Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiplekset Immunofluorescence analyse og måling av Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Studere svulst microenvironment kan identifisere prognostiske eller prediktiv biomarkers av kliniske svar immunterapi. Presenteres her, er en innovativ metode basert på i situ fluorescens multispectral imaging for å analysere og telle automatisk ulike subpopulasjoner av CD8+ T celler. Denne reproduserbare og pålitelig teknikken er egnet for store kohort analyser.

Abstract

Immunceller er viktige komponenter i svulst microenvironment og påvirke tumor vekst og utviklingen i alle stadier av kreft. Spesielt er det nå godt etablert at det immun infiltrere i menneskelig svulster kan sammenligne med prognose og respons på behandling. Analyse av den immun infiltrere i svulst microenvironment har blitt en stor utfordring for klassifisering av pasienter og respons på behandling.

Co uttrykk for hemmende reseptorer som programmet celle død Protein 1 (PD1, også kjent som CD279), cytotoksisk T lymfocytt forbundet Protein 4 (CTLA-4), T-celle immunglobulin og Mucin som inneholder Protein-3 (Tim-3, også kjent som CD366) og lymfocytter Aktivisering genet 3 (Lag-3, også kjent som CD223), er et kjennetegn på T celle utmattelse. Vi utviklet en multiparametric i situ immunofluorescence flekker og kvantifisere på cellenivå co uttrykket av disse hemmende reseptorer. På en retrospektiv rekke frossent av nyre celle kreftsvulster (RCC), bruke en fluorescens multispectral imaging teknologi kombinert med en analyseprogramvare, ble det funnet co uttrykket av PD-1 og Tim-3 på svulst infiltrere CD8+ T celler er korrelert med en dårlig prognose i RCC. Vi vet, dette representerer den første studien viser at dette automatisert multiplex i situ teknologi kan ha noen klinisk relevans.

Introduction

I de siste årene, har immunterapi framstått som en meget lovende behandling for mange typer kreft, inkludert RCC. Spesielt immunterapi basert på hemming av hemmende sjekkpunkter som PD-1 og CTLA-4 har blitt rapportert å være klinisk effektiv1,2,3,4,5, 6. monoklonale antistoffer mot CTLA-4, PD-1 eller Program død Ligand 1 (PD-L1) er allerede godkjent i flere typer kreft og føre langvarig kliniske tiltak i mer enn 20% av pasientene7. Likevel, ikke alle pasienter er respondere, behandling er høy og disse behandlingene er giftige, fører til potensielle alvorlig autoimmun-lignende bivirkninger. Derfor er nåværende utfordringen å identifisere prediktiv indikatorer som de nye immunotherapies. Frekvensen av mutasjoner i svulsten, uttrykk for PD-L1 eller nivåer av intratumoral CD8+ T celle infiltrasjon har blitt rapportert å korrelere med klinisk respons. Denne tilknytningen er imidlertid fortsatt svak anbefaler bruk av disse kliniske biomarkers i klinisk praksis bortsett fra kameraten testen for PD-L1 før administrasjonen av Pembrolizumab i ikke-småcellet lungekreft kreft (NSCLC) pasienter8 ,9,1011,12. Det har blitt demonstrert at co uttrykk for mange hemmende reseptorer som PD-1, Tim-3, Lag-3, og CTLA-4, induserer en celle utmattelse fenotypen og motstand mot terapi13,14,15. Siden perifert blod ikke er representative for svulst microenvironment, er det stor interesse å analysere fenotypiske funksjonene i cellene i situ. PD-1 og Tim-3 co uttrykke T-celler er kjent for å være funksjonelt nedsatt celler i flere sammenhenger13,16,17. I denne studien, prognostiske virkningen av co uttrykk for to hemmende receptors PD-1 og Tim-3 på CD8+ T celler ble vurdert.

Opp til nå, studere co uttrykk for flere indikatorer på svulst infiltrere lymfocytter (TILs) er hovedsakelig utført av flyt cytometri analyse, noe som gjør det nødvendig å arbeide med fersk svulster og derfor utelukker retrospektiv analyser. Med konvensjonelle i situ flekker, eneste flekker samtidig kan utføres, og karakterisering av hvilken celle som co uttrykker markørene er ikke mulig. For eksempel er PD-L1 uttrykt ved mange celletyper av tumoral microenvironment, gjør det vanskelig å definere ved konvensjonelle immunohistochemistry analyse hvilke celler uttrykke PD-L1 er mer relevante for correlative studier. I dette arbeidet, vi utviklet en nyskapende i situ multiparametric immunofluorescence metode med datamaskin-telling for å sammenligne co uttrykket av PD-1 og Tim-3 av svulst infiltrere CD8+ T-celler med kliniske utfall i RCC. Denne teknikken har flere fordeler, inkludert muligheten til å analysere på en enkelt celle og flere markører samtidig med et multispectral kamera som kan fange begrenset intervaller > 10 nm gjennom krystall filtrerer18. Videre er fremgangsmåten automatisk som muliggjør en mellom operatører reproduserbarhet og en forkortet analyse forhold til manuelle teknikker19. I feltet kreft rapportert flere studier overbevise flere stainings av immun molekyler som PD-1, PD-L1 og CD8 Merkel celle carcinoma, lungekreft og hode og nakke kreft20,21,22, 23. de automatiserte celletall er mulig med opplæring av brukeren (phenotyping trinn). Fluorescensen måles i de ulike celle avdelinger (kjerner, cytoplasma og membran).

