्रोम इमेजिंग" (उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश के तहत पूरी स्लाइड को स्कैन और एक 4x उद्देश्य का उपयोग अनुक्रमिक छवियों को प्राप्त करने के लिए) ।
        नोट: यह स्लाइड का एक ग्रेस्केल ओवरव्यू बनाता है ।
      4. "नमूना खोजें" क्लिक करें । कम रिज़ॉल्यूशन (4x) पर स्कैन किए जाने वाले ऊतक के क्षेत्र का चयन करें: ' Ctrl ' कुंजी दबाए रखें और फ़ील्ड (चित्र 2a) का चयन करने या अचयनित करने के लिए कर्सर का उपयोग करके किसी फ़ील्ड पर क्लिक करें ।
      5. प्रत्येक फ़ील्ड के फ्लोरोसेंट लाल नीली हरी छवि प्राप्ति के लिए "LP इमेजिंग" (4x इमेजिंग) पर क्लिक करें ।
      6. HP फ़ील्ड चयन के लिए, ' Ctrl ' कुंजी को दबाए रखें और कर्सर का उपयोग करके फ़ील्ड पर क्लिक करें जो ऊतकों के उस क्षेत्र के अनुरूप चुनें या अचयनित करें जो उच्च रिज़ॉल्यूशन (20x) पर स्कैन किए जाएंगे । 5 फ़ील्ड्स (चित्र 2 बी) का चयन करें ।
      7. प्रत्येक फ़ील्ड के multispectral छवि प्राप्ति के लिए "HP इमेजिंग" (20x इमेजिंग) पर क्लिक करें (चित्र 2c) ।
      8. LabID में शुरुआत में चयनित फ़ोल्डर में छवियां संग्रहीत करने के लिए "डेटा संग्रहण" क्लिक करें ।
        नोट: प्रक्रिया संक्षेप में है और चित्रा 2में सचित्र । प्रत्येक चरण (ऊतक का पता लगाने, क्षेत्र चयन) के लिए एक एल्गोरिथ्म वृद्धि और एक पूरी स्वचालित स्कैन प्रक्रिया के लिए उपयोगकर्ता द्वारा प्रशिक्षित किया जा सकता है ।
  2. प्रतिदीप्ति छवि विश्लेषण और स्वचालित सेल युग्मित विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ गिनती
    1. वर्णक्रमीय पुस्तकालय का निर्माण ।
      1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें ।
      2. बाएँ फलक पर, खुला "पुस्तकालयों का निर्माण". ' लोड छवि ' के तहत, "ब्राउज़ करें" पर क्लिक और एक मोनो-सना हुआ छवि चुनें (उदा., सीडी/Cyanine 5) ।
      3. fluorophore का चयन करें, (उदा, Cyanine 5) । "निकालें" क्लिक करें । लाइब्रेरी में संग्रहीत करने के लिए "सहेजें" क्लिक करें । "सहेजें" पर क्लिक करें.
      4. पीडी-1, टिम-3, और DAPI मोनो-सना स्लाइड के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ ताकि ब्याज की प्रत्येक fluorophore के स्पेक्ट्रम एकीकृत करने के लिए.
        नोट: वर्णक्रमीय पुस्तकालय के निर्माण प्रत्येक fluorophore विशिष्ट ऊतक (यहाँ, गुर्दे) के लिए इस्तेमाल के लिए स्पेक्ट्रम को एकीकृत करता है, लेकिन "सिंथेटिक" पुस्तकालयों है कि पहले से ही मौजूद इस्तेमाल किया जा सकता है । autofluorescence स्पेक्ट्रम कड़ाई से ऊतक के सापेक्ष है के रूप में, यह परियोजना के प्रति एक ऑटो प्रतिदीप्ति और वर्णक्रमीय पुस्तकालय प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. कोई नया प्रोजेक्ट बनाएं ।
      1. मेनू पट्टी से, "फ़ाइल", "नया प्रोजेक्ट" क्लिक करें । ' सुविधा ढूंढें ' टैब में, "कक्ष विभाजन" का चयन करें । ' Phenotyping ' टैब में, "Phenotyping" का चयन करें । "बनाएं" पर क्लिक करें ।
      2. परियोजना में प्रतिनिधि छवियों को एकीकृत ।
        1. ' फ़ाइल ' टैब में, "ओपन इमेज" पर क्लिक करें । पूरी श्रृंखला के 10 से 30 प्रतिनिधि छवियां चुनें । autofluorescence को निकालने के लिए गैर-धुंधला स्लाइड जोड़ें । दाएं फलक पर: लायब्रेरी स्रोत का चयन करें । fluorophore का चयन करें और पहले से बनाया वर्णक्रमीय पुस्तकालय के लिए इसी से उन लोगों को चुनें ।
      3. टिशू autofluorescence निकालने के लिए, "AF बटन" पर क्लिक करें और फिर खाली स्लाइड पर autofluorescence के क्षेत्र का चयन करे ।
      4. छवि उपचार और समग्र छवि पीढ़ी ।
        1. मिश्रित छवि (चित्र 3) को जनरेट करने के लिए प्रतिदीप्ति लाइब्रेरी और autofluorescence स्पेक्ट्रा को एकीकृत करने के लिए "सभी तैयार करें" पर क्लिक करे । ' देखने के संपादक ' पैनल खोलने के लिए ' आंख ' आइकन पर क्लिक करें और प्रदर्शित डेटा का चयन करें: मार्करों सीडी, पीडी-1, टिम-3, और DAPI का चयन करें । autofluorescence निकालें । सॉफ्टवेयर द्वारा प्रस्तुत चरणों का पालन करें ।
      5. खंड कोशिकाओं ।
        1. कोशिकाओं खंड करने के लिए, ' डिब्बे ' में, "नाभिक" और "झिल्ली" का चयन करें । "नाभिक" टैब में, DAPI को परमाणु counterstain के रूप में सेट करें ।
        2. ' अधिकतम और न्यूनतम आकार (पिक्सल) ' टैब में, क्रमशः न्यूनतम और अधिकतम आकार के रूप में "४०" और "१७६" दर्ज करें । ' न्यूनतम ' संकेत के लिए, सेट "०.१३". "विभाजन" टैब में, सेट "२.६०" । "नाभिक" टैब में, "०.८१" सेट करें । का चयन करें "खंड सहायता के लिए झिल्ली संकेत का प्रयोग करें" ।
        3. स्क्रीन के निचले भाग पर "सेगमेंट कक्ष" पर क्लिक करें. नाभिक और कोशिकाओं के झिल्ली के विभाजन की जाँच करें और यह कोशिकाओं के DAPI और झिल्ली प्रतिदीप्ति से मेल नहीं खाता है, तो विभिन्न मापदंडों के साथ पुनः प्रयास.
          नोट: सॉफ्टवेयर परमाणु DAPI धुंधला और सेल आकार पर आधारित के साथ कोशिकाओं को पहचानता है । प्रोजेक्ट के अनुसार कक्ष पैरामीटर्स (आकार, विभाजन, पिक्सेल) समायोजित करें ।
      6. कोशिकाओं को Phenotype ।
        1. ' Phenotype ' टैब में, "जोड़ें" क्लिक करें । सेल phenotype श्रेणियां बनाएं: सीडी (ब्लू डॉट)/CD8-PD-1 (लाल बिंदी)/CD8-PD-1-Tim-3 (ग्रीन डॉट)/other (ब्लैक डॉट) (चित्र 4) ।
        2. प्रत्येक श्रेणी के कक्षों के 5 से अधिक उदाहरणों का चयन करें । "ट्रेन वर्गीकारक" पर क्लिक करें ।
          नोट: यह सॉफ्टवेयर द्वारा एक सांख्यिकीय वर्गीकरण एल्गोरिथ्म उत्पंन करता है ।
        3. प्रत्येक कक्ष के Phenotype प्राप्त करने के लिए "Phenotype सभी" क्लिक करें ।
          नोट: सॉफ्टवेयर एक विश्वास अंतराल (CI) सटीकता के साथ एक सेल के phenotype देता है ।
        4. नेत्र और स्वचालित गणना के बीच अंतर है जब तक सॉफ्टवेयर प्रशिक्षण द्वारा एल्गोरिथ्म में सुधार (त्रुटि < 5%) । एक CI है कि ब्याज की कोशिकाओं के लिए स्वीकार्य है चुनें ।
          नोट: हम के आधार पर प्रशिक्षण बनाने के लिए चुना ५५% CI के रूप में स्वीकार्य ।
      7. एल्गोरिथ्म और प्रोजेक्ट को सहेजें ।
      8. के अंतर्गत ' फ़ाइल ' का चयन करें "परियोजना" । इसे नाम और क्लिक करें "सहेजें" ।
    3. श्रृंखला के बैच विश्लेषण करते हैं ।
      1. "बैच विश्लेषण" का चयन करें । प्रोजेक्ट का चयन करें । विश्लेषण करने के लिए छवियां जोड़ें । डेटा के लिए संग्रहण के किसी फ़ोल्डर का चयन करें । क्लिक करें "भागो" । समग्र छवि की गुणवत्ता की जांच करें । श्रृंखला के सभी चित्रों के लिए phenotyping सत्यापित करें ।
        नोट: युग्मित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर सभी कोशिका डिब्बों (झिल्ली/कोशिका/नाभिक) संकेतों को एकीकृत करता है । phenotyping कदम महत्वपूर्ण है हालांकि एल्गोरिथ्म के प्रशिक्षण एक समय लेने वाला कदम हो सकता है । प्रत्येक छवि के सभी डेटा एक. txt फ़ाइल में हैं । एक सेल के सभी डेटा (विशेष रूप से इसके CI के साथ दिया phenotype) एक पंक्ति में हैं । प्रत्येक स्लाइड के लिए, छवि प्राप्ति और अनुवर्ती गणना 5 फ़ील्ड्स पर की गई थी ।
  3. कच्चे डेटा और स्वचालित सेल गणना की पीढ़ी के एकीकरण
    1. किसी सांख्यिकीय प्रोग्राम के साथ डेटा की गणना ।
      1. 5 5 क्षेत्रों के लिए इसी छवियों से सभी डेटा की गणना 1 रोगी के लिए विश्लेषण किया । एक सांख्यिकीय मंच का प्रयोग करें, और एक अनुभवी सांख्यिकीविद्, डेटा प्रबंधक, या डेटा वैज्ञानिक विश्लेषण करते हैं । एक स्क्रिप्ट है कि स्वचालित रूप से उनके phenotype के आधार पर कोशिकाओं गिनती बनाएं, CI > ५५% का चयन ।
      2. श्रृंखला की सभी. txt फ़ाइलों को एक ही फ़ोल्डर में रखें ।
    2. डेटा निकालें ।
      1. सभी. txt फ़ाइलों को एक फ़ोल्डर में रखें । चलाएं स्वत: 3.3.1 चरण में निर्मित स्क्रिप्ट । R स्क्रिप्ट द्वारा जेनरेट की गई आउटपुट. csv फ़ाइल खोलें । xl स्वरूप के रूप में सहेजें । आउटपुट प्रत्येक रोगी के लिए प्रत्येक phenotype (यानी, सीडी अकेले, सीडी-पीडी-1, सीडी-पीडी-1-टिम-3) के लिए कोशिकाओं की संख्या इकट्ठा ।
      2. प्रति फ़ील्ड प्रत्येक रोगी के लिए कक्षों की औसत संख्या परिकलित करें: प्रति फ़ील्ड प्रत्येक रोगी के लिए कक्षों की संख्या को सामान्य करने के लिए फ़ील्ड्स की संख्या (अर्थात, 5) के अनुसार कक्षों की संख्या को विभाजित करें ।
      3. कुल सीडी+ t कोशिकाओं के बीच में पीडी-1+ कोशिकाओं के प्रतिशत और पीडी-1+ टिम-3+ कोशिकाओं के बीच सीडी+ टी कोशिकाओं की गणना । इस चरण के सारांश के लिए चित्र 5 देखें ।
        नोट: R भाषा (या पसंद के अंय प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर) को सही ढंग से बनाने और आदेशों को क्रियांवित करने की आवश्यकता है, और इसलिए एक अनुभवी उपयोगकर्ता या सांख्यिकीविद्/ R प्रोग्राम एक ही रोगी के डेटा की गणना कर सकते हैं, लेकिन एक रोगी के 5. txt फ़ाइलों का नाम एक समान शुरुआत है, एक अद्वितीय रोगी पहचानकर्ता के लिए इसी होना चाहिए.
  4. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।
    2. एक सांख्यिकीविद् की मदद से उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।
      1. दो सेल phenotypes के बीच पीडी-1 MFI की तुलना के लिए गैर पैरामीट्रिक Wilcoxon के हस्ताक्षरित रैंक परीक्षणों का उपयोग करें (चित्रा 6) । एक पियरसन की ची चुकता परीक्षण के साथ covariate और ऊतकीय विशेषताओं को सहसंबंधी बनाना ।
      2. एक कापलान-Meier विधि का उपयोग करने के लिए प्रगति मुक्त अस्तित्व का अनुमान है, और कॉक्स प्रतिगमन मॉडल इस तरह के समग्र अस्तित्व और रोग मुक्त अस्तित्व के रूप में समय के लिए घटना के परिणामों पर covariate प्रभाव का अनुमान है ।
      3. पर विचार करें p-मान के रूप में महत्वपूर्ण ०.०५ से कम है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सामांय प्रोटोकॉल का उपयोग ऊपर वर्णित है, हम intratumoral सीडी+ टी कोशिकाओं सह-व्यक्त निरोधात्मक रिसेप्टर्स पीडी-1 और टिम-3 आरसीसी के साथ रोगियों से जमे हुए ऊतकों में, और नैदानिक परिणामों के साथ सहसंबंधी बनाना25का उद्देश्य ।

सीडी/पीडी-1/टिम-3 धुंधला का अनुकूलन:

एंटीबॉडी की विभिन्न प्रजातियों (माउस, खरगोश और बकरी, सामग्री की तालिकादेखें) विभिन्न एंटीबॉडी के बीच परस्पर प्रतिक्रिया से बचने के लिए चुना गया था. प्रोटोकॉल एक tonsil, जो एक संगठित लसीकावत् ऊतक है पर मान्य किया गया था. पीडी-1 धुंधला कीटाणु केंद्रों में पाया जा सकता है (चित्रा 1), जबकि सीडी और टिम-3 धुंधला कीटाणु केंद्रों के आसपास मौजूद हैं । इस ठेठ धुंधला के अवलोकन इस प्रोटोकॉल की पुष्टि की । सना को भी प् याज (किडनी) के टिशू पर मान्य किया गया ।

प्राथमिक एंटीबॉडी के संकेत के अभाव उनके गैर इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन (नहीं दिखाया डेटा) की पुष्टि की थी । सही प्रतिदीप्ति धुंधला विश्लेषण करने के लिए और विशिष्ट वर्णक्रमीय पुस्तकालयों बनाने के लिए, व्यक्तिगत स्लाइड अकेले ब्याज (गुर्दे) के ऊतकों में प्रत्येक मार्कर (सीडी, पीडी-1, टिम-3, या DAPI) के साथ दाग थे. एक ही स्थिति में एक गैर दाग स्लाइड ऊतक के autofluorescence एक्सट्रपलेशन करने के लिए आवश्यक है । धुंधला स्वचालित माइक्रोस्कोप, जो अलग fluorophores के स्पेक्ट्रम एकीकृत द्वारा विश्लेषण किया गया था; प्रत्येक मार्कर अच्छी तरह से भेदभाव किया गया था और मार्करों की कोई ओवरलैप (चित्रा 3) मनाया गया था ।

सीडी की मात्रात्मक और गुणात्मक विशेषताएं + ८७ आरसीसी मरीजों में घुसपैठ:

परिणाम से पता चला है कि सीडी के approximatively आधा+ टी कोशिकाओं पीडी-1 एक्सप्रेस (५३.९% मतलब है; SE: ३०.४९%) और के बारे में एक तिहाई थे डबल पॉजिटिव पीडी-1+ टिम-3+ (मतलब ३८.१६%; SE: २८.११%). सीडी+ T कक्षों (डेटा नहीं दिखाया गया है) से कम 3% में पीडी-1 व्यंजक के बिना टिम-3 व्यंजक का पता लगाया गया । सीडी+ टी सेल उपआबादी की मतलब संख्या थे: कुल सीडी+ टी कोशिकाओं ११६.५ (एसई: २१६), पीडी-1+ सीडी+टी सेल ८९.३२ (एसई: १९१.८), पीडी-1+ टिम-3+ ६६.९ (एसई: १४३), और पीडी-1+ टिम-3- सीडी + T कक्ष २२.३८ (SE: ५७.५) प्रति फ़ील्ड । सीडी+ टी कोशिकाओं पर पीडी-1+ टिम-3+ के प्रतिशत के साथ intratumoral सीडी+ टी कोशिकाओं की कुल संख्या सकारात्मक रूप से संबंधित थी ।

सीडी के कार्यात्मक लक्षण वर्णन + टी कोशिकाओं उनके Phenotype पीडी-1 और टिम-3 पर निर्भर करता है:

पीडी-1 अभिव्यक्ति स्तर टी सेल थकावट के साथ संबंधित किया जा करने के लिए जाना जाता है तो हम अगले टिम-3 अभिव्यक्ति की स्थिति के अनुसार सीडी+ टी कोशिकाओं पर पीडी-1 अभिव्यक्ति उपाय करने के उद्देश्य से. के रूप में अलग fluorochromes के मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता सेलुलर स्तर पर सूचित किया है, रोगियों की एक छोटी सी श्रृंखला के सेलुलर डेटा के लिए मैंयुअल रूप से विश्लेषण कर रहे थे: परिणाम कक्ष उपप्रकार के साथ पीडी-1 झिल्ली MFI का एक सहसंबंध दिखाया । पीडी-1 फ्लोरोसेंट तीव्रता (चित्रा 6) पीडी-1+ टिम-3+ बनाम पीडी पर सेलुलर स्तर पर मापा गया था-1+ टिम-3- सीडी+ टी कोशिकाओं (एक पैनल) और इन विभिंन एकीकरण के बाद व्यक्तिगत रोगी स्तर पर एक ऊतक अनुभाग पर सेल संकेतों । 9 रोगियों की एक श्रृंखला में, Wilcoxon युग्मित परीक्षण के साथ एक तुलना में पाया गया कि पीडी-1 MFI अधिक है जब टिम-3 सह व्यक्त है, टिम की कार्यात्मक प्रासंगिकता-3 अभिव्यक्ति (बी पैनल) मजबूत ।

कई सह-धुंधला से ट्यूमर कोशिकाओं की सतह पर पीडी-1 और टिम-3 लाइगैंडों की अभिव्यक्ति:

के रूप में टी सेल थकावट रिसेप्टर के माध्यम से मध्यस्थता/ligand बातचीत, हम पीडी-1 और टिम-3 लाइगैंडों की अभिव्यक्ति का आकलन (पीडी-L1 और Galectin-9 (लड़की-9), क्रमशः) गुर्दे ट्यूमर की पहचान की कोशिकाओं पर पान-केरातिन धुंधलाना द्वारा पहचाना । धनात्मकता को मार्कर व्यक्त करने वाले ट्यूमर कोशिकाओं के 10% की कट-ऑफ के रूप में परिभाषित किया गया है: (i) ८७ रोगियों में से ५८ (६६%) पीडी-L1 के लिए सकारात्मक थे; (ii) सभी 15 ट्यूमर का विश्लेषण किया गया Gal-9 (चित्रा 7A, बी) के लिए सकारात्मक थे ।

सह के नैदानिक प्रभाव-टिम की अभिव्यक्ति-3 + पीडी-1 + सीडी पर + T कक्ष:

ट्यूमर नोड मेटास्टेसिस (टीएनएम) स्कोरिंग, Fuhrman ग्रेड, ट्यूमर का आकार, और UISS स्कोर ऊतकीय विशेषताओं (UISS के लिए नैदानिक स्कोर के साथ संयुक्त) प्राथमिक आरसीसी का पूर्वानुमान मूल्य को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इन सभी मापदंडों (तालिका 1) के साथ पीडी-1 और टिम-3 (पर केवल पीडी-1 के बिना व्यक्त नहीं बल्कि)-एक ट्यूमर-घुसपैठ सीडी+ टी कोशिकाओं की संख्या और/या प्रतिशत के बीच एक सकारात्मक संबंध मनाया गया । इस अधिक अपमानजनक phenotype के साथ, सीडी+ टी कोशिकाओं के साथ आरसीसी रोगियों-व्यक्त पीडी-1 और टिम-3 औसत प्रतिशत से ऊपर (३४.७) और पतन की संभावना थे (पी = ०.०४६; एचआर २.९; ९५% CI: 1.02-8.21) । इस सहसंबंध सीडी+ टी कोशिकाओं पर स्वतंत्र रूप से टिम-3 स्थिति (तालिका 2) के पीडी-1 के प्रतिशत के साथ नहीं देखा गया था । एक सहसंबंध भी सीडी+ टी कोशिकाओं के प्रतिशत के बीच प्रदर्शन किया पीडी-1 और टिम-3 और ३६ महीने समग्र जीवित रहने की दर व्यक्त (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हम भी tonsil तेल के ऊतकों (चित्रा 1) पर ट्रिपल immunostaining की पुष्टि की ।

Figure 1
चित्रा 1: सीडी-पीडी-1-टिम-3 एक tonsil तेल-एम्बेडेड ऊतक पर immunostaining. cryopreserved वर्गों के बजाय आयल एंबेडेड ऊतक वर्गों ट्रिपल immunostaining के लिए चयनित किया गया । एपिलेशन और निर्जलीकरण के बाद, पहले से cryopreserved वर्गों के लिए विकसित धुंधला का एक ही प्रोटोकॉल लागू किया गया था । सीडी+ टी कोशिकाओं कीटाणु केंद्र के बाहर स्थित हैं और पीडी-1 एक्सप्रेस गैर-सीडी+ टी कोशिकाओं कीटाणु केंद्र में संकुल रहे हैं । माइक्रोस्कोप आवर्धन 20x है और स्केल बार 20 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गुर्दे सेल कार्सिनोमा ऊतक नमूनों की स्वचालित विश्लेषण । उज्ज्वल क्षेत्र छवि (A, स्केल बार 1 मिमी) में ऊतक मांयता के बाद, 4x माइक्रोस्कोप इज़ाफ़ा कम रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग आरजीबी (लाल नीली हरी पारंपरिक प्रतिदीप्ति) में खेतों (बी, स्केल बार ५०० µm का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पूर्ण लाल चौक एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । एक उच्च संकल्प छवि (multispectral घन प्रतिदीप्ति इस तकनीक के लिए विशिष्ट छवि) के साथ 20x आवर्धन multispectral माइक्रोस्कोप द्वारा प्रदर्शन पर दिखाया गया है (ग, स्केल बार १०० µm) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Multispectral माइक्रोस्कोपी और एक गुर्दे सेल कार्सिनोमा (20x माइक्रोस्कोप इज़ाफ़ा) की एक समग्र छवि की पीढ़ी के लिए युग्मित विश्लेषण सॉफ्टवेयर । उच्च संकल्प रॉ छवि (एक) प्रतिदीप्ति फ़िल्टर क्यूब्स द्वारा स्कैनिंग multispectral के बाद क्षेत्र के एक फ्लोरोसेंट छवि है । नीले संकेत AF488 है, लाल Cyanine 5 है, और हरे रंग की Cyanin3 है । मर्ज अलग रंग दिखाता है उदाहरण के लिए, पीला तीन fluorophores की मर्जी है । छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में इस छवि को शामिल किया गया है । वर्णक्रमीय पुस्तकालय एकीकरण प्रत्येक fluorophore और autofluorescence एक फ्लोरोसेंट समग्र छवि (ख) के लिए अग्रणी की एक सटीक स्पेक्ट्रम जुदाई की अनुमति देता है । प्रतिनिधि रंग ऑपरेटर द्वारा चुना जाता है: ब्लू Cyanine 5 (सीडी), रेड Cyanine 3 (पीडी-1), ग्रीन AF488 (टिम-3) दिखाता है । सीडी-पीडी-1 डबल सकारात्मक के लिए बैंगनी जैसे मिक्स रंग विलय का प्रयोग किया जाता है । स्केल बार 20 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीडी-1 और टिम-3 ट्यूमर पर अभिव्यक्ति-घुसपैठ सीडी+ एक स्पष्ट सेल गुर्दे सेल कार्सिनोमा नमूना पर टी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति multispectral इमेजिंग प्रौद्योगिकी (20x माइक्रोस्कोप आवर्धन) द्वारा विश्लेषण किया । (क) सीडी (नीला), पीडी-१ (लाल) और टिम-३ (ग्रीन) आरसीसी रोगियों से प्राप्त जमे हुए ऊतक वर्गों पर दाग थे. इन तीन मार्करों के Colocalization मोनो-धुंधला चित्रों का विलय करके पता लगाया जा सकता है । प्रत्येक प्रयोग में Isotype नियंत्रण किया गया । स्केल बार 20 µm का प्रतिनिधित्व करता है । पीले बक्से सह दाग कोशिकाओं की पहचान: एक टिम-3- पीडी-1+ सीडी सेल और एक टिम-3+ पीडी-1+ सीडी सेल । (ख) ट्रिपल सह-सीडी, पीडी-1, और टिम-3 (विलय) के लिए दाग बॉक्स के साथ छोड़ दिया पर दिखाया गया है कि हरे रंग की सीडी+ टी कोशिकाओं सह व्यक्त पीडी-1 और/या टिम-3 । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित गिनती के लिए, कोशिकाओं की पहचान एक परमाणु दाग (DAPI) की उपस्थिति पर निर्भर करता है; सेल फॉल्ट भी लाल सीमाओं (मध्य पैनल) के रूप में प्रतिनिधित्व morphometric विशेषताओं पर आधारित है । एक एल्गोरिथ्म दृश्य गिनती के साथ सामंजस्य तक उपयोगकर्ता द्वारा प्रशिक्षित (सही) किया जाता है, और स्वचालित phenotyping के बाद, सीडी+ टी कोशिकाओं के रूप में हरी डॉट्स की पहचान करता है पीडी-1 और टिम-3, सीडी+ टी कोशिकाओं के रूप में लाल डॉट्स व्यक्त पीडी-1 के बिना टिम 3, और सीडी+ टी कोशिकाओं के रूप में ब्लू डॉट्स पीडी-1 या टिम-3 व्यक्त नहीं । स्केल बार 20 µm. पीला बॉक्स का प्रतिनिधित्व करता है पीडी-1 और/या टिम-3 व्यक्त सीडी+ टी कोशिकाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: multispectral विश्लेषण के कच्चे डेटा कंप्यूटिंग । प्रत्येक क्षेत्र में मौजूद प्रत्येक कक्ष श्रेणी की गणना का डेटा (अर्थात, 5 फ़ील्ड्स/रोगी, अर्थात, 5. txt फ़ाइलें) छवि विश्लेषण के बाद एकत्र किए जाते हैं । एक आर स्क्रिप्ट 5 क्षेत्रों डेटा को जोड़ती है, केवल एक विश्वास अंतराल के साथ phenotyped कोशिकाओं पर विचार > ५५% । माइक्रोस्कोप आवर्धन 20x है और स्केल बार १०० µm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: पीडी-1+ टिम-3+ सीडी+ टी कोशिकाओं गुर्दे सेल कार्सिनोमा में पीडी-1+ टिम-3- सीडी+ टी कोशिकाओं की तुलना में पीडी-1 के उच्च स्तर एक्सप्रेस । पीडी-1+ टिम-3+ और पीडी-1+ टिम-3- सीडी+ टी सेल पर सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस एनालिसिस में द्वारा सेलुलर लेवल (बांए पैनल) पर pd-1 की तीव्रता का पता लगाया है । व्यक्तिगत स्तर पर (मध्य पैनल): परिणाम पूरे सीडी के लिए दिखाए गए हैं+ टी सेल उपसेट पीडी-1+ टिम-3+ बनाम पीडी-1+ टिम-3- एक ऊतक अनुभाग पर मौजूद (यानी, एक मरीज; मान Whitney test). मतलब पीडी-1 तीव्रता का तुलनात्मक विश्लेषण 9 रोगियों की एक श्रृंखला में मापा गया था (सही पैनल) (Wilcoxon टेस्ट, पी-०.०५ से कम मूल्यों महत्वपूर्ण के रूप में माना जाता था). माइक्रोस्कोप आवर्धन 20x है और स्केल बार 10 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: पीडी-L1 और लड़की-9 यानी पीडी-1 और टिम-3 लाइगैंडों गुर्दे सेल कार्सिनोमा पर धुंधला । (क) ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान पान-केरातिन के दाग से होती है. पीडी-L1 और पैन-केरातिन (एक पैनल) के सह दाग ८७ से बाहर ५८ रोगियों में ट्यूमर कोशिकाओं पर पीडी-L1 की अभिव्यक्ति की पहचान करता है विश्लेषण किया । (ख) Galectin-९ में आरसीसी रोगियों से १५ ट्यूमर का विश्लेषण सभी में व्यक्त किया गया. धनात्मकता पर विचार किया गया था अगर कोशिकाओं के ंयूनतम 10% मार्कर के लिए दाग थे विश्लेषण । Isotype नियंत्रण प्रत्येक धुंधला के लिए शामिल थे । पीले बक्से सकारात्मक ट्यूमर (पैन-केरातिन +) पीडी-L1 (पैनल ए) या Galectin-9 (पैनल बी) के लिए कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । माइक्रोस्कोप आवर्धन 20x है और स्केल बार 20 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

%/CD8+ T कक्ष पीडी-1+ PD1+ टट-3+ पीडी-1+ टिम-3-
टीएनएम ०.०४ ०.००३ ०.२२
Furhman ०.०१ ०.००४ ०.७४
ट्यूमर का आकार ०.०८ ०.०१ ०.३७
UISS ०.०१ ०.०१ ०.६३

तालिका 1: अकेले पीडी-1 की अभिव्यक्ति के बीच सहसंबंध या सीडी+ T कोशिकाओं और आरसीसी रोगियों के नैदानिक शकुन मापदंडों पर टिम-3 के साथ संयुक्त: p-मान । पीडी-1 का प्रतिशत+, पीडी-1+ टिम-3+ या पीडी-1+ टिम-3- सीडी+ टी कोशिकाओं पर एक सतत चर के रूप में चयनित ८७ रोगियों के पलटन में सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस में द्वारा मापा गया था संबंधित था एक द्विआधारी (टीएनएम, Fuhrman ग्रेड, UISS स्कोर) या एक सतत चर (ट्यूमर आकार) के रूप में परिभाषित विभिन्न नैदानिक मापदंडों के साथ. टीएनएम दो समूहों में विभाजित किया गया था: स्थानीयकृत रोग (pT1 और पीटी) और उन्नत रोग (pT3, pT4, एन+, या एम+). Fuhrman ग्रेड कम (ग्रेड मैं या द्वितीय) और उच्च (ग्रेड III या IV) और UISS स्कोर 3 वर्गों (0, 1, और 2) में विभाजित किया गया था के रूप में परिभाषित किया गया था । P-एक महत्वपूर्ण सहसंबंध इंगित करने वाले मान बोल्ड में दिखाए जाते हैं ।

सीडी+ T कक्ष सबसेट/सीडी पीडी-1+ टिम-3+ पीडी-1+ टिम-3-
माध्य (%) ३४.७ ८.६
PFS के साथ सहसंबंध P = ०.०४६ P = ०.८

तालिका 2: पीडी-1 और टिम के बीच सहसंबंध-3 सह सीडी पर अभिव्यक्ति+ टी कोशिकाओं और प्रगति मुक्त अस्तित्व । आरसीसी के मरीजों के दो समूह (n = ८७) बिना पीडी-1 के प्रतिशत के आधार पर टिम-3 (दाएं), पीडी-1 और टिम-3 (बाएं) माध्य के सापेक्ष व्यक्तिगत थे । PFS के साथ संबंध एक कट बंद के रूप में चयनित औसत के साथ किया गया था । P-एक महत्वपूर्ण सहसंबंध इंगित करने वाले मान बोल्ड में दिखाए जाते हैं ।

पूरक तालिका 1: टीबीएस और TBST की बफ़र संरचना. टीबीएस एंटीबॉडी घोला जा सकता है और कमजोर पड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है । धोने के लिए, सभी कदम प्राथमिक एंटीबॉडी, जहां TBST सिफारिश की है निंनलिखित बहाकर के अलावा टीबीएस के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: सीडी-पीडी-1-टिम-3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए विस्तृत एंटीबॉडी मिश्रण संरचना. प्रत्येक प्राथमिक, माध्यमिक, और तृतीयक एंटीबॉडी घोला जा सकता है के लिए, टीबीएस की इसी मात्रा में प्रदर्शन करने के लिए कमजोर पड़ने 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए दिया जाता है । एक स्लाइड के लिए, आवश्यक कुल प्रतिक्रिया मात्रा 2 सेमी2के एक ऊतक क्षेत्र के लिए १०० µ एल है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

संशोधन और समस्या निवारण:

ऊतक की गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है; इसे आसानी से hematoxylin और eosin रंगाई से चेक किया जा सकता है ।

इस तकनीक का एक लाभ मल्टीप्लेक्स दाग की संभावना है, लेकिन fluorophore spillover से बचने के लिए, यह 10 एनएम के डेल्टा के साथ उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य ंयूनतम चुनने की सिफारिश की । यहां, क्योंकि हम DAPI सहित 4 दाग था, हम तरंग दैर्ध्य बाहर फैल चुना (DAPI: ४६० एनएम, AF488:५१९ एनएम, Cyanine 3:570 एनएम, Cyanine 5:670 एनएम) । विभिन्न fluorophores से अतिव्यापी संकेतों का खतरा एक मिश्रित उत्सर्जन संकेत से एक fluorophore की शुद्ध स्पेक्ट्रम की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बचा है, एक स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त. मोनो दाग स्लाइड भी fluorophores और वर्णक्रमीय पुस्तकालय के लिए एक मुआवजा धन्यवाद के रूप में कार्य के बीच ओवरलैप के अभाव की पुष्टि.

एक कक्ष में एक मार्कर के लिए धनात्मकता यदि धुंधला प्रतिदीप्ति कमजोर है यह निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है । प्रत्येक प्रयोग में शामिल नकारात्मक नियंत्रण धनात्मकता की दहलीज को निर्धारित करने का एक अच्छा तरीका है ।

युग्मित सॉफ्टवेयर में छवियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया, सेल की धनात्मकता निर्धारित करने के लिए एक स्कोरिंग कदम मौजूद है, लेकिन यह केवल एक साथ दो मार्करों का विश्लेषण कर सकते हैं. क्योंकि हम एक ही सेल (सीडी, पीडी-1, और टिम-3) पर ट्रिपल धुंधला कर सकते हैं, हम phenotyping कदम चुना है ।

phenotyping कदम श्रमसाध्य जा सकता है, विशेष रूप से अगर धुंधला और पृष्ठभूमि के प्रकार एक नमूना से दूसरे में चर रहा है ।

तकनीक की सीमाएं:

यहां तक कि अगर सह दाग की संख्या पारंपरिक प्रतिदीप्ति की तुलना में एक लाभ है, यह प्रवाह cytometry में के रूप में कई रंगों का विश्लेषण करने के लिए संभव नहीं है । विशेष रूप से जब एकाधिक मार्करों के colocalization का अध्ययन किया है, संवेदनशीलता है कि फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना में कम है के लिए जागरूक हो (एक 20x माइक्रोस्कोप आवर्धन के लिए, लगभग ०.५ µm बनाम ०.१ µm के लिए प्रति पिक्सेल, ब्रांड पर निर्भर करता है) और fluorophore spillover के लिए जांचें (प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों को देखें, नीचे) ।

तकनीक की एक बड़ी सीमा रॉ डेटा स्वरूप है । रॉ डेटा. txt फ़ाइलें जो उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है । के रूप में सॉफ्टवेयर phenotype के लिए CI के साथ छवि प्रति एक. txt फ़ाइल देता है, एक विशाल श्रृंखला के प्रति रोगी 5 फ़ाइलों में से प्रत्येक के मैनुअल उपचार बहुत श्रमसाध्य है । एक bioinformatics विशेषज्ञ एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में सभी डेटा की गणना करने के लिए आवश्यक है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:

मल्टीप्लेक्स में दाग का विश्लेषण आसानी से संभव है । प्रवाह cytometry, जो ताजा नमूनों का विश्लेषण करती है की तुलना में, इस तकनीक को एक स्वचालित प्रक्रिया 26 के साथ जमे हुए नमूनों के बड़े साथियों में, ट्यूमर microenvironment में मौजूद विभिन्न सेल उपसमुच्चय के एक प्रतिलिपि विधि में एक तेजी से गिनती की अनुमति देता है ,27. हम स्वचालित रूप से आरसीसी की सेटिंग में पीडी-1 और सह-व्यक्त टिम-3 या नहीं एक्सप्रेस सीडी+ टी कोशिकाओं घुसपैठ गिनती सकता है । स्वचालित गिनती आंख थकान और गैर प्रतिलिपि गिनती की तरह कई पूर्वाग्रहों से बचा जाता है, और समय लेने नहीं है ।

के रूप में बड़े साथियों का अध्ययन जमे हुए नमूने पर था, हम पूर्वव्यापी डेटा तो हम निरपेक्ष संख्या या सीडी+ टी के प्रतिशत से लिंक सकता है जैविक मापदंडों और नैदानिक परिणाम के साथ सेल सबसेट । के रूप में वहां एक मरीज से एक और28के लिए प्रतिरक्षा घुसपैठ की एक महत्वपूर्ण विविधता है, यह fluorocytometry की तुलना में एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है कि रिपोर्टों केवल MFI और प्रतिशत नहीं बल्कि घुसपैठ ग्रेड ।

प्रतिदीप्ति तीव्रता मात्रात्मक प्रत्येक कोशिका के लिए सूचना दी है, और विभिंन सेल डिब्बों में (झिल्ली/कोशिका/नाभिक), हम पीडी-1 के स्तर पर झिल्ली पर MFI से धुंधला मूल्यांकन सकता है । यह एक और दिलचस्प उपकरण है कि प्रवाह cytometry के समान है का प्रतिनिधित्व करता है । हमने पाया है कि पीडी-1+ सीडी+ टी कोशिकाओं टिम-3 एक्सप्रेस की उच्च अभिव्यक्ति थी पीडी-1 और एक गरीब रोग का निदान के साथ जुड़े थे (प्रगति मुक्त अस्तित्व पर प्रभाव). हमारे ज्ञान के लिए, यह इस पद्धति है कि एक विशिष्ट सेल सबसेट के एक नैदानिक महत्व से पता चलता है का उपयोग कर पहली अध्ययन है ।

भविष्य अनुप्रयोगों:

आवेदन का क्षेत्र अपार है । हम भी फेफड़ों के कैंसर के ट्यूमर microenvironment एक और विशिष्ट सेल सबसेट में प्रकाश डाला: ऊतक निवासी स्मृति टी कोशिकाओं TRM बुलाया (CD103+ CD49a+), और वे एक बेहतर समग्र अस्तित्व के साथ संबंधित हैं21,29 ,30. इस तकनीक का उपयोग कर एक और काम में, हमारी टीम ने पाया कि पीडी-L1 एक anaplastic लिंफोमा कळेनासे (ALK) पुनर्व्यवस्था के साथ फेफड़ों के कैंसर के एक उपप्रकार में ट्यूमर कोशिकाओं पर व्यक्त किया गया था, और इस अभिव्यक्ति सीडी+ टी के साथ संबंधित था10घुसपैठ । इस तकनीक के कई संदर्भों में महत्वपूर्ण जैविक मापदंडों के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है और जैव मार्कर खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । के बाद से xy निर्देशांक दिया जाता है, यह पहली उपकरण में से एक है स्थलाकृति और सेल का अध्ययन करने के लिए31आसानी के साथ/

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम:

महत्वपूर्ण कदमों में से एक सह के अनुकूलन है, जो समय लेने वाली हो सकता है धुंधला । एक अच्छा एंटीबॉडी की पसंद महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए कई क्लोन टिम के लिए परीक्षण किया गया है वर्तमान मामले में 3 । इसके अलावा, एक ही मार्कर के लिए अलग fluorophores अलग परिणाम दे सकते हैं तो यह कई संयोजनों की कोशिश करने के लिए महत्वपूर्ण है. एंटीबॉडी के साथ दाग विशिष्टता है कि एक साथ प्रतिक्रिया नहीं होनी चाहिए की जांच की सिफारिश की है । एक ही समय में कई fluorophores का विश्लेषण करने की संभावना के बावजूद, मोनो-सना हुआ स्लाइड के साथ spillover के लिए जाँच की सिफारिश की है. एक और महत्वपूर्ण कदम phenotyping कदम है कि मैनुअल प्रशिक्षण पर निर्भर करता है के लिए ध्यान से प्रदर्शन है ।

कुल में, एक माहिर ऑपरेटर द्वारा इस मल्टीप्लेक्स तकनीक का उपयोग एक सुरुचिपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है स्थानीय प्रतिरक्षा घुसपैठ, जो महत्व का है के बाद से परिधीय रक्त विश्लेषण स्थानीय ट्यूमर के प्रतिनिधि नहीं हो सकता के कई सेल सबसेट का विश्लेषण पर्यावरण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी लेखकों के हित की घोषणा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

यह काम Institut नेशनल ड्यूल कैंसर (इंका) (ईटी), Ligue contre le cancer (ईटी), विश्विद्यालय सोरबोन पेरिस cite (एट), ANR (Selectimmunco) (एट), Labex bliss-ऑन्कोलॉजी (एट), सिर्क CARPEM (सीजी, एट) से अनुदान द्वारा समर्थित था । EdG स्नेहन चाप की एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । EV और सीडी APHP (बाजार année सूक्ष्म) के एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । ChB विश्विद्यालय सोरबोन पेरिस cite (contrat डॉक्टरेट) के एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है । लेखक इस परियोजना में अपनी फंडिंग के लिए ब्रिस्टल मायर्स Squibb का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखकों ने डिपार्टमेंट ऑफ पैथोलॉजी ऑफ Hopital Européen जार्ज्स Pompidou और नैक (Laurianne Chambolle, Elodie मिशेल और Gisèle Legall) का शुक्रिया अदा किया । लेखकों ने PARCC के प्रोटोकॉल मंच, Hopital Européen जार्ज्स Pompidou (Corinne Lesaffre) का धन्यवाद किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक १३२ सीटू मेंमल्टीप्लेक्स multispectral इमेजिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक डिजिटल इमेजिंग गुर्दे सेल कार्सिनोमा टिम-3 पीडी-1 ट्यूमर microenvironment चौकी अवरोधकों सीटू एकल सेल विश्लेषण में
मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण और ठहराव के Intratumoral पीडी-1<sup>+</sup> टिम-3<sup>+</sup> सीडी<sup>+</sup> टी कोशिकाओं
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter