Summary
Genetiskt kodade luciferas är en populär icke-invasiv reporter av genuttryck. Användning av en automatiserad längsgående luciferas imaging gas - och temperatur-optimerade recorder (ALLIGATOR) gör längsgående inspelning från självlysande celler under en lång rad villkor. Här visar vi hur ALLIGATOR får användas i samband med dygnsrytmen forskning.
Abstract
Luciferas-baserade reportrar av cellulära genuttryck i utbredd användning både längsgående och slutpunkten analyser av biologisk aktivitet. I dygnsrytmen forskning, exempelvis ge klocka genfusioner med firefly luciferas upphov till robust rytmer i cellulära Mareld som kvarstår över många dagar. Tekniska begränsningar i samband med Fotomultiplikatorrör (PMT) eller konventionella mikroskopi-baserade metoder för Mareld kvantifiering har oftast krävt att celler och vävnader bibehållas under ganska icke-fysiologiska förhållanden under inspelning, med en kompromiss mellan sensitivitet och genomströmning. Här redovisar vi en förfining av föregående metoder som möjliggör långsiktiga Mareld imaging med hög känslighet och genomströmning som stöder ett brett utbud av kultur villkor, inklusive rörliga gas och fuktstyrning, och som accepterar många olika vävnadsodling tallrikar och fat. Denna automatiserade längsgående luciferas imaging gas - och temperatur-optimerade recorder (ALLIGATOR) också tillåter observation av rumsliga variationer i luciferas uttryck över en cell enskiktslager eller vävnad som inte snabbt kan iakttas av traditionella metoder. Vi belysa hur ALLIGATOR ger kraftigt ökad flexibilitet för detektion av luciferas aktivitet jämfört med befintliga metoder.
Introduction
Användning av luciferases som reportrar av genuttryck och proteinaktiviteten har blivit en populär teknik i molekylära och cellulära biologi forskning. Detta är sant i fältet dygnsrytm där kineticsen av firefly luciferas syntes och katalytisk inaktivering är särskilt väl lämpade för rapportering de longitudinella förändringarna i genuttryck som uppstår över cirka 24 h dygnsrytm cykeln. Som sådan, är luciferas anställd som en dygnsrytm reporter inom ett brett spektrum av organismer, inklusive svampar, växter, flugor och däggdjur1,2,3,4.
När kvantifiera dygnsrytm gen uttryck i vitro, används ofta ett fotomultiplikatorn röret (PMT) att spela in signalen självlysande. PMT-baserade mätningar har begränsad flexibilitet dock vanligtvis att vara begränsad till en förutbestämd tallrik eller skål storlek. Det går även inte att samla in någon rumslig information från prover som övervakas med hjälp av en PMT, vilket kan leda till en förlust av information när imaging prover som visar rumslig variation i luciferas uttryck. Dessutom som PMT och tillhörande elektronik är benägna till fel när de utsätts för den befuktade miljön i en vanlig cell kultur inkubator, utförs längsgående luciferas inspelning med PMTs alltid i icke-fuktad inkubatorer. Följaktligen, cell kultur rätter måste vara förseglade lufttäta att förhindra vätskeförlust genom avdunstning och kultur media måste därför buffras med 3-(N- morpholino) propanesulfonic syra (moppar) eller 4-(2-hydroxietyl) -1- piperazineethanesulfonic syra (HEPES), i stället för den CO2/bicarbonate buffring system som fungerar på vivo och används rutinmässigt i däggdjur vävnadskultur.
Till följd av dessa begränsningar förlägger mätning av Mareld av PMTs vanligt snäva begränsningar på de villkor under vilka celler upprätthålls under experiment. Att övervinna dessa problem och även att öka utbudet av möjliga försöksbetingelser, använder vi en standard CO2/N2 170 L vävnadsodling inkubator som har anpassats genom tillsats av en vatten-kylda elektron-multiplikation kostnad – tillsammans enhet (elektrisk) kamera med anti mist optik och digital styrning av temperaturen och gas. Detta har kallats en automatiserad längsgående luciferas Imaging Gas och Temperature-Optimized Recorder eller ALLIGATOR. ALLIGATOR möjliggör väsentligen ökad flexibilitet av självlysande imaging, både för hög genomströmning avbildning av standard vävnadsodling plattor (upp till 6 x 96 - eller 384-bra plattor samtidigt) och även för icke-standardiserade vävnadsodling system, sådan som perfunderade celler odlas i ultrakalla enheter. Detta instrument möjliggör också imaging att uppstå befuktade villkor och med steglös reglering av både CO2 O2 partiella tryck samt och temperatur.
Protokollet nedan beskriver en metod för självlysande inspelning av däggdjursceller och vävnadsodling-system som använder en ALLIGATOR (hädanefter benämnd 'Mareld inkubator'). Det bör dock noteras att systemet skulle vara väl lämpad till självlysande imaging och också, med några ändringar, fluorescerande imaging, i ett antal andra biologiska system och sammanhang.
Protocol
1. sådd och temperatur övningsprovet celler
Obs: Detta protokoll har noggrant testats med primära och förevigade mus fibroblaster uttrycka PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) fusion protein4. Justeringar kan behöva göras för experiment med andra cellinjer.
- Innan du påbörjar cellkultur, placera följande i 37 ° C vattenbad att värma: fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,4), PBS kompletteras med 0,68 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt, pH 7,2 (PBS + EDTA), cell lämplig kultur media, t.ex. Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin och 0,25% trypsin lösning.
- Späd trypsin 1:3 med pre värmde PBS + EDTA-lösning och återgå till vattenbadet.
- Ta en 125 cm2 kolv med luciferas-uttryckande celler som är 70-90% konfluenta. Aspirera media. Tillsätt 10 mL före värmde PBS.
- Aspirera PBS. Tillsätt 2,5 mL före värmde trypsin-EDTA och tillbaka kolven till en 37 ° C inkubator för 5 min.
- Ta bort celler från inkubator och Visa under ett mikroskop. När flertalet celler har lösgjort från botten av kolven, fortsätta till nästa steg. Om de flesta celler kvar längst ned i kolven, returnera den till inkubatorn tills de flesta celler är i suspension.
- Lägga till en ytterligare 7,5 mL standard cellodlingsmedium i kolven. Alternativt, ta bort 1 mL av denna för vidare passage av cellerna, som krävs.
- Räkna densiteten av återstående cellerna med hjälp av en hemocytometer och trypan blå. Späd cellerna som lämpliga för den cell-linjen.
Obs: För experimenten nedan seedade PERIOD2::LUC fibroblaster mellan 6 x 103 celler/cm2 och 1 x 104 celler/cm2 i antingen 96 brunnar, 35 mm rätter eller kanal presentationer. - Utsäde celler på vävnadsodling rätter eller plattor som ska användas för inspelning.
Obs: Användning av svart dubbelhäftande, rensa botten plattor rekommenderas eftersom detta tillåter kultur hälsa ska bedömas innan inspelningarna börjar samtidigt minska störningar mellan brunnar under inspelning. Där Mareld är extremt låg, bör vit rätter/plattor användas att maximera ljus upptäckt, men vänligen observera att fosforescens kan leda till ökade bakgrund signal som kvarstår i flera timmar. - Tillbaka plåtarna till inkubatorn och tillåta enskiktslager att nå 100% sammanflödet (cirka 7 dagar).
Obs: När konfluenta, cellinjer som hämmar kontakt kan bibehållas i upp till tre veckor före experimenterande förutsatt att media uppdateras regelbundet (varje 5-7 dagar). - När konfluenta, synkronisera cellulära rytmer med tillämpad temperatur cykler (12 h vid 32 ° C, 12 h vid 37 ° C) för minst 72 h omedelbart före experiment5,6 (använder en förprogrammerad cykling inkubator, kontrolleras av en dator ansluten till inkubatorn via en seriell RS-232-port).
Anmärkning: Antalet temperatur cykler krävs för synkroniseringen av cellulära rytmer kan variera mellan celler rader och kan därför behöva optimeras för andra cellinjer. Akut farmakologisk stimulering använder forskolin eller dexametason har också använts tidigare att synkronisera cellulära rytmer7,8.
2. NS21 beredning
Obs: NS21 är ett serumfritt tillägg för underhåll av neuronala och andra cellkulturer. Det är en förfining av ett liknande tillägg kallas B27, som är kommersiellt tillgängliga och kan användas som ett serum ersättning under dygnsrytm Mareld inspelningar9. Antingen tillägg kan användas omväxlande i inspelningsmediet för de experimentella protokoll som beskrivs nedan. Det är helt möjligt och kostnadseffektivt att göra NS21 in-house, liksom Chen et al. 10, och som beskrivs här.
- Temperera alla komponenter beskrivs i tabell 1 i rumstemperatur i 1 h innan du börjar.
- Lös 50 g bovint albumin i 324 mL basala medium (t.ex., neurobasal) på is. Rör blandningen så lite som möjligt.
- Lägg till alla andra komponenter, omrörning minimalt efter varje komponent men fortfarande säkerställa omsorgsfull blandning. Syfte att upplösa alla komponenter inom 90 min av start.
- Alikvot slutliga blandningen och förvaras vid-20 ° C tills krävs. Undvik upprepad frysning-tining cykler.
Obs: Blandningen är för trögflytande att filtrera i detta skede, men sterila filtreras efter spädning med media innan den läggs till celler.
3. inspelning Media förberedelse
Obs: En primär fördel av Mareld inkubator över annan utrustning för inspelning av längsgående Mareld är att, genom att kunna Fukta inkubatorn och variera partialtrycket av O2 och CO2, det är möjligt att använda ett bredare utbud av media villkor för inspelning Mareld — inklusive villkor som mer ungefärlig nära den fysiologiska nisch som upptas av olika cell typer i vivo. Nedan beskriver vi utformningen av inspelningsmedia anpassad från Hastings et al. 9, som vi har använt rutinmässigt med odlade fibroblaster och andra celltyper. Först är för slutna odlingsbetingelser (utan gas exchange) och andra är för fysiologiskt relevanta förhållanden och bör användas på befuktade villkor med 5% CO2.Många andra varianter är både möjligt och lämpligt, beroende på den exakta applikation och celltyp.
- MOPPAR buffrade hög glukos media förberedelse
Obs: Stamlösning (1 L): DMEM pulver (8,3 g/L), 0,35 mg/mL natriumbikarbonat, 5 mg/mL glukos, 0,02 M moppar, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin.- Lös upp 8,3 g DMEM pulver i 900 mL ultrarent vatten i en 1000 mL mätcylinder och rör för 30 min tills alla partiklar är upplöst.
- Tillsätt 50 mL glukoslösning (100 g/L), 20 mL av moppar (1 M, pH 7,6), 10 mL 100 x penna/strep lösning, och rör i ytterligare 10 minuter.
- Tillsätt 4,7 mL 7,5% natriumbikarbonatlösning och rör i ytterligare 5 minuter.
- Justera media pH 7,6 (om vid rumstemperatur) eller 7,4 (37 ° C) med HCl/NaOH.
- Tillsätt ultrarent vatten för att producera en slutlig volym av 1 000 mL.
- Sterilisera genom filtrering genom ett 0,22 µm filter och förvaras vid 4 ° C tills krävs.
- Innan experiment, komplettera en lämplig volym av utgångslösningen med 10% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 2% NS21, och 1 mM luciferin att göra en fungerande lager. Passera detta bestånd genom ett 0,22 µm sterila filter.
- Mäta osmolalitet som media använder en osmometer.
- Slå på osmometer.
- Kalibrera osmometer, först med ultrarent vatten. Tillsätt 50 µL vatten till botten av en mätkärlet. Se till att det finns inga bubblor i vätskan. Klippa fartyget över sonden. Tryck på 'Zero' och sänk försiktigt osmometer armen till den lägsta punkten. Vänta tills behandlingen är klar och grön 'resultat' lyser innan att höja armen och ta bort fartyget.
- Upprepa för att kalibrera osmometer 300 mOsmol/kg med 50 µL kalibrering standard. Tryck på 'Cal' före sänkning armen.
- Mäta osmolalitet provet genom att lägga 50 µL av media till botten av en mäta fartyget och åtgärd som ovan. Tryck på 'prova' före sänkning osmometer armen.
- Justera osmolalitet till 350 mOsmol med 5 M NaCl.
- HCO3-buffrat låg glukos media (perfusion medium) förberedelse
Obs: Stamlösning (1 L): DMEM pulver (8,3 g/L), 1 mg/mL glukos, 3,7 mg/mL natriumbikarbonat, 100 µg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin.- Lös upp 8,3 g DMEM pulver i 900 mL ultrarent vatten i en 1000 mL mätcylinder och rör för 30 min tills alla partiklar är upplöst.
- Tillsätt 50 mL glukoslösning (100 g/L), 10 mL 100 x penna/strep lösning och rör i ytterligare 10 minuter.
- Tillsätt 49,4 mL 7,5% natriumbikarbonatlösning och rör i ytterligare 5 minuter.
- Justera media pH 7,6 (vid rumstemperatur) eller 7,4 (37 ° C) med HCl/NaOH.
- Tillsätt ultrarent vatten för att ge en slutlig volym av 1 000 mL.
- Passera lösningen genom ett 0,22 µm sterila filter och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
- Innan experiment, komplettera en lämplig volym av stamlösning med 2% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 2% NS21 och 1 mM luciferin att göra en fungerande lager. Passera detta bestånd genom ett 0,22 µm sterila filter.
- Mät och justera osmolalitet till 350 mOsmol med 5 M NaCl, när det gäller moppar buffrade media.
Obs: Luciferin koncentration bör bestämmas empiriskt för varje celltyp och sammanhang. För ytterligare information se Feeney o.a. 11 serum och NS21 (eller B27 om används) koncentrationer kan varieras beroende på applikation. Men rekommenderar vi att, om inte empiriskt testade för att visa på annat sätt, serum och NS21 (eller alternativa serumfritt tillägg) användas, eftersom dessa främjar cellöverlevnad och fastsättning. I cellinjer som inte kontakta hämmar väl, kan det vara nödvändigt att sänka serumkoncentration i inspelningsmediet att förhindra störande effekterna av spridning, som främjas också av serum.
4. inspelning
- Innan du påbörjar inspelningen, placera lämpliga arbetande media beståndet (från steg 3.1 eller 3.2 beroende på experimentet) i 37 ° C vattenbad att värma.
- Medan media uppvärmningen, fokusera kameran i Mareld inkubatorn.
- Skruva loss filtret vatten-impermeable, uppvärmd neutral densitet och ställ åt sidan.
- Ange programvaran för att spela in en video med en hög förvärv. Klicka på ”förvärv | Förvärv Setup ”. Ange 'Exponeringstid' till 0,2 s och kinetiska cykeltid till 0,3 sekunder. Kontrollera att EM vinst är avstängd.
- Stäng fönstret 'Förvärv Setup' och klicka på ikonen ”ta video”.
- Använda fokus cylindern, rotera kameralinsen tills objekt på hyllan på höjden som registreras är tydligt i fokus i videon.
- Stoppa videon genom att klicka på ikonen 'stopp video'.
- Skruva det uppvärmda neutral densitet filtret tillbaka i position; underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i skador på EM-CCD-kamera eller imma av målet på grund av kondensation.
- Ange O2, CO2och temperaturen till önskat experimentella villkoren med hjälp av Kontrollpanelen på framsidan av Mareld inkubatorn.
Obs: Om utför perfunderade cellkultur fortsätta direkt till avsnitt 5 i detta skede. - Ta bort celler från vävnadsodling inkubator och aspirera från media. Byt ut materialet med pre värmde fungerande lager.
- Om Mareld inkubatorn är inte att vara fuktad under experimentet, sedan försegla de rätter och plattor med en gas-impermeable tätning.
Obs: Befuktning uppnås genom att fylla vatten facket vid basen av inkubatorn.
- Klicka på ”förvärv | Förvärv Setup ”.
- I panelen 'Kameran Setup', in: 'Förvärv läge' till 'Kinetic'; 'Exponeringstid' till önskad exponeringstid, i sekunder (se not nedan); 'Ackumulationer' 1; 'Kinetic serie längd' antal förvärv cykler önskas; 'Kinetic cykeltid' till önskat imaging intervall (se till att detta är större än exponeringstiden); 'Flytta hastighet' till 4.33 µsecs; 'Få' 1; och 'EM få ' till önskad nivå (se nedan)
- I panelen 'Autospara' Ange fil-sif eller .tif. Ange ett filnamn och spara läge är lämpligt.
- I panelen 'Buffring' Ange fil-till tiff. Ange ett filnamn och spara läge är lämpligt. Stäng fönstret förvärv.
Obs: Mareld inkubatorn kan användas för ett stort antal olika cell- och vävnadstyper, varav alla har olika nivåer av Mareld, exponeringstiden måste samla in en lämplig självlysande signal varierar mellan experiment. Det är också möjligt att variera det elektron-multiplicera (EM) vinsten på imaging för att öka omfattningen av signalen som samlas in. För nya tillämpningar av okänd ljusstyrka föreslår vi först ta en enda bild med en relativt kort exponeringstid (ca 10 min) utan EM vinst och därefter justera både exponeringstid och EM vinna tills önskad inspelningsförhållanden har varit nått. I de flesta fall är en genomsnittlig signal 10-20% av maximalt möjliga pixel intensiteten för kameran en bra nivå att sikta på. När en lämplig uppsättning inspelning parametrar har nåtts, börja längsgående förvärv av bilder, som beskrivs ovan.
5. perfunderade vävnadsodling (tillval)
Obs: Som beskrivs i inledningen, Mareld inkubatorn är lämplig för avbildning av icke-standardiserade vävnadsodling system. Detta exemplifieras i utvecklingen av ett system för perfunderade cellodling.
- Utsäde cellerna på enda kanal glider med Luer-kontakter med en kanal djup 0,6 eller 0,8 mm, i DMEM med 10% FBS och penna/strep, som beskrivs i avsnitt 1. Gör perfusion media som beskrivs i steg 3,2.
- Före inspelningen, förbereda slangar för krävs perfusion systemet med 1 mm innerdiameter (ID) ETFE slangar och 1 mm I.D. silikon slangar, armbåge, hane och hona Luer beslag, som visas i figur 2A.
Obs: Majoriteten av längden på slangen är ETFE slangar, med 2 cm sektioner av silikon slangar för att ansluta ETFE slangen till Luer beslag, som därefter länka in de kanal bilderna. - Sterilisera slangen genom spolning med 70% etanol, följt av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Ta bort cellkulturer i kanal-bilder från inkubatorn. Aspirera media och ersätta med pre värmde perfusion media.
- Fyll en 20 mL spruta med pre värmde perfusion media.
- Anslut slangen till bufferten Skjut (se figur 2) men inte till den cell som innehåller bilden, och spola på slangen och skjut med perfusion media (3-5 mL).
- Anslut den cell som innehåller bilden och spola hela systemet med ytterligare 1 mL för media att ta bort eventuella luftbubblor.
- Överför hela systemet till Mareld inkubatorn.
- Passar media-fyllda sprutorna på sprutan pump utan att koppla bort från slangen och spola ytterligare 1 mL media genom hela systemet med hjälp av pumpen så det är inga luftbubblor i systemet.
- Ange diameter på pumpen som sprutan används.
Obs: För 20 mL sprutor används här, diametern är 19,13 mm. - Ställa in flödet klassar av pumpen till 50 µL/h och starta igång.
- Se till att det finns inga bubblor i alla diabilder eller slangar före start av inspelning, som dessa kommer att påverka luciferas uttryck när de passerar över den cell enskiktslager. Om nödvändigt, spola ytterligare media över cellerna för att uppnå detta.
- Stäng luckan till Mareld inkubator och fortsätta som i steg 4,7 inspelningen ska börja.
6. behandling under inspelning
Obs: Ibland är det önskvärt att behandla celler halvvägs genom en inspelning, vara det med farmakologisk eller hormonell agenter. I sådana fall är det absolut nödvändigt att cellerna hanteras med omsorg för att förhindra cellulära svängningen från återställa under behandling. Av denna anledning är det särskilt viktigt att cellerna hålls vid en konstant temperatur, eftersom detta är en större entraining cue för cellulära dygnsrytmen5,6.
- Förbereda alla komponenter i behandling före stoppa inspelning.
- Förbereda en kemisk isotermiska pad vid 37 ° C.
- Stoppa inspelningen enheten, ta bort rätterna för att behandlas och placera på isotermiska värme pad.
- Behandla kulturerna som krävs och återvändande till Mareld inkubatorn på samma plats som innan.
- Starta inspelning.
7. analys
Obs: Mareld inkubatorn producerar uppgifter i form av en serie enskilda bilder.Vi använder primärt Fiji12 för att hantera dessa bilder och sedan exportera genomsnittlig pixeldata intensitet för varje region-of-intresse (ROI) för ytterligare analys.
- Öppna bildstapel i Fiji och justera ljusstyrkan och kontrasten genom att klicka på ”bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast ”och justera de glidande barerna tills bilderna är inom ett relevant område för visning av självlysande signalen.
- Välj intresseområden med ROI manager tillgänglig under ”analysera | Verktyg | ROI Manager ”.
- Exportera genomsnittlig signal för det valda området genom att klicka på ”ROI manager | Mer | Multimeasure ”.
- Kopiera resulterande data till analysprogram.
- Justera manuellt tid basen av data till tidmellanrummet av imaging, (dvs, 15, 30 eller 60 minuters mellanrum, beskrivs som 0,25, 0,5 eller 1 h) i stället för att bildnumret som tillhandahålls av Fiji.
Obs: Ytterligare analys kan nu utföras, såsom bestämning av perioden. Detta, används följande ekvation för att utföra icke-linjär regressionsanalys:
där y är signalen, x motsvarande tiden, m är lutningen av trendlinjen, c är skärningspunkt med y i trendkurvan, amplitud är höjden på toppen av vågformen ovan trendlinjen, k är konstanten förfall eller graden av dämpning (så att 1 /k är halveringstiden), fas är förändring i x av cosinus våg och perioden är den tid det tar för en komplett cykel inträffar13. R2 värdet används som en indikator på godhet-av-fit. Andra analysmetoder är också möjliga. De första 24 h av förvärvet bör uteslutas från analys, eftersom cellulär bioluminesence kan uppvisa övergående, icke-dygnsrytm förändringar under denna tid. Detta är resultatet av en akut reaktion till media förändring.
Representative Results
Denna artikel beskriver ett protokoll för den självlysande avbildning av däggdjursceller med en ALLIGATOR (Mareld inkubator). Denna teknik möjliggör flexibilitet av fysiska installationen och extracellulära villkor när självlysande bildsystem. Metoder för både enkla statiska vävnadsodling (figur 1, kompletterande Video 1) och perfunderade cellkultur (figur 2, kompletterande Video 2) beskrivs, men många andra uppställningar kan avbildas med detta system. Alla data kvantifierades enligt de metoder som beskrivs i avsnitt 7.
Figur 1A visar ett exempel video av en Mareld inspelning från 6 x 96 brunnar innehållande PER2::LUC fibroblaster4. Yttersta brunnarna innehåller inte celler som dessa inte behövdes för detta experiment. Celler har genomgått differenstemperatur övningsprovet, whereby de genomgår antingen temperaturcykel 12 h, vid 32 ° C följt av 12 h 37 ° C i 72 h eller converse (12 h, vid 37 ° C följt av 12 h, vid 32 ° C i 72 h), innan hålls vid konstant 37 ° C för inspelning. 60 min exponeringar togs varje timme. Två av dessa villkor är kvantifierade i figur 1B.
Figur 2A visar en schematisk bild av installationen av ett system för perfunderade vävnadskultur. Denna består av två kanal bilder ansluten med slang. Media drivs över cellerna av en sprutpump. Först av dessa bilder fungerar som en gas permeabla bubbelfälla (buffert bild) och innehåller inga celler, med andra som innehåller celler som Mareld registreras. En representant som spelar in video från detta system visas i figur 2B. 15 min exponeringar togs varje 15 min. Här, upprätthålls celler antingen standard perfusion villkor eller i närvaro av kasein tyrosinkinashämmare PF670462, som tidigare har visat sig förlänga dygnsrytm period och minska amplituden av klocka gen uttryck rytmer i odlade däggdjursceller14. Effekten på PER2::LUC uttryck visas i figur 2 c (övre panelen) mot celler behandlas med samma koncentration av läkemedlet enligt standard statiska cell kultur villkor visas i figur 2 c (nedre panelen), kvantifiering av period visas i figur 2D. Det är framgår av detta att behandling med PF670462 påverkar PER2::LUC uttryck under båda uppsättningar av förhållanden. Men medan celler behandlas med PF670462 under perfunderade villkor Visa period förlängning av cirka 3 h (3 ±0.9 h), celler i statiskt tillstånd som behandlas med läkemedlet visar betydligt större period förlänga en period av > 48 h. Detta kan passa av en dämpad cosinus, som beskrivs i avsnitt 7 (extra-sum-av-torg F testa jämfört med en rak linje, p < 0,0001). Omfattningen av perioden förlängs under perfusion är intressant, mycket närmare som observerats i vivo14.
Figur 1: Data exempel. (A) exempel ögonblicksbild av Mareld från förevigade PER2::LUC i 6 x 96 väl plattor i Mareld inkubatorn. Brunnar till kvantifieras har lyfts i gult i kompletterande Video 1. (B) kvantifiering av Mareld från A. Två uppsättningar av 3 plattor av celler var fångas upp med hjälp av temperatur-cykler (12 h, vid 32 ° C, 12 h, vid 37° C) som var anti phasic till varandra för att producera mittemot faser av PER2 proteinuttryck (n = 6, menar ± SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Perfusion med CK1δ hämmare. (A) Schematisk bild av perfusion system. (B) exempel ögonblicksbild av en Mareld inspelning från PER2::LUC celler under perfusion. Ett prov område rapporteringsgräns markeras i gult. (C) kvantifiering av mareld i PER2::LUC fibroblaster under perfusion och under statiska förhållanden med och utan 3 µM CK1 hämmare PF670462 (n = 3, menar ± SEM). Mareld har varit normaliserad till lägsta och högsta värden. (D) analys av perioden (dubbelriktad ANOVA, Holm-Sidaks flera jämförelser test).Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Komponent | Medelstora slutkoncentration (μM) | Lager (mg/mL) | För 400 mL NS21 |
| Bovint Albumin | 37 | - | 50 g |
| Katalas | 0,01 | - | 50 mg |
| Glutation | 3.2 | - | 20 mg |
| Insulin | 0,6 | 10 | 8 mL |
| Superoxiddismutas | 0.077 | - | 50 mg |
| Holo-transferrin | 0.062 | - | 100 mg |
| T3 (triiodo-L-thyronine) | 0,0026 | 2 | 20 ΜL |
| L-karnitin | 12 | - | 40 mg |
| Etanolamin | 16 | Vätska (1 g/ml) | 20 ΜL |
| D (+)-galaktos | 83 | - | 300 mg |
| Dimetylsulfat | 183 | - | 322 mg |
| Natrium selenit | 0,083 | 1 | 280 ΜL |
| Kortikosteron | 0,058 | 2 | 0,2 mL |
| Linolsyra | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Linolensyra | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Liponsyra | 0,2 | 4.7 | 0,2 mL |
| Progesteron | 0,02 | 3.2 | 0,04 mL |
| Retinol acetat | 0,2 | 20 | 0,1 mL |
| Retinol, alla trans | 0,3 | 10 | 0,2 mL |
| D, L-alfa-tokoferol | 2.3 | 100 | 0. 2 mL |
| D, L-alpha-tokoferol acetat | 2.1 | 100 | 0,2 mL |
Tabell 1: NS21 beredning.
Kompletterande Video 1: exempel video av Mareld från plattor med. Exempel ögonblicksbild av Mareld från förevigade PER2::LUC i 6 x 96 plattor i Mareld inkubatorn. Brunnar till kvantifieras markeras i gult. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Video 2: exempel ögonblicksbild av en Mareld inspelning från PER2::LUC celler under perfusion. Ett prov område rapporteringsgräns markeras i gult. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Protokollet beskrivs här är för däggdjursceller kultur, båda perfunderade och statiska villkor. ALLIGATOR kan dock enkelt anpassas till andra modellsystem. Faktiskt, det har redan visat att ge en utmärkt plattform för samtidig övervakning av förflyttning, sömn och perifera gen uttryck rytmer i Drosophila melanogaster underhålls under konstant mörker15. Det noteras också att, beroende på applikation, kamera typer än de som nämns här kan vara lämpligt. Vi tänka oss att med lämpliga filter, en modifierad version av den nuvarande setup kan i princip användas för fluorescens kvantifiering.
De enda program som ALLIGATOR inte kanske är lämpligt är de för vilka särskilt hög rumslig upplösning krävs, t ex imaging spatiotemporal organisationen av PER2::LUC uttryck i organotypic skivor av däggdjurs suprachiasmatiska kärnan, eller andra små vävnad skivor.
ALLIGATOR möjliggör många experiment kan utföras som hittills inte har lätt uppnås genom konventionella inspelning tekniker. Jämfört med nuvarande metoder för mätning av Mareld, ger ALLIGATOR ökad flexibilitet i både typ av cell kultur maträtt eller bild som kan användas, externa media villkor, känslighet och processivity.
Detta är särskilt relevant i en tid när det finns en övergång från vanlig 2D cell kultur modeller mot 3D organoid och flöde kultur-system. Som sådan, förväntas det att ALLIGATOR ger en anpassningsbar metod genom vilken Mareld kan mätas över många dagar och veckor under en rad villkor.
Disclosures
Inga intressekonflikter finns.
Acknowledgments
Vi vill tacka stenröse forskning för att arbeta med oss för att utveckla detta system, i synnerhet Mark Henson, Jeremy Graham och Joao Correia. Vi tackar också David Walesiska och Mirre Reddy för värdefull diskussion under konstruktionsfasen, samt Peter Laskey (tidigare i Hamamatsu) för att ordna lån av en demo kamera och David Wong för hans kritiska bidrag till manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
| Catalase | Sigma | C40 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | |
| Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
| Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
| T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
| L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
| Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
| D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
| Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
| D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
| D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
| Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM powder | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
| Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
| Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
| Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
| µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
| PF670462 | Sigma | SML0795 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
| Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
| 300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
| Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
| Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
| NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis Software | Andor | N/A |
References
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
- Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
- Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
- Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
- Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
- Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759 (2016).