Her, forskjellige undergrupper av svulst-infiltrere CD8+ T celler uttrykke PD-1 og/eller Tim-3 i en stor kohort av RCC ble regnet og resultatene var korrelert med klinisk tyngdekraften score og overlevelse parametere. Det var også mulig å analysere membran fluorescens intensitet på mobilnettet oppløsningen mener fluorescens intensitet (MFI) data som i cytometri. Så vidt vi vet, er dette de første studien rapportering prognostiske resultatene bruker denne multispectral tenkelig basert teller teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble gjennomført i henhold til erklæringen i Helsinki og ble godkjent av den lokale etikk (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Informert samtykke ble innhentet fra deltaker inkludert i kohortene.

1. vev materiale

  1. Samle RCC vevsprøver på dagen. Håndtere kirurgiske prøven ved romtemperatur (patologi avdeling).
  2. Samle et svulst utvalg av ca 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm størrelse i en tørr rør. Fest fryse i flytende nitrogen og lagre på-80 ° C.
  3. Coat eksemplene i optimal kutte temperatur sammensatte. Delen prøvene med en kryostaten på 20 ° C til 4-6 µm tykke snitt. La prøvene lufttørke på lysbilder for 12t og direkte lagre dem på-80 ° C for å unngå uttørking.
  4. Sjekk kvaliteten på prøven ved å vise en Hematoxylin og Eosin farget delen.

2. i Situ Immunofluorescence farging av TILs

  1. Fremgangsmåter
    1. Utfør alle eksperimentelle trinn ved romtemperatur.
    2. For alle trinnene, kan du utføre fortynninger med Tris Saline Buffer (SS, se Tabellen for materiale).
    3. Utføre vask i ss for alle skritt bortsett fra etter den primære antistoff inkubering. For sistnevnte bruke Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, se Tabellen for materiale). Hvis bufferen sammensetning og rekonstituering se supplerende tabell 1.
    4. Bruk en fuktighet kammer for antistoffer incubations og en flekker krukke for vask.
    5. Ikke la delen tørke ut under prosedyren.
  2. Forbehandling
    1. Tine lysbildet som inneholder Vevsprøve og nøye tørke lysbildet rundt prøven med et papirhåndkle. Delimitate reaksjon området med vevet med en hydrofobe barriere (se Tabell for materiale). Tørr i 2 minutter.
    2. Fikse prøvene i 100% aceton i 5 min, tørr i 2 minutter, og vask med TBS i 10 min.
  3. Metning og blokade
    1. Pretreat lysbilder for 10 min med 3 dråper på avidin 0,1%, trykk og/eller flick lysbildet for å distribuere avidin og fjerne luftbobler og deretter behandle for 10 min med 3 dråper av biotin 0,01% (se Tabell for materiale), trykk, og/eller bla. Vask med TBSen.
    2. Utføre en Fc reseptorer blokade. Bruke 100 µL av en 5% volum/volum av normal serum fortynnet i TBS. Bruk serum fra den samme vert arten som merket sekundære eller tertiære antistoffer (se Tabell for materiale); her, ble esel serum brukt. Inkuber i 30 min.
    3. Under incubation, kort spinne den anti-CD8, PD-1 og Tim-3 antistoffer (Tabell for materiale). Forberede blanding av primære antistoffer i SS som beskrevet i supplerende tabell 2.
  4. Immuno-flekk for CD8, PD-1 og Tim-3
    1. Forberede primære antistoff blandingen. Se på Tabellen for materiale og supplerende tabell 2 for antistoffer brukes (anti-CD8, PD-1, Tim-3, og deres tilsvarende sekundære antistoffer) og konsentrasjonene.
    2. Trykk og/eller bla gjenværende esel serum (lagt til i trinn 2.3.2). Inkuber lysbildene med 100 µL av ikke-merket primære antistoffer miksen 1t i en fuktet kammer.
    3. Under incubation, kort spinn på Cyanine 5 anti-kanin AF488-anti-geit og biotinylated anti-muse-antistoffer, og forberede blanding av sekundær antistoffer som beskrevet i supplerende tabell 2.
    4. Vask lysbildene i TBST for 5 min. tørr lysbildene.
    5. Inkuber lysbildene med 100 µL av sekundær antistoffer i 30 min i en fuktet kammer.
    6. Forberede blanding av tertiær antistoff som inneholder Cy3-streptavidin som beskrevet i supplerende tabell 2.
    7. Vask lysbilder i ss for 10 min. tørr lysbildene.
    8. Inkuber lysbildene med 100 µL av tertiær antistoff blandingen i 30 min.
    9. Vask lysbilder i ss for 10 min. tørr lysbildene.
  5. Cellen montering
    1. Montere lysbildene i en 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI inneholder montering medium (1,5 µg/mL DAPI) med en dekkglassvæske kompatibel for fluorescens mikroskopi (se Tabell for materiale).
      Merk: Som en negativ kontroll for hvert eksperiment, ett lysbilde med isotype-matchet antistoffer ble brukt på samme konsentrasjonen som tilsvarende antistoffer. For denne flekker brukte vi mus IgG1, kanin IgG og geit IgG negativ kontroll antistoffer (se Tabell for materiale). Som en positiv brukte vi menneskelige hyperplasic mandel som er kjent for å være positivt for testet markører, for hvert eksperiment. En typisk flekker er beskrevet i resultatene (figur 1). Mono-flekker av CD8, PD-1 og Tim-3 skal utføres individuelt (en farging per lysbilde) med samme før behandling og uten DAPI. Et lysbilde i samme eksperimentelle forhold uten antistoff og bare DAPI montering medium bør også utføres. Et lysbilde skal avbildes med identiske eksperimentelle forhold uten noen antistoff og uten DAPI.

3. fluorescens analyse og automatisert celletall

  1. Bildeopptak med automatisert mikroskopet
    1. Opprette en protokoll.
      1. Slå på automatisk mikroskop programvaren og fluorescens illuminator.
      2. Menylinjen, klikk på "File", "opprette protokollen," Velg "DAPI," "FITC" og "TRITC."
      3. Klikk "Neste", "Vev delen" og klikk "Neste", "protokollnavn". Velg et navn, for eksempel "CD8-PD-1-Tim-3" Klikk "Neste" og "lagre".
      4. Manuelt plassere et lysbilde på scenen.
      5. Menylinjen, velg "setup", "innstillinger". Klikk "sette hjem Z" i det nye vinduet.
      6. Justere eksponeringstid med en positiv kontroll skyve dvs en CD8, PD-1 og Tim-3 trippel-farget med DAPI prøve.
      7. Kontrollinjen klikk "sette eksponering."
      8. Justere eksponeringstid for hvert filter til et tilstrekkelig men ikke mette signal er oppnådd.
      9. For monokrome avbildning, kan du utføre følgende:
      10. Velg oppkjøp og velg DAPI filter under 'autofokus'.
      11. I "scan området limit", flytte objektive øverst i øvre venstre hjørne på lysbildet. Klikk "Merke". Gjør det samme for nedre høyre hjørne.
        Merk: Dette trinnet delimitates området strømsparingsmodus imaging (LP imaging) på 4 X; Vær oppmerksom på å plassere merket vel så som å omringe alle prøvene av serien.
      12. For høy effekt (HP) imaging, utfører du følgende:
      13. Under "Autofokus", velg "DAPI".
      14. Under 'Acquisition' band, velger du "DAPI", "FITC", "Cy3" og "Cy5". Klikk "OK". På menylinjen klikker du "Fil", "lagre protocol".
    2. Skanne lysbilder.
      1. Laste protokollen ved å klikke "File", "Last protokollen" fra menylinjen. Klikk "Start".
      2. Angi 'Lab ID' (mappeplassering for bildelagring). Angi lysbilde-ID for å finne frem til lysbildet. Klikk "Neste".
      3. Klikk "Monokrom tenkelig" (for å skanne hele lysbildet under lysende felt lys og hente sekvensielle bilder ved hjelp av en 4 x-målet).
        Merk: Dette gir en gråtone oversikt av lysbildet.
      4. Klikk "Finn prøven". Velg området av vev som skal skannes med lav oppløsning (4 x): hold "Ctrl"-tasten og klikk på et felt som bruker markøren å velge eller velge bort feltene (figur 2A).
      5. Klikk "LP tenkelig" (4 x imaging) for fluorescerende rød Blågrønn image vinningen av hvert felt.
      6. For HP feltvalg, holder du nede Ctrl-tasten og klikk på et felt som bruker markøren markere eller fjerne markeringen som tilsvarer området av vev som skal skannes med høy oppløsning (20 x). Velg 5 felt (figur 2B).
      7. Klikk "HP tenkelig" (20 x imaging) for et multispectral bildeopptak for hvert felt (figur 2C).
      8. Klikk "Data lagringen" for å lagre bilder i mappen som ble valgt fra begynnelsen i LabID.
        Merk: Prosessen er oppsummert og illustrert i figur 2. For hvert trinn (vev gjenkjenning, Feltutvalg) kan en algoritme økes og trent av sluttbrukeren for at en hel automatisert avsøke forarbeide.
  2. Fluorescens bildeanalyse og automatisert celle telle med kombinert analyseprogramvare
    1. Bygge spectral biblioteket.
      1. Åpne bildet analyseprogramvare.
      2. På venstre panel, åpner du "Bygge biblioteker". Under "load image", klikk på "Browse" og velg en mono-farget bilde (f.eksCD8/Cyanine 5).
      3. Velg fluorophore, (f.eksCyanine 5). Klikk "extract". Klikk "Lagre" for å lagre i biblioteket. Klikk "Lagre".
      4. Gjenta den samme prosessen for PD-1, Tim-3 og DAPI mono-farget lysbilder for å integrere spekteret av hver fluorophore rundt.
        Merk: Bygge spectral biblioteket integrerer spekteret for hver fluorophore som brukes for bestemte vev (her, nyre), men "syntetiske" biblioteker som allerede eksisterer kan brukes. Autofluorescence spekteret er strengt i forhold til vevet, er det viktig å utføre en auto-fluorescens og spectral biblioteket per prosjekt.
    2. Opprette et nytt prosjekt.
      1. Klikk "Fil", "New Project" fra menylinjen. I kategorien "Søkefunksjonen", velg "celle segmentering". Velg "phenotyping" i kategorien 'Phenotyping'. Klikk "Opprett".
      2. Integrere representant bildene i prosjektet.
        1. I 'Fil'-fanen, klikk på "åpne bilde". Velg 10-30 representant bilder av hele serien. Legge til ikke-farget lysbildet for å fjerne autofluorescence. På det høyre panelet: Velg bibliotek kilde. Velg fluorophore og velge de tilsvarende spectral biblioteket tidligere bygget.
      3. Hvis du vil fjerne vev autofluorescence, klikk "AF" og Velg området autofluorescence i tomme lysbildet.
      4. Bilde behandling og sammensatt bilde generasjon.
        1. Klikk "Forbered alle" for å integrere fluorescens biblioteket og autofluorescence spectra generere det sammensatte bildet (Figur 3). Klikk på ikonet "øyet" åpne "Vis editor"-panelet, og velg dataene som vises: markørene CD8, PD-1, Tim-3, og DAPI. Fjerne autofluorescence. Fremgangsmåten presentert av programvaren.
      5. Segmentere cellene.
        1. For å segmentere celler, i "Rom", velg "Kjerner" og "Membran". Angi DAPI som den kjernefysiske counterstain i kategorien "Kjerner".
        2. I kategorien "Maksimum og minimumsstørrelse (px)" Angi "40" og "176" som minste og maksimale størrelsen, henholdsvis. "Minimum" signal, angi "0,13". Angi "2,60" i "Split"-kategorien. Angi "0.81" i "Kjerner" kategorien. Velg "Bruk membran signal for å hjelpe segmentering".
        3. Klikk "Segment celler" i den nederste delen av skjermen. Oppdeling av kjerner og membraner av celler og prøv på nytt med ulike parametere hvis det ikke samsvarer med DAPI og membran fluorescens cellene.
          Merk: Programvaren gjenkjenner cellene med den kjernefysiske DAPI flekker og basert på cellestørrelsen. Justere celle parametere (størrelse, delt, piksler) i henhold til prosjektet.
      6. Fenotypen cellene.
        1. I kategorien "Fenotypen", klikk "Legg til". Opprette celle fenotypen Kategorier: CD8 (blå prikk) / CD8-PD-1 (rød prikk) / CD8-PD-1-Tim-3 (grønn prikk) / andre (svart prikk) (Figur 4).
        2. Velg 5 eller flere eksempler på celler i hver kategori. Klikk "Trene klassifiserer".
          Merk: Dette genererer en statistisk klassifisering algoritme av programvaren.
        3. Klikk "Fenotypen alle" for å få fenotypen av hver celle.
          Merk: Programvaren gir fenotypen av én celle med et sikkerhetsintervall (CI) av nøyaktighet.
        4. Forbedre algoritmen av trening programvaren til forskjellen mellom øyet og automatiserte teller er overensstemmende (feil < 5%). Velg en CI som er akseptabelt for cellene rundt.
          Merk: Vi valgte å gjøre opplæringen basert på 55% CI som akseptabel.
      7. Lagre algoritme og prosjekt.
      8. Velg "prosjektet" under "Fil". Navnet den og klikk "Lagre".
    3. Utføre satsvis analyse av serien.
      1. Velg "Batch analyse". Velg prosjektet. Legge til bilder til å analysere. Velg en mappe for lagring av data. Klikk "Kjør". Sjekk kvaliteten på det sammensatte bildet. Kontroller phenotyping på alle bildene i serien.
        Merk: Kombinert bilde analyseprogramvare integrerer alle cellen rom (membran/cytoplasma/kjerner) signaler. Det phenotyping trinnet er avgjørende enskjønt opplæring av algoritmen kan være en tidkrevende trinn. Alle data på hvert bilde er i en txt-fil. Alle dataene i én celle (spesielt sin fenotypen gitt med sin CI) er i en linje. For hvert lysbilde ble bildeopptak og påfølgende teller utført på 5 felt.
  3. Integrasjonen av rådata og generering av den automatiserte celletall
    1. Beregne data med et statistisk program.
      1. Beregne alle data fra 5 bilder tilsvarer feltene 5 analysert for 1 pasienten. Bruk en statistisk plattform, og har en erfaren statistiker, databehandling eller data forsker utføre analysen. Bygge et skript som automatisk teller cellene avhengig av deres fenotype, velge CI > 55%.
      2. Sette alle TXT-filer av serien i samme mappe.
    2. Trekke ut data.
      1. Sette alle TXT-filer i en mappe. Kjøre skriptet automatisk bygget i trinn 3.3.1. Åpne CSV utdatafilen generert av skriptet R. Lagre som .xl format. Output samler antall celler for hver fenotypen (i.e.CD8 alene, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) for hver pasient.
      2. Beregne gjennomsnittlig antall celler for hver pasient per felt: dele antall celler per antall felt (dvs.5) å normalisere antall celler for hver pasient per felt.
      3. Beregning av PD-1+ celler blant totalt CD8+ T celler, og PD-1+ Tim-3+ celler blant totalt CD8+ T celler. Se figur 5 Sammendrag av dette trinnet.
        Merk: R språk (eller annen programmering programvare av valget) kreves riktig opprette og kjøre kommandoer, og så en erfaren bruker eller statistiker/data forsker er avgjørende. R programmet kan beregne data i samme pasient, men navnet på de 5 txt-filene til en pasient bør ha en identisk begynnelsen, tilsvarer en unik pasient ID.
  4. Statistisk analyse
    1. Bruk statistisk programvare for statistisk analyse av resultatene.
    2. Utføre riktige statistiske analyser ved hjelp av en statistiker.
      1. Bruk av ikke-parametriske Diversified signert rank tester for sammenligning av PD-1 MFI mellom to cellen fenotyper (figur 6). Relatere det justering kovariat og histologiske egenskaper med en Pearsons kjikvadrerte test.
      2. Bruk en Kaplan-Meier metode til å beregne progresjon gratis overlevelse, og Cox regresjon modeller til å beregne justering kovariat effekter på tid-å-hendelse utfall, som total overlevelse og sykdom-fri overlevelse.
      3. Vurdere p-verdier som er lavere enn 0,05 som betydelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruke den generelle protokollen beskrevet ovenfor, vi som mål å kvantifisere intratumoral CD8+ T celler uttrykke co hemmende receptors PD-1 og Tim-3 i frosne vev fra pasienter med RCC, og å korrelere resultatene med kliniske utfall25.

Optimalisering av den CD8/PD-1/Tim-3 flekker:

Ulike arter av antistoffer (mus, kanin og geit, se Tabell av materiale) ble valgt for å unngå kryss reaksjon mellom forskjellige antistoffer. Protokollen ble godkjent på en mandel, som er en organisert lymfoidvev. PD-1 flekker kan bli funnet i germinal sentre (figur 1), mens CD8 og Tim-3 flekker finnes rundt germinal sentre. Observasjon av denne typiske flekker validert denne protokollen. Den flekker ble også godkjent på vevet rundt (nyre).

Fravær av signal den primære antistoff inkubert med sine ikke-tilsvarende sekundære antistoff (data ikke vist) ble bekreftet. Analysere nøyaktig den fluorescens flekker og gjøre bestemte spectral bibliotek, individuelle lysbilder enkeltvis var farget med hver merketråd (CD8, PD-1, Tim-3 eller DAPI) i vevet rundt (nyre). Et ikke-farget lysbilde i samme vilkår er nødvendig å ekstrapolere autofluorescence av vev. Den flekker ble analysert av automatiserte mikroskopet, som integrert spectrums av de forskjellige fluorophores; hver indikator var godt differensiert og overlapping av merkene ble observert (Figur 3).

Kvantitative og kvalitative kjennetegner CD8 + Infiltrere i 87 RCC pasienter:

Resultatene viste at approximatively halvparten av CD8+ T celler uttrykke PD-1 (mener 53.9%. SE: 30.49%) og om en tredjedel var dobbel positiv PD-1+ Tim-3+ (betyr 38.16%. SE: 28.11%). Tim-3 uttrykk uten PD-1 uttrykket ble oppdaget i mindre enn 3% av CD8+ T celler (data ikke vist). Gjennomsnittlig antall CD8+ T celle subpopulasjoner var: totalt CD8+ T celler 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T celler 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ Tim-3+ 66.9 (SE: 143), og PD-1+ Tim-3- CD8 + T celler 22.38 (SE: 57,5) per felt. Totalt antall intratumoral CD8+ T celler ble positivt korrelert med prosentandelen av PD-1+ Tim-3+ på CD8+ T celler.

Funksjonell karakteristikk av CD8 + T celler avhengig av fenotypen PD-1 og Tim-3:

PD-1 uttrykk nivå er kjent for å være korrelert med T celle utmattelse så vi neste sikte å måle PD-1 uttrykk på CD8+ T celler i henhold til Tim-3 uttrykk status. Som mener fluorescens intensiteten av de forskjellige fluorochromes er rapportert på cellenivå, en liten serie pasienter ble manuelt analysert for mobildatanettverk: resultatene viste en korrelasjon av PD-1 membran MFI med cellen undertypen. PD-1 fluorescent intensitet ble målt (figur 6) på cellenivå på PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ Tim-3- CD8+ T celler (et panel) og på enkelte pasient nivå etter integrere disse ulike cellen signaler på en vev-delen. I en rekke 9 pasienter fant en sammenligning med Diversified parvis test at PD-1 MFI er høyere når Tim-3 uttrykkes co, forsterke funksjonelle relevansen av Tim-3 uttrykk (B panel).

Uttrykk for PD-1 og Tim-3 ligander på overflaten av kreftceller fra flere co farging:

Som T celle utmattelse er formidlet gjennom reseptor/ligand samhandling, vi vurdert uttrykk for PD-1 og Tim-3 ligander (PD-L1 og Galectin-9 (Gal-9), henholdsvis) på nyre kreftceller identifisert av pan-Keratin flekker. Positivitet er definert som cut-off av 10% av tumorceller uttrykke markøren: (i) 58 av 87 pasienter (66%) var positivt for PD-L1; (ii) alle 15 svulstene analysert var positivt for Gal-9 (figur 7A, B).

Kliniske effekten av co uttrykk for Tim-3 + PD-1 + på CD8 + T-celler:

Svulst Node metastasering (TNM) scoring, Fuhrman klasse, tumor størrelse og UISS score er histologiske egenskaper (kombinert med klinisk score for UISS) brukes til å definere prognose verdien av primære RCC. En positiv sammenheng ble observert mellom tall og/eller andelen svulst-infiltrere CD8+ T celler uttrykke PD-1 og Tim-3 (men ikke uttrykke bare PD-1 uten Tim-3) med alle disse parametrene (tabell 1). I tråd med denne mer nedsettende fenotype, RCC pasienter med CD8+ T celler co uttrykke PD-1 og Tim-3 ovenfor median prosentandelen (34,7) var mer sannsynlig å tilbakefall (p = 0.046; HR 2.9; 95% CI: 1.02-8.21). Denne sammenhengen var ikke observert med prosentandelen av PD-1 på CD8+ T celler uavhengig av Tim-3 status (tabell 2). En korrelasjon ble også demonstrert mellom andelen CD8+ T celler co uttrykke PD-1 og Tim-3 og 36 måneders total overlevelse (data ikke vist). Vi også godkjent av tre immunostaining på mandel parafin vev (figur 1).

Figure 1
Figur 1: CD8-PD-1-Tim-3 immunostaining på en mandel parafin-embedded vev. Parafinen innebygde vev deler i stedet for cryopreserved deler ble valgt for trippel immunostaining. Etter dewaxing og rehydrering, ble den samme protokollen for flekker tidligere utviklet for cryopreserved deler brukt. CD8+ T-celler finnes utenfor germinal sentrum og ikke-CD8+ T-celler uttrykke PD-1 står i germinal sentrum. Mikroskop forstørrelse er 20 x og baren skala representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: automatisert analyse av renal cell carcinoma vevsprøver. Etter vev anerkjennelse i lyse feltet bilde (A, skala bar 1 mm), 4 x mikroskop forstørrelse lav oppløsning bilder i RGB (rød blå grønn konvensjonelle fluorescens) brukes til å velge feltene (B, skala bar 500 µm. Full rød firkant representerer et felt. Oppløsning (multispectral kube fluorescens bilde gjelder for denne teknologien) med på 20 x forstørrelse av multispectral mikroskopet vises (C, skala bar 100 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Multispectral mikroskopi og programvare kombinert analyse for generering av et sammensatt bilde av en Nyrecellekarsinom (20 x mikroskop forstørrelse). Det høyoppløselige raw-bildet (A) er et fluorescerende bilde i feltet etter multispectral skanning av fluorescens filter kuber. Blå er AF488, rød er Cyanine 5 og grønt er Cyanin3. Flettingen viser forskjellige farger for eksempel gul er en sammenslåing av de tre fluorophores. Dette bildet er innarbeidet i bildet analyseprogramvare. Spectral biblioteket integrasjon gir en nøyaktig spektrum utskillelse av hver fluorophore og autofluorescence fører til et fluorescerende sammensatt bilde (B). Representant farger velges av operatøren: blå illustrerer Cyanine 5 (CD8), Red Cyanine 3 (PD-1), grønn AF488 (Tim-3). Sammenslåing blande farger som lilla brukes for CD8-PD-1 double positiv. Baren skala representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: PD-1 og Tim-3 uttrykk på svulst-infiltrere CD8+ T celler på en klare celle renal cell carcinoma prøven analysert av fluorescens multispectral bildeteknologi (20 x mikroskop forstørrelse). (A) CD8 (blå), PD-1 (rød) og Tim-3 (grønn) var farget på frossent deler fra RCC pasienter. Colocalization av disse tre merkene kan oppdages ved å flette mono flekker bildene. Isotype kontrollene ble utført i hvert eksperiment. Baren skala representerer 20 µm. gule bokser identifisere co farget celler: en Tim-3- PD-1+ CD8 celle og en Tim-3+ PD-1+ CD8 celle. (B) trippel co flekker for CD8, PD-1 og Tim-3 (fusjonert) er vist til venstre med den som indikerer at grønn er CD8+ T celler co uttrykke PD-1 og/eller Tim-3. For automatisert teller med bildet analyseprogramvare, avhengig identifikasjon av cellene av tilstedeværelsen av en kjernefysisk flekker (DAPI); cellen segmentering er også basert på morphometric karakteristika som røde grenser (midten panel). En algoritme trent brukeren til overensstemmelse med visuelle teller utføres (høyre), og etter automatisert phenotyping, identifiserer grønne prikker som CD8+ T celler uttrykke co PD-1 og Tim-3, røde prikker som CD8+ T celler uttrykke PD-1 uten Tim-3 og blå prikker som CD8+ T celler ikke uttrykke PD-1 eller Tim-3. Baren skala representerer 20 µm. gul viser PD-1 og/eller Tim-3 uttrykke CD8+ T celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: databehandling rådata om multispectral analyse. Data i antall hver celle kategori i hvert felt (dvs.5 felt/pasienten dvs, 5 txt-filer) er samlet inn etter bildeanalyser. Et R skript kombinerer 5 felt dataene, bare vurderer celler phenotyped konfidensintervallet > 55%. Mikroskop forstørrelse er 20 x og baren skala representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler uttrykke høyere nivåer av PD-1 forhold til PD-1+ Tim-3- CD8+ T celler i Nyrecellekarsinom. Intensiteten av PD-1 oppdages på cellenivå (venstre panel) i situ immunofluorescence analysen PD-1+ Tim-3+ og PD-1+ Tim-3- CD8+ T celler. På individnivå (midten panel): resultatene vises for hele CD8+ T celle delsett PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ Tim-3- finnes på en vev delen (dvs., en pasient; Mann Whitney test). Komparativ analyse av mener PD-1 intensiteten ble målt i en rekke 9 pasienter (høyre panel) (Diversified test, p-verdier lavere enn 0,05 ble ansett som viktig). Mikroskop forstørrelse er 20 x og baren skala representerer 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: PD-L1 og Gal-9 dvs PD-1 og Tim-3 ligander flekker på Nyrecellekarsinom. (A) Tumor celler identifiseres av pan-Keratin flekker. Co farging av PD-L1 og pan-keratin (et panel) identifiserer uttrykk for PD-L1 på kreftceller i 58 pasienter ut av 87 analysert. (B) Galectin-9 ble uttrykt i alle 15 tumorer fra RCC pasienter analysert. Positivitet ble vurdert dersom minst 10% av celler ble farget for markøren analysert. Isotype kontroller ble inkludert for hver flekker. Gule bokser representerer positive svulst (pan-Keratin +) celler for PD-L1 (panel A) eller Galectin-9 (panel B). Mikroskop forstørrelse er 20 x og baren skala representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

%/CD8+ T-celler PD-1+ PD1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
TNM 0,04 0.003 0.22
Furhman 0,01 0.004 0.74
Tumor størrelse 0,08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tabell 1: Sammenhengen mellom uttrykk for PD-1 alene eller kombinert med Tim-3 på CD8+ T celler og klinisk prognostiske parametere av RCC pasienter: p-verdier. Prosentandelen av PD-1+, PD-1+ Tim-3+ eller PD-1+ Tim-3- på CD8+ T celler valgt da en kontinuerlig variabel målt i situ immunofluorescence i kohorten 87 pasienter ble korrelert med forskjellige kliniske parameterne som er definert som en binær (TNM, Fuhrman kvalitet, UISS score) eller en kontinuerlig variabel (tumor størrelse). TNM ble delt i to grupper: lokalisert sykdom (pT1 og pT2) og avansert sykdom (pT3, pT4, N+eller M+). Fuhrman klasse ble definert som lav (klasse I eller II) og videregående (klasse III eller IV) og UISS score ble delt inn i 3 klasser (0, 1 og 2). P-verdier som angir en signifikant sammenheng vises i fet skrift.

CD8+ T-celle delsett/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
Median (%) 34,7 8.6
Sammenheng med PFS P = 0.046 P = 0,8

Tabell 2: Korrelasjon mellom PD-1 og Tim-3 co uttrykk på CD8+ T celler og progresjon-fri overlevelse. To grupper av RCC pasienter (n = 87) avhengig av andelen PD-1 uten Tim-3 (til høyre), PD-1 og Tim-3 (venstre) sammenlignet med medianen var individualisert. Sammenheng med PFS ble gjort med medianen valgt som et cut-off. P-verdier som angir en signifikant sammenheng vises i fet skrift.

Ekstra tabell 1: Buffer sammensetning av TBS og TBST. TBS brukes til antistoff mikser og fortynninger. For vasker utføres alle trinnene med TBS unntatt vasker etter primære antistoffer, der TBST anbefales. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra tabell 2: detaljert antistoffer blande komposisjon for CD8-PD-1-Tim-3 immunofluorescence flekker. For hver primær, sekundær og tertiær antistoff mikser, gis fortynning i det tilsvarende volumet av TBS for et totalt volum på 1 mL. For ett lysbilde er nødvendig totale reaksjon volumet 100 µL for en vev området av 2 cm2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endringer og feilsøking:

Vev kvaliteten er en viktig parameter; Det kan enkelt kontrolleres ved hematoxylin og eosin farge.

En fordel med teknikken er muligheten for multiplex stainings, men for å unngå fluorophore smitteeffekter, anbefales det for å velge utslipp bølgelengder med delta 10 nm minimum. Her, fordi vi hadde 4 stainings inkludert DAPI, valgte vi å fordele bølgelengdene (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3:570 nm, Cyanine 5:670 nm). Risikoen for overlappende signaler fra ulike fluorophores unngås ved hjelp av programvaren til å beregne ren spekteret av en fluorophore fra et blandet utslipp signal, kombinert med en automatisert bildeanalyser. Mono-farget lysbildene også bekrefte at overlappingen mellom fluorophores og handle som en kompensasjon takk til spectral biblioteket.

Positivitet for en markør i én celle kan være vanskelig å finne ut om den flekker/fluorescensen er svak. Kontrollen negative inkludert i hvert eksperiment er en god måte å finne en terskel av positivitet.

I kombinert programvaren brukes til å analysere bilder en scoring trinn for å bestemme positivitet i cellen finnes, men det bare kan analysere to markørene samtidig. Fordi vi kan ha tre flekker på samme celle (CD8, PD-1 og Tim-3), vi valgte phenotyping trinnet.

Phenotyping-trinn kan være arbeidskrevende, spesielt hvis flekker og bakgrunnen er variabel fra ett utvalg til et annet.

Begrensninger av teknikken:

Selv om co-stainings er en fordel i forhold til konvensjonelle fluorescens, er det ikke mulig å analysere mange farger som flowcytometri. Spesielt når colocalization av flere markører er undersøkt, være klar for følsomhet som er lavere sammenlignet med AC confocal mikroskopi (for en 20 x mikroskop forstørrelse, ca 0,5 µm versus 0,1 µm per piksel for AC confocal, avhengig av merke) og Sjekk for fluorophore smitteeffekter (se avgjørende skritt i the protokollen, nedenfor).

En stor begrensning av teknikken er formatet som rådata. Rådata er txt-filer som kan være vanskelig å bruke. Programvaren gir en txt fil per bilde med CI for fenotypen, er manuell behandling av hver av de 5 filene per pasient av en stor serie svært arbeidskrevende. Bioinformatikk spesialist må beregne alle dataene i en statistisk programvare.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder:

Multiplex flekker analyse er lett mulig. Sammenlignet med flowcytometri, som analyserer fersk eksempler, kan denne teknikken en rask teller i en reproduserbar metode for ulike celle delsett i svulst microenvironment, i store kohorter av frosne prøvene med en automatisert prosedyre26 ,27. Vi kan automatisk regne infiltrere CD8+ T celler uttrykke PD-1 og co uttrykke Tim-3 i innstillingen av RCC. Automatisk telling unngår flere fordommer som øye tretthet og ikke-reproduserbar teller, og er ikke tidkrevende.

Som den store kohorten studerte var på frosne utvalg, hadde vi retrospektive data slik at vi kan koble den absolutte tall eller andelen av CD8+ T celle delsett med biologiske parametere og klinisk resultat. Det er en viktig heterogenitet immun infiltrasjon fra en pasient til en annen28, representerer dette en fordel i forhold til fluorocytometry som rapporterer bare MFI og prosent men ikke infiltrasjon karakteren.

Fluorescens intensiteten rapporteres kvantitativt for hver celle, og de ulike celle avdelinger (membran/cytoplasma/kjerner), kan vi vurdere nivået på PD-1 farging av MFI på membranen. Dette representerer en annen interessant verktøy som ligner på flowcytometri. Vi fant ut at PD-1+ CD8+ T celler uttrykke Tim-3 hadde høyere uttrykket av PD-1 og var assosiert med en dårlig prognose (innvirkning på progresjon-fri overlevelse). Vi vet er det den første studien benytter denne metoden som viser en klinisk betydning av en bestemt celle delsett.

Fremtidige programmer:

Bruksområde er enorm. Vi har også markert i lunge kreft svulsten microenvironment en bestemt celle delsett: vev bosatt minne T celler kalt TRM (CD103+ CD49a+), og de er korrelert med en bedre total overlevelse21,29 ,30. I et annet verk bruker denne teknikken, vårt team fant at PD-L1 var overexpressed på tumorceller i en undertype av lungekreft med en anaplastisk lymfom kinase (ALK) omorganisering, og denne uttrykket ble korrelert med CD8+ T infiltrere10. Denne teknikken er egnet for vurdering av kritiske biologiske parametere i flere sammenhenger og kan representere et verdifullt verktøy for biomarkør oppdagelsen. Siden xy-koordinater er gitt, er det en av de første verktøyene å studere topografi og celle/celle interaksjon med letthet31.

Avgjørende skritt i protokollen:

En av de viktige trinnene er optimalisering av co farging, som kan være tidkrevende. Valget av en fint antistoffet er avgjørende, for eksempel flere kloner har blitt testet for Tim-3 i den foreliggende sak. Videre kan ulike fluorophores for den samme markøren gi forskjellige resultater så det er viktig å prøve flere kombinasjoner. Undersøke flekker spesifisitet med antistoffer som ikke bør reagerer sammen anbefales. Til tross for muligheten til å analysere flere fluorophores samtidig, anbefales se etter ekstra med mono-farget lysbildene. Et annet viktig skritt er phenotyping skritt som manuell trening utføre nøye.

Totalt representerer bruk av denne multiplex teknikken av en dyktig operatør en elegant verktøy for å analysere flere celle undergrupper av den lokale immun infiltrere, som er av betydning siden perifert blod analyse kan være representant for lokale svulst miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har ingen konflikt av interesse å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Institut nasjonale du kreft (INCA) (ET) Ligue contre le kreft (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-onkologi (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG ble finansiert av et fellesskap av Fondation bue. EV og CD ble finansiert av et fellesskap av APHP (bourse année recherche). Les er finansiert av et fellesskap av Université Sorbonne Paris Cité (contrat doktorgrad). Forfatterne takker Bristol Myers Squibb for sin finansiering i dette prosjektet. Forfatterne takker Institutt for patologi på Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel og Gisèle Legall). Forfatterne takker Histology plattformen for PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

Immunologi problemet 132 Multiplex i situ multispectral bildebehandling immunofluorescence teknikk digital bildebehandling Nyrecellekarsinom Tim-3 PD-1 svulst microenvironment checkpoint hemmere i situ enkelt celle analyse
Multiplekset Immunofluorescence analyse og måling av Intratumoral PD-1<sup>+</sup> Tim-3<sup>+</sup> CD8<sup>+</sup> T celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter