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Biology

एक स्वचालित अनुदैर्ध्य Luciferase इमेजिंग गैस का उपयोग कर Bioluminescent पत्रकारों की लचीली माप-और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर (मगरमच्छ)

Published: December 13, 2017 doi: 10.3791/56623
Automatic Translation
1, 1, 1
1MRC Laboratory of Molecular Biology

Summary

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग luciferase जीन अभिव्यक्ति की एक लोकप्रिय गैर इनवेसिव रिपोर्टर है । एक स्वचालित अनुदैर्ध्य luciferase इमेजिंग गैस का उपयोग करें-और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर (मगरमच्छ) शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत bioluminescent कोशिकाओं से अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है । यहां हम बताते है कि कैसे मगरमच्छ circadian लय अनुसंधान के संदर्भ में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

Luciferase-सेलुलर जीन अभिव्यक्ति के पत्रकारों आधारित दोनों अनुदैर्ध्य और अंत में जैविक गतिविधियों की बात परख के लिए व्यापक उपयोग में हैं । circadian लय अनुसंधान में, उदाहरण के लिए, जुगनू luciferase के साथ घड़ी जीन संलयन सेलुलर bioluminescence में मजबूत लय को जंम दे कि कई दिनों से अधिक रहती है । photomultiplier ट्यूबों (पीएमटी) या bioluminescence ठहराव के लिए पारंपरिक सूक्ष्म आधारित तरीकों के साथ जुड़े तकनीकी सीमाओं आमतौर पर मांग की है कि कोशिकाओं और ऊतकों के दौरान काफी गैर शारीरिक स्थितियों के तहत बनाए रखा जा एक व्यापार के साथ रिकॉर्डिंग, संवेदनशीलता और प्रवाह के बीच बंद । यहां, हम पहले तरीकों की एक परिशोधन की रिपोर्ट है कि उच्च संवेदनशीलता और प्रवाह जो संस्कृति की स्थिति का एक व्यापक रेंज का समर्थन करता है के साथ दीर्घकालिक bioluminescence इमेजिंग की अनुमति देता है, चर गैस और आर्द्रता नियंत्रण सहित, और है कि कई अलग स्वीकार टिशू कल्चर प्लेट्स और डिश । यह स्वचालित अनुदैर्ध्य luciferase इमेजिंग गैस-और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर (मगरमच्छ) भी luciferase अभिव्यक्ति में एक सेल monolayer या ऊतक है, जो आसानी से पारंपरिक द्वारा मनाया नहीं जा सकता भर में स्थानिक रूपांतरों के अवलोकन की अनुमति देता है विधियों. हम पर प्रकाश डाला कैसे मगरमच्छ luciferase गतिविधि का पता लगाने के लिए काफी वृद्धि हुई लचीलापन प्रदान करता है जब मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में ।

Introduction

जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिविधि के संवाददाताओं के रूप में luciferases का उपयोग आणविक और सेलुलर जीवविज्ञान अनुसंधान में एक लोकप्रिय तकनीक बन गया है. यह circadian क्षेत्र में सच है, जहां जुगनू luciferase संश्लेषण और उत्प्रेरक निष्क्रियण के कैनेटीक्स विशेष रूप से अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति में अनुदैर्ध्य परिवर्तन है कि लगभग 24 एच circadian चक्र पर हो रिपोर्टिंग के लिए अनुकूल हैं । जैसे, luciferase कवक, पौधों, मक्खियों सहित जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक circadian रिपोर्टर के रूप में कार्यरत है, और स्तनधारी1,2,3,4।

जब विट्रो मेंcircadian जीन अभिव्यक्ति बढ़ाता है, एक photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) सामांयतः bioluminescent संकेत रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है । PMT-आधारित माप सीमित लचीलापन है, हालांकि, आमतौर पर एक पूर्व निर्धारित प्लेट या डिश आकार करने के लिए प्रतिबंधित किया जा रहा. यह भी एक PMT का उपयोग कर निगरानी नमूनों से किसी भी स्थानिक जानकारी एकत्र करने के लिए संभव नहीं है, जो luciferase अभिव्यक्ति में स्थानिक भिन्नता दिखाने इमेजिंग नमूने जब जानकारी की हानि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, के रूप में पीएमटी और जुड़े इलेक्ट्रॉनिक्स खराबी जब एक मानक सेल संस्कृति मशीन के humidified वातावरण को उजागर, अनुदैर्ध्य luciferase PMTs का उपयोग कर रिकॉर्डिंग हमेशा गैर में किया जाता है-humidified परिणाम में, सेल संस्कृति व्यंजन हवा बंद किया जाना चाहिए-वाष्पीकरण के माध्यम से नमी घटाने को रोकने के लिए तंग और संस्कृति मीडिया इसलिए 3 के साथ बफर होना चाहिए-(N-morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS) या 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) के बजाय कं2/bicarbonate बफ़रिंग प्रणाली है कि vivo में कार्य करता है और स्तनधारी ऊतक संस्कृति में नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है ।

इन सीमाओं का एक परिणाम के रूप में, PMTs द्वारा bioluminescence के माप आमतौर पर शर्तों के तहत जो कोशिकाओं प्रयोगों के दौरान बनाए रखा है पर तंग प्रतिबंध रखता है । इन समस्याओं को दूर करने के लिए, और भी संभव प्रयोगात्मक शर्तों की सीमा बढ़ाने के लिए, हम एक मानक सह2/N2 १७० एल ऊतक संस्कृति मशीन है कि एक पानी ठंडा इलेक्ट्रॉन के अलावा द्वारा अनुकूलित किया गया है का उपयोग करें-गुणा आरोप-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा विरोधी धुंध प्रकाशिकी और तापमान और गैस के स्तर के डिजिटल नियंत्रण के साथ । यह एक स्वचालित अनुदैर्ध्य Luciferase इमेजिंग गैस और तापमान अनुकूलित रिकॉर्डर, या मगरमच्छ करार दिया गया है । मगरमच्छ bioluminescent इमेजिंग की काफी वृद्धि हुई लचीलेपन के लिए अनुमति देता है, दोनों मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों के उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए (अप करने के लिए 6 x ९६-या ३८४ अच्छी तरह से एक साथ प्लेटें) और भी गैर के लिए मानक ऊतक संस्कृति प्रणालियों, ऐसे के रूप में perfused कोशिकाओं microfluidic उपकरणों में उगाया । इस उपकरण भी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है humidified शर्तों के तहत होने के लिए और दोनों सह के चर नियंत्रण के साथ2 और हे2 आंशिक दबाव के रूप में अच्छी तरह से तापमान ।

नीचे प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल और ऊतक संस्कृति प्रणालियों के bioluminescent रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन एक मगरमच्छ का उपयोग कर (इसके बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए ' bioluminescence मशीन ') । यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि प्रणाली अच्छी तरह से bioluminescent इमेजिंग के लिए अनुकूल होगा और भी, कुछ संशोधन के साथ, फ्लोरोसेंट इमेजिंग, अंय जैविक प्रणालियों और संदर्भों की एक संख्या में ।

Protocol

1. सीडिंग और तापमान Entrainment कोशिकाओं

नोट: इस प्रोटोकॉल है कड़ाई से प्राथमिक और नश्वर माउस PERIOD2 व्यक्त fibroblasts का उपयोग कर परीक्षण किया गया है:: LUCIFERASE (PER2:: ल्यूक) फ्यूजन प्रोटीन4। अंय कक्ष रेखाओं के उपयोग से किए जाने वाले प्रयोगों के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है ।

  1. सेल संस्कृति शुरुआत करने से पहले, एक ३७ ° c पानी स्नान में निंनलिखित जगह गर्म करने के लिए: फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) (पीएच ७.४), पंजाब ०.६८ mM ethylenediaminetetraacetic एसिड के साथ पूरक, पीएच ७.२ (पंजाबियों + EDTA), उपयुक्त सेल संस्कृति मीडिया, उदा, Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin, और ०.२५% trypsin समाधान के साथ पूरक है ।
  2. पतला पूर्व गर्म पंजाबियों के साथ trypsin 1:3 + EDTA समाधान और पानी स्नान के लिए वापस ।
  3. luciferase-व्यक्त कोशिकाओं है कि 70-90% धाराप्रवाह है की एक १२५ सेमी2 कुप्पी ले लो । मीडिया को महाप्राण । 10 मिलीलीटर पूर्व गरम पंजाब जोड़ें ।
  4. पंजाबियों को महाप्राण । जोड़ें २.५ एमएल पूर्व गरम trypsin-EDTA और 5 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए कुप्पी वापस ।
  5. एक खुर्दबीन के नीचे मशीन और देखने से कोशिकाओं को हटा दें । एक बार कोशिकाओं के बहुमत कुप्पी के नीचे से अलग है, अगले कदम के लिए जारी है । यदि अधिकांश कोशिकाएं कुप्पी के नीचे से जुड़ी रहती हैं, तो अधिकांश कोशिकाओं के निलंबन में होने तक इसे मशीन में वापस कर दें ।
  6. कुप्पी के लिए मानक सेल संस्कृति माध्यम के एक और ७.५ मिलीलीटर जोड़ें । वैकल्पिक रूप से, आवश्यक के रूप में कोशिकाओं के आगे बीतने के लिए इस के 1 मिलीलीटर निकालें ।
  7. एक hemocytometer और trypan नीले रंग का उपयोग कर शेष कोशिकाओं के घनत्व गिनती । कक्षों को आगे, उस कक्ष पंक्ति के लिए उपयुक्त के रूप में पतला करें ।
    नोट: नीचे दिए गए प्रयोगों के लिए, PERIOD2:: ल्यूक fibroblasts 6 x 103 कोशिकाओं/सेमी2 और 1 x 104 कोशिकाओं/सेमी2 में या तो ९६-well प्लेट्स, ३५ mm व्यंजन, या चैनल स्लाइड के बीच वरीयता प्राप्त थे ।
  8. ऊतक संस्कृति व्यंजन या प्लेटों कि रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पर बीज कोशिकाओं ।
    नोट: काले तरफा, स्पष्ट-तली हुई प्लेटों के उपयोग की सिफारिश की है के रूप में यह संस्कृति स्वास्थ्य रिकॉर्डिंग के दौरान कुओं के बीच हस्तक्षेप को कम करने के लिए रिकॉर्डिंग whilst शुरू से पहले मूल्यांकन किया जा करने की अनुमति देता है । जहां bioluminescence स्तर बेहद कम हैं, सफेद व्यंजन/प्लेटों प्रकाश का पता लगाने को अधिकतम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, हालांकि कृपया ध्यान दें कि phosphorescence कई घंटे के लिए बनी हुई है कि बढ़ पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  9. मशीन के लिए प्लेटें लौटें और monolayers १००% संगम (लगभग 7 दिन) तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: एक बार धाराप्रवाह, सेल लाइनों है कि संपर्क को बाधित करने के लिए तीन सप्ताह के लिए प्रयोग से पहले प्रदान की है कि मीडिया को नियमित रूप से ताजा (हर 5-7 दिन) किया जाता है बनाए रखा जा सकता है ।
  10. एक बार धाराप्रवाह, लागू तापमान चक्र का उपयोग सेलुलर लय सिंक्रनाइज़ (३२ डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12 ज) तुरंत प्रयोग से पहले ७२ h की एक न्यूनतम के लिए5,6 (एक पूर्व क्रमादेशित सायक्लिंग मशीन का उपयोग कर, एक द्वारा नियंत्रित कंप्यूटर एक सीरियल रुपये के माध्यम से मशीन से जुड़ा-२३२ बंदरगाह) ।
    नोट: सेलुलर लय के तुल्यकालन के लिए आवश्यक तापमान चक्र की संख्या कोशिकाओं लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं और इसलिए अन्य सेल लाइनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. तीव्र औषधीय उत्तेजना forskolin या डेक्समेतएसॉनी का उपयोग भी पहले सेलुलर लय7,8सिंक्रनाइज़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

२. NS21 तयारी

नोट: NS21 के रखरखाव के लिए एक सीरम मुक्त पूरक है और अंय कोशिका संस्कृतियों । यह एक समान पूरक B27, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और circadian bioluminescence रिकॉर्डिंग9के दौरान एक सीरम प्रतिस्थापन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में जाना जाता है की एक परिशोधन है । या तो पूरक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल नीचे वर्णित के लिए रिकॉर्डिंग मीडिया में interchangeably इस्तेमाल किया जा सकता है । यह काफी संभव है और लागत के लिए NS21 में घर बनाने के लिए प्रभावी है, के रूप में चेन एट अल । 10, और जैसा कि यहां बताया गया है ।

  1. Equilibrate सभी घटकों के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए शुरू करने से पहले 1 में वर्णित.
  2. बर्फ पर ३२४ मिलीलीटर बेसल मध्यम (उदा., neurobasal) में ५० ग्राम गोजातीय एल्ब्युमिन को भंग करें । मिश्रण हलचल के रूप में संभव के रूप में कम ।
  3. प्रत्येक घटक के बाद न्यूनतम सरगर्मी, लेकिन अभी भी पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने, अन्य सभी घटकों को जोड़ें । उद्देश्य शुरू करने के ९० मिनट के भीतर सभी घटकों को भंग करने के लिए ।
  4. Aliquot अंतिम मिश्रण और की दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस आवश्यक जब तक । दोहराया फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
    नोट: इस स्तर पर फिल्टर करने के लिए मिश्रण भी चिपचिपा है, लेकिन यह कोशिकाओं को जोड़ने से पहले मीडिया के साथ पतला जब फ़िल्टर बाँझ हो जाएगा.

3. रिकॉर्डिंग मीडिया की तैयारी

नोट: अनुदैर्ध्य bioluminescence रिकॉर्डिंग के लिए अंय उपकरणों पर bioluminescence मशीन का एक प्राथमिक लाभ यह है कि, के आधार पर करने के लिए मशीन humidify कर रहा है और ओ2 और CO2के आंशिक दबाव भिंन है, यह है bioluminescence रिकॉर्डिंग के लिए मीडिया की स्थिति की एक व्यापक श्रेणी का उपयोग करने के लिए संभव-स्थितियों जिसमें अधिक बारीकी से शारीरिक आला vivo मेंविभिंन प्रकार के सेल के द्वारा कब्जा कर लिया शामिल है । नीचे हम रिकॉर्डिंग मीडिया के निर्माण की जल्दबाजी एट अल से अनुकूलित वर्णन । 9, कि हम प्रसंस्कृत fibroblasts और अंय प्रकार के सेल के साथ नियमित रूप से इस्तेमाल किया है । पहले सील संस्कृति की स्थिति के लिए है (गैस विनिमय के बिना), और दूसरा शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिस्थितियों के लिए है और 5% CO2के साथ humidified शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।कई अंय रूपांतरों दोनों संभव है और उचित, सटीक अनुप्रयोग और सेल प्रकार के आधार पर कर रहे हैं ।

  1. MOPS-बफ़र्ड उच्च ग्लूकोज मीडिया की तैयारी
    नोट: स्टॉक समाधान (1 l):D मेम पाउडर (८.३ g/l), ०.३५ मिलीग्राम/एमएल सोडियम बिकारबोनिट, 5 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज, ०.०२ M MOPS, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin ।
    1. ९०० मिलीलीटर में ८.३ ग्राम DMEM पाउडर को भंग करें एक १,००० मिलीलीटर में ultrapure पानी सिलेंडर को मापने और 30 मिनट के लिए हलचल जब तक सभी कणों को भंग कर रहे हैं ।
    2. ग्लूकोज समाधान की ५० मिलीलीटर (१०० g/L), MOPS के 20 मिलीलीटर (1 M, pH ७.६), 100x पेन के 10 मिलीलीटर/strep समाधान, और एक और 10 मिनट के लिए हलचल जोड़ें ।
    3. जोड़ें ४.७ मिलीलीटर ७.५% सोडियम बिकारबोनिट समाधान और एक और 5 मिनट के लिए हलचल ।
    4. ७.६ (यदि कमरे के तापमान पर) या ७.४ (३७ ° c) के साथ एचसीएल/NaOH के लिए मीडिया पीएच समायोजित करें ।
    5. १,००० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा का उत्पादन करने के लिए ultrapure पानी जोड़ें ।
    6. एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर की आवश्यकता तक ।
    7. प्रयोग करने से पहले, 10% सीरम, 2mM l-alanyl-l-glutamine, 2% NS21, और एक काम कर स्टॉक बनाने के लिए 1 मिमी luciferin के साथ शेयर समाधान की एक उचित मात्रा के पूरक । एक ०.२२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से इस शेयर दर्रा ।
    8. एक osmometer का उपयोग कर मीडिया के परासरणीयता उपाय ।
      1. osmometer को चालू करें ।
      2. osmometer, ultrapure पानी के साथ पहले जांचना । एक मापने पोत के नीचे करने के लिए ५० µ l पानी जोड़ें । सुनिश्चित करें कि तरल में कोई बुलबुले हैं । जांच पर पोत क्लिप । प्रेस ' शूंय ' और ध्यान से निंनतम बिंदु को osmometer हाथ कम है । पढ़ने तक रुको और पूरा हरा ' परिणाम ' प्रकाश हाथ उठाने और पोत को हटाने से पहले जलाया जाता है ।
      3. दोहराएँ करने के लिए osmometer ३०० mOsmol/kg ५० µ l अंशांकन मानक का उपयोग कर. बांह कम करने से पहले ' Cal ' दबाएं ।
      4. एक मापने पोत और माप के नीचे के रूप में मीडिया के ५० µ एल जोड़कर नमूना परासरणीयता उपाय । प्रेस ' नमूना ' osmometer हाथ कम करने से पहले ।
    9. 5 M NaCl का उपयोग कर ३५० mOsmol को परासरणीयता समायोजित करें ।
  2. HCO3-बफर कम ग्लूकोज मीडिया (छिड़काव माध्यम) की तैयारी
    नोट: स्टॉक समाधान (1 l): DMEM पाउडर (८.३ g/l), ३.७ मिलीग्राम/एमएल सोडियम बिकारबोनिट, 1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin ।
    1. ९०० मिलीलीटर में ८.३ ग्राम DMEM पाउडर को भंग करें एक १,००० मिलीलीटर में ultrapure पानी सिलेंडर को मापने और 30 मिनट के लिए हलचल जब तक सभी कणों को भंग कर रहे हैं ।
    2. जोड़ें ५० ग्लूकोज समाधान की मिलीलीटर (१०० g/L), 100x पेन के 10 मिलीलीटर/strep समाधान और एक और 10 मिनट के लिए हलचल ।
    3. जोड़ें ४९.४ मिलीलीटर ७.५% सोडियम बिकारबोनिट समाधान और एक और 5 मिनट के लिए हलचल ।
    4. ७.६ (कमरे के तापमान पर) या ७.४ (३७ डिग्री सेल्सियस) के लिए एचसीएल/NaOH के साथ मीडिया पीएच समायोजित करें ।
    5. १,००० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा देने के लिए ultrapure पानी जोड़ें ।
    6. एक ०.२२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से समाधान पास और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान का उपयोग तक.
    7. प्रयोग करने से पहले, 2% सीरम, 2 मिमी l-alanyl-l-glutamine, 2% NS21 और 1 मिमी luciferin के साथ शेयर समाधान के एक उचित मात्रा के पूरक एक काम कर स्टॉक करने के लिए । एक ०.२२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से इस शेयर दर्रा ।
    8. माप और परासरणीयता को समायोजित करने के लिए ३५० mOsmol का उपयोग कर 5 M NaCl, के रूप में MOPS-बफ़र्ड मीडिया.

नोट: Luciferin एकाग्रता प्रत्येक कोशिका प्रकार और संदर्भ के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । अधिक जानकारी के लिए देखें Feeney एट अल. 11 सीरम और NS21 (या B27 अगर इस्तेमाल किया) सांद्रता आवेदन के आधार पर विविध किया जा सकता है । हालांकि, हम सलाह है कि, जब तक अंयथा दिखाने के लिए परीक्षण empirically, सीरम और NS21 (या वैकल्पिक सीरम मुक्त पूरक) इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में इन सेल अस्तित्व और लगाव को बढ़ावा देने । जो भी सीरम द्वारा पदोंनत किया है प्रसार के प्रभाव को रोकने के लिए रिकॉर्डिंग मीडिया में सीरम एकाग्रता को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि सेल लाइनों में अच्छी तरह से बाधित संपर्क नहीं है ।

4. रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले, उपयुक्त काम कर मीडिया स्टॉक प्लेस (३.१ कदम से या ३.२ प्रयोग पर निर्भर करता है) में एक ३७ ° c पानी के स्नान के लिए गर्म ।
  2. Whilst मीडिया वार्मिंग है, bioluminescence मशीन में कैमरा ध्यान केंद्रित ।
    1. पानी अभेद्य, गर्म तटस्थ घनत्व फिल्टर खोल देना और अलग सेट ।
    2. एक उच्च अधिग्रहण दर के साथ एक वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें । क्लिक करें "अधिग्रहण । अधिग्रहण सेटअप "। ०.२ एस और काइनेटिक चक्र समय ०.३ सेकंड के लिए ' जोखिम समय ' सेट करें । सुनिश्चित करें कि उंहें लाभ बंद कर दिया है ।
    3. ' अधिग्रहण सेटअप ' विंडो बंद करें और "वीडियो लें" आइकन पर क्लिक करे ।
    4. ध्यान देने वाले सिलेंडर का उपयोग करना, कैमरे के लेंस को घुमाना जब तक ऊंचाई पर शेल्फ पर आइटम रिकॉर्ड किया जा करने के लिए वीडियो में ध्यान में स्पष्ट रूप से कर रहे हैं ।
    5. ' वीडियो रोकें ' आइकन पर क्लिक करके वीडियो रोकें.
    6. स्थिति में गर्म तटस्थ घनत्व फिल्टर वापस पेंच; ऐसा करने में विफलता के लिए उन्हें नुकसान में परिणाम होगा-सीसीडी कैमरा और/या फोगिंग के कारण उद्देश्य के फॉगिंग ।
  3. bioluminescence मशीन के मोर्चे पर नियंत्रण कक्ष का उपयोग कर वांछित प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए2, CO2, और तापमान सेट करें ।
    नोट: यदि perfused सेल संस्कृति प्रदर्शन सीधे इस स्तर पर धारा 5 के लिए आगे बढ़ना ।
  4. ऊतक संस्कृति मशीन से कोशिकाओं को हटा दें और मीडिया बंद महाप्राण । मीडिया पूर्व गर्म काम कर स्टॉक के साथ बदलें ।
  5. यदि bioluminescence मशीन प्रयोग के दौरान humidified नहीं है, तो एक गैस अभेद्य सील के साथ बर्तन और प्लेटें सील ।
यदि bioluminescence मशीन humidified होना है, तो यह सख्ती से व्यंजन सील करने के लिए आवश्यक नहीं है, हालांकि यह एक छोटी मात्रा के साथ बर्तन सील करने के लिए बेहतर है, जैसे ९६-अच्छी तरह से प्लेटें, एक गैस का उपयोग-पारगंय सील, वाष्पीकरण की एक छोटी मात्रा के रूप में अन्यथा कर सकते हैं फिर भी humidified में भी होते हैं ।
नोट: Humidification मशीन के आधार पर पानी की ट्रे को भरने के द्वारा प्राप्त की है ।
  • bioluminescence मशीन के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण, बंद मशीन दरवाजा और सुरक्षित मशीन जगह में कवर करने के लिए एक हल्के तंग सील फार्म ।
  • अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त रिकॉर्डिंग पैरामीटर का चयन करें ।
    1. क्लिक करें "अधिग्रहण । अधिग्रहण सेटअप "।
    2. ' कैमरा सेटअप ' पैनल में, सेट: ' अधिग्रहण मोड ' के लिए ' काइनेटिक '; ' जोखिम समय ' वांछित जोखिम समय के लिए, सेकंड में (नीचे नोट देखें); ' गर्द ' को १; ' काइनेटिक श्रृंखला ' लंबाई अधिग्रहण चक्र की संख्या के लिए वांछित; ' काइनेटिक चक्र समय ' वांछित इमेजिंग अंतराल के लिए (सुनिश्चित करें कि यह जोखिम समय से अधिक है); ' शिफ्ट स्पीड ' को ४.३३ µ सेकेंड; ' नफा ' ते १; और ' उंहें लाभ ' इच्छित स्तर तक (नीचे नोट देखें)
    3. ' ' सहेजें ' ' फलक में, फ़ाइल-प्रकार को. sif या. tif पर सेट करें । कोई फ़ाइल नाम और उपयुक्त बचत स्थान प्रदान करें ।
    4. ' स्पूल कर रहा ' कक्ष में, फ़ाइल-प्रकार tiff के लिए सेट करें । कोई फ़ाइल नाम और उपयुक्त बचत स्थान प्रदान करें । प्राप्ति सेटअप विंडो बंद करें ।
  • ' सिग्नल लो ' बटन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू करो ।
    नोट: के रूप में bioluminescence मशीन विभिंन कोशिका और ऊतक प्रकार की एक बड़ी संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिनमें से सभी bioluminescence के विभिंन स्तरों होगा, जोखिम समय के बीच भिंन होगा एक उचित bioluminescent संकेत इकट्ठा करने के लिए आवश्यक प्रयोगों. यह भी संभव है कि इलेक्ट्रॉन-गुणा (EM) इमेजिंग के लाभ के क्रम में एकत्र संकेत की भयावहता को बढ़ाने के लिए बदलती है । अज्ञात चमक के नए अनुप्रयोगों के लिए, हम पहले एक अपेक्षाकृत कम जोखिम समय के साथ एक एकल छवि लेने के सुझाव (लगभग 10 मिनट) के बिना उंहें लाभ और बाद में दोनों जोखिम समय और उंहें लाभ समायोजन जब तक वांछित रिकॉर्डिंग शर्तों गया है पहुंच. ज्यादातर मामलों में, कैमरे के लिए अधिकतम संभव पिक्सेल तीव्रता के 10-20% का एक मतलब संकेत के लिए लक्ष्य के लिए एक अच्छा स्तर है । एक बार रिकॉर्डिंग मापदंडों का एक उचित सेट तक पहुंच गया है, छवियों के अनुदैर्ध्य अधिग्रहण शुरू, जैसा कि ऊपर वर्णित है ।

    • 5. Perfused टिशू कल्चर (ऐच्छिक)

    नोट: परिचय में वर्णित के रूप में, bioluminescence मशीन गैर मानक ऊतक संस्कृति प्रणाली की इमेजिंग के लिए उपयुक्त है । इस perfused कोशिका संस्कृति के लिए एक प्रणाली के विकास में उदाहरण है ।

    1. कक्षों को एकल चैनल स्लाइड पर Luer कनेक्टर्स के साथ एक चैनल की गहराई के साथ ०.६ या ०.८ mm, DMEM में 10% FBS और पेन/strep के साथ खंड 1 में वर्णित के रूप में बीज । चरण ३.२ में वर्णित के रूप में छिड़काव मीडिया बनाएं ।
    2. रिकॉर्डिंग से पहले, आवश्यक छिड़काव 1 मिमी आंतरिक व्यास (आईडी) का उपयोग कर प्रणाली के लिए टयूबिंग तैयार ETFE टयूबिंग और 1 मिमी आईडी सिलिकॉन टयूबिंग, कोहनी, पुरुष और महिला Luer फिटिंग, के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया है ।
      नोट: ट्यूबिंग की लंबाई के बहुमत Luer फिटिंग, जो बाद में चैनल स्लाइड में लिंक करने के लिए ETFE टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया सिलिकॉन टयूबिंग के 2 सेमी वर्गों के साथ, ETFE टयूबिंग है ।
    3. ७०% इथेनॉल के साथ निस्तब्धता द्वारा टयूबिंग निष्फल, बाँझ पंजाबियों द्वारा पीछा किया ।
    4. मशीन से चैनल स्लाइड में सेल संस्कृतियों निकालें । महाप्राण मीडिया और पूर्व गरम छिड़काव मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    5. पूर्व गर्म छिड़काव मीडिया के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज भरें ।
    6. टयूबिंग को बफ़र स्लाइड से कनेक्ट करें ( चित्र 2देखें) लेकिन कक्ष-युक्त स्लाइड पर नहीं, और छिड़काव मीडिया (3-5 mL) के साथ टयूबिंग और स्लाइड को फ्लश करें ।
    7. सेल युक्त स्लाइड कनेक्ट और किसी भी हवा में बुलबुले को दूर करने के लिए मीडिया की एक और एक मिलीलीटर के साथ पूरे सिस्टम फ्लश ।
    8. bioluminescence मशीन के लिए पूरे सिस्टम स्थानांतरण ।
    9. टयूबिंग से डिस्कनेक्ट बिना सिरिंज पंप करने के लिए मीडिया भरा सीरिंज फिट और पूरी प्रणाली के माध्यम से मीडिया के एक आगे 1 मिलीलीटर फ्लश करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए पंप का उपयोग कर प्रणाली में कोई हवा बुलबुले हैं ।
    10. सिरिंज की है कि करने के लिए पंप पर व्यास सेट किया जा रहा है ।
      नोट: यहां इस्तेमाल होने वाले 20 एमएल सीरिंज के लिए व्यास १९.१३ एमएम है ।
    11. ५० µ एल एच के लिए पंप के प्रवाह की दर निर्धारित करें और इसे चलाने शुरू करते हैं ।
    12. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग की शुरुआत से पहले किसी भी स्लाइड या टयूबिंग में कोई बुलबुले हैं, क्योंकि इन luciferase अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा जब वे सेल monolayer भर में पास । यदि आवश्यक हो, तो यह प्राप्त करने के लिए कक्षों में आगे मीडिया को फ्लश करें ।
    13. बंद bioluminescence मशीन द्वार और ४.७ कदम के रूप में जारी करने के लिए रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।

    6. रिकॉर्डिंग के दौरान उपचार

    नोट: कई बार यह एक रिकॉर्डिंग के माध्यम से बीच में कोशिकाओं का इलाज वांछनीय है, यह औषधीय या हार्मोनल एजेंटों के साथ हो । ऐसे मामलों में, यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को देखभाल के साथ संभाला है उपचार के दौरान रीसेट करने से सेलुलर दोलन को रोकने के लिए । इस कारण से, यह विशेष महत्व का है कि कोशिकाओं को एक स्थिर तापमान पर बनाए रखा जाता है, के रूप में यह सेलुलर circadian लय के लिए एक प्रमुख entraining क्यू है5,6।

    1. रिकॉर्डिंग को रोकने से पहले उपचार के सभी घटकों को तैयार करें ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक रासायनिक इज़ोटेर्माल पैड तैयार करें ।
    3. डिवाइस रिकॉर्डिंग बंद करो, इलाज किया जा करने के लिए पकवान हटाने और इज़ोटेर्माल हीट पैड पर जगह है ।
    4. के रूप में आवश्यक संस्कृतियों का इलाज और पहले के रूप में एक ही स्थान में bioluminescence मशीन को वापस ।
    5. रिकॉर्डिंग पुन: प्रारंभ करें ।

    7. विश्लेषण

    नोट: bioluminescence मशीन व्यक्तिगत छवियों की एक श्रृंखला के रूप में डेटा पैदा करता है ।हम मुख्य रूप से इन छवियों को प्रबंधित करने और फिर आगे विश्लेषण के लिए प्रत्येक क्षेत्र के हित (रॉय) के लिए मतलब पिक्सेल तीव्रता डेटा निर्यात करने के लिए12 फिजी का उपयोग करें ।

    1. ओपन छवि फिजी में ढेर और चमक और कंट्रास्ट पर क्लिक करके समायोजित करें "छवि । समायोजित करें । चमक/कंट्रास्ट "और स्लाइडिंग सलाखों के समायोजन जब तक छवियों bioluminescent संकेत देखने के लिए एक उपयुक्त सीमा के भीतर हैं ।
    2. ब्याज का चयन करें रॉय "के तहत उपलब्ध है विश्लेषण प्रबंधक का उपयोग कर के क्षेत्रों । उपकरण । रॉय प्रबंधक "।
    3. क्लिक करके चयनित क्षेत्र के लिए मतलब संकेत निर्यात "रॉय प्रबंधक । अधिक | Multimeasure ".
    4. परिणामी डेटा की विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में प्रतिलिपि बनाएं ।
    5. मैंयुअल रूप से, (, 15, 30 या ६० ंयूनतम अंतराल, ०.२५, ०.५, या 1 h के रूप में वर्णित) इमेजिंग के समय अंतराल के लिए डेटा के समय आधार को समायोजित करने के बजाय फिजी द्वारा प्रदान की छवि संख्या ।
      नोट: आगे विश्लेषण अब किया जा सकता है, जैसे अवधि का निर्धारण । इसके लिए, निंन समीकरण गैर-रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है:
      Equation
      जहां y संकेत है, x इसी समय, m प्रवृत्ति रेखा के ढाल है, सी प्रवृत्ति लाइन के वाई अवरोधन है, आयाम प्रवृत्ति रेखा से ऊपर तरंग के शिखर की ऊंचाई है, कश्मीर क्षय लगातार है, है या गलन की दर (ऐसी है कि 1/कश्मीर आधा जीवन है), चरण कोज्या लहर के एक्स में बदलाव है, और अवधि के लिए एक पूर्ण चक्र के लिए लिया समय है13होते हैं । आर2 मान अच्छाई के एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है-फिट ।  अन्य विश्लेषण विधियाँ भी संभव हैं. अधिग्रहण के पहले 24 एच विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए, के रूप में सेलुलर bioluminesence इस समय के दौरान क्षणिक, गैर circadian परिवर्तन प्रदर्शित कर सकते हैं । यह मीडिया परिवर्तन के लिए एक तीव्र प्रतिक्रिया का परिणाम है ।

    Representative Results

    यह लेख एक मगरमच्छ (bioluminescence मशीन) का उपयोग कर स्तनधारी कोशिकाओं के bioluminescent इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा । यह तकनीक भौतिक सेटअप और extracellular स्थितियों के लचीलेपन के लिए अनुमति देता है जब इमेजिंग bioluminescent सिस्टम । दोनों सरल स्थैतिक ऊतक संस्कृति के लिए तरीके (चित्रा 1, अनुपूरक वीडियो 1) और perfused सेल संस्कृति (चित्रा 2, अनुपूरक वीडियो 2) वर्णित हैं, लेकिन कई अंय setups इस प्रणाली का उपयोग कर imaged जा सकता है । सभी डेटा खंड 7 में वर्णित विधियों का उपयोग कर मात्रा थे ।

    चित्रा 1a 6 x ९६-PER2 युक्त प्लेटों से एक bioluminescence रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण वीडियो से पता चलता है: ल्यूक fibroblasts4. बाहरी वेल्स में इस प्रयोग के लिए इन आवश्यक नहीं थे के रूप में कोशिकाओं को शामिल नहीं है । कोशिकाओं अंतर तापमान entrainment आया है, वे 12 एच के या तो तापमान चक्र से गुजरना, ३२ डिग्री सेल्सियस पर 12 ज ३७ डिग्री सेल्सियस के बाद ७२ एच या बातचीत के लिए (12 ज, ३७ डिग्री सेल्सियस के बाद 12 ज, ३२ डिग्री सेल्सियस पर ७२ एच के लिए), रिकॉर्डिंग के लिए लगातार ३७ डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा रहा से पहले । ६० मिनट जोखिम हर घंटे लिया गया । इनमें से दो स्थितियां चित्रा 1bमें मात्रा हैं ।

    चित्रा 2a perfused ऊतक संस्कृति के लिए एक प्रणाली के सेटअप के एक योजनाबद्ध से पता चलता है. यह दो चैनल स्लाइड टयूबिंग के साथ जुड़े होते हैं । मीडिया एक सिरिंज पंप द्वारा कोशिकाओं के पार संचालित है । इन स्लाइडों में से पहला एक गैस पारगंय बबल ट्रैप (बफ़र स्लाइड) के रूप में कार्य करता है और उसमें कोई कक्ष नहीं होता है, जिसमें दूसरे कक्षों से bioluminescence रिकॉर्ड किया जाता है । इस सिस्टम से एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग वीडियो चित्रा bमें दिखाया गया है । 15 मिनट जोखिम हर 15 मिनट लिया गया । यहां, कोशिकाओं को या तो मानक छिड़काव शर्तों के तहत या कैसिइन कळेनासे अवरोध करनेवाला PF670462, जो पहले circadian अवधि लंबा करने के लिए दिखाया गया है और संस्कृति में घड़ी जीन अभिव्यक्ति लय के आयाम को कम करने की उपस्थिति में बनाए रखा है स्तनधारी कक्ष14। PER2 पर प्रभाव:: ल्यूक अभिव्यक्ति में दिखाया गया है चित्रा 2c (शीर्ष पैनल) मानक स्थिर सेल संस्कृति की स्थिति के तहत दवा की एक ही एकाग्रता के साथ इलाज कोशिकाओं के खिलाफ चित्रा 2c (नीचे पैनल) में दिखाया गया है, अवधि के ठहराव के साथ चित्रा 2dमें दिखाया गया है । यह इस से स्पष्ट है कि PF670462 प्रभाव के साथ उपचार PER2:: शर्तों के दोनों सेट के तहत ल्यूक अभिव्यक्ति । हालांकि, whilst कोशिकाओं perfused शर्तों के तहत PF670462 के साथ इलाज के लगभग 3 एच (3 ± ०.९ ज) की अवधि लंबी दिखाने के लिए, स्थिर परिस्थितियों में कोशिकाओं को काफी अधिक से अधिक अवधि के साथ इलाज की अवधि के लिए लंबी & #62; ४८ एच । यह एक नम कोज्या द्वारा फिट किया जा सकता है, के रूप में धारा 7 में वर्णित है, (अतिरिक्त राशि-वर्गों के एफ परीक्षण बनाम एक सीधी रेखा, पी & #60; ०.०००१) । दिलचस्प है, छिड़काव के तहत लंबी अवधि की भयावहता के बहुत करीब है कि vivo14में मनाया ।

    Figure 1
    चित्र 1: डेटा उदाहरण. (क) उदाहरण के वीडियो bioluminescence से अमर PER2:: ल्यूक में 6 x ९६ bioluminescence मशीन में अच्छी तरह से प्लेटें । मात्रा होने के लिए कुओं अनुपूरक वीडियो 1में पीले रंग में डाला गया है । (ख) ठहराव से bioluminescence का कोशिकाओं के 3 प्लेटों के दो सेट तापमान चक्र का उपयोग कर entrained थे (12 h, पर ३२ ° c; 12 ज, 37 डिग्री सेल्सियस से कम) कि विरोधी थे PER2 प्रोटीन अभिव्यक्ति के विपरीत चरणों का उत्पादन करने के लिए एक दूसरे के लिए चरणबद्ध (n = 6, मतलब ± SEM) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2: CK1δ अवरोधकों के साथ छिड़काव. (क) छिड़काव प्रणाली की योजनाबद्ध. (B) PER2 से bioluminescence रिकॉर्डिंग का उदाहरण वीडियो स्नैपशॉट:: छिड़काव के अंतर्गत ल्यूक कक्ष । ठहराव का एक नमूना क्षेत्र पीले रंग में डाला गया है । (ग) PER2 के bioluminescence के ठहराव:: ल्यूक fibroblasts के तहत छिड़काव के साथ और स्थैतिक परिस्थितियों में और बिना 3 µ m CK1 अवरोध करनेवाला PF670462 (n = 3, मतलब ± SEM) । Bioluminescence ंयूनतम और अधिकतम मान के लिए सामान्यीकृत किया गया है । (D) अवधि का विश्लेषण (दो-तरफा ANOVA, होल्म-Sidak की एकाधिक तुलनाएं परीक्षण) ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    घटक अंतिम मध्यम एकाग्रता (माइक्रोन) स्टॉक (mg/ ४०० एमएल NS21 के लिए
    गोजातीय एल्ब्युमिन ३७ - ५० छ
    Catalase ०.०१ - ५० मिलीग्राम
    glutathione ३.२ - 20 मिलीग्राम
    इंसुलिन ०.६ 10 8 मिलीलीटर
    सुपरऑक्साइड dismutase ०.०७७ - ५० मिलीग्राम
    Holo-कैल्सीटोनिन ०.०६२ - १०० मिलीग्राम
    T3 (triiodo-L-thyronine) ०.००२६ 2 20 µ l
    L-Carnitine 12 - ४० मिलीग्राम
    Ethanolamine 16 तरल (1 g/एमएल) 20 µ l
    D (+)-गैलेक्टोज ८३ - ३०० मिलीग्राम
    Putrescine १८३ - ३२२ मिलीग्राम
    सोडियम Selenite ०.०८३ 1 २८० µ l
    Corticosterone ०.०५८ 2 ०.२ एमएल
    Linoleic अम्ल ३.५ १०० ०.२ एमएल
    लिनोलेनिक अम्ल ३.५ १०० ०.२ एमएल
    लाइपो एसिड ०.२ ४.७ ०.२ एमएल
    प्रोजेस्टेरोन ०.०२ ३.२ ०.०४ एमएल
    Retinol एसीटेट ०.२ 20 ०.१ एमएल
    Retinol, सब ट्रांस ०.३ 10 ०.२ एमएल
    डी, एल-अल्फा-Tocopherol २.३ १०० 0.2 मिलीलीटर
    डी, एल-अल्फा-Tocopherol एसीटेट २.१ १०० ०.२ एमएल

    तालिका 1: NS21 तैयारी ।

    अनुपूरक वीडियो 1: अच्छी तरह से प्लेटों से bioluminescence के उदाहरण वीडियो। उदाहरण के वीडियो bioluminescence से अमर PER2 से:: ल्यूक में 6 x ९६ bioluminescence मशीन में अच्छी तरह से प्लेटें । मात्रा होने के लिए कुओं पीले रंग में डाला जाता है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    अनुपूरक वीडियो 2: PER2 से एक bioluminescence रिकॉर्डिंग के उदाहरण वीडियो स्नैपशॉट:: छिड़काव के तहत ल्यूक कोशिकाओं । ठहराव का एक नमूना क्षेत्र पीले रंग में डाला गया है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    Discussion

    प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्तनधारी सेल संस्कृति, दोनों perfused और स्थैतिक शर्तों के तहत के लिए है । हालांकि, मगरमच्छ आसानी से अंय मॉडल प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । दरअसल, यह पहले से ही गतिवान, नींद की एक साथ निगरानी के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, और परिधीय जीन अभिव्यक्ति लय में Drosophila melanogaster निरंतर अंधेरे के तहत बनाए रखा15. यह भी उल्लेख किया है कि, आवेदन पर निर्भर करता है, कैमरा प्रकार है कि यहां वर्णित के अलावा उपयुक्त हो सकता है । हमने कल्पना की थी कि उपयुक्त फ़िल्टर्स के साथ, वर्तमान सेटअप का एक संशोधित संस्करण प्रतिदीप्ति ठहराव के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

    केवल अनुप्रयोगों के लिए जो मगरमच्छ उचित नहीं हो सकता है उन है जिसके लिए विशेष रूप से उच्च स्थानिक संकल्प की आवश्यकता है, ऐसे PER2 के spatiotemporal संगठन की इमेजिंग के रूप में:: स्तनधारी के organotypic स्लाइस में ल्यूक अभिव्यक्ति suprachiasmatic नाभिक, या अंय छोटे ऊतक स्लाइस ।

    मगरमच्छ कई प्रयोगों के लिए सक्षम बनाता है कि अब तक पारंपरिक रिकॉर्डिंग तकनीक द्वारा आसानी से प्राप्त नहीं किया गया है । bioluminescence की माप के लिए वर्तमान तरीकों के साथ तुलना में, मगरमच्छ सेल संस्कृति पकवान या स्लाइड है कि इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों के प्रकार में वृद्धि हुई लचीलापन प्रदान करता है, बाहरी मीडिया की स्थिति, संवेदनशीलता, और processivity.

    यह एक समय में विशेष रूप से प्रासंगिक है जब वहां एक कदम है 3 डी organoid और प्रवाह संस्कृति प्रणालियों की ओर मानक 2d सेल संस्कृति मॉडल से दूर । जैसे, यह अनुमान है कि मगरमच्छ एक अनुकूलनीय विधि जिसके द्वारा bioluminescence शर्तों की एक व्यापक रेंज के तहत कई दिनों और हफ्तों से अधिक मापा जा सकता है प्रदान करेगा ।

    Disclosures

    हितों का कोई टकराव मौजूद नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम इस प्रणाली को विकसित करने के लिए हमारे साथ काम करने के लिए, विशेष रूप से मार्क हेनसन, जेरेमी ग्राहम और Joao Correia में केयर्न रिसर्च का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी डेविड वेल्श और अखिलेश रेड्डी बहुमूल्य चर्चा के लिए डिजाइन चरण के दौरान धंयवाद, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पीटर Laskey (पूर्व हमामात्सू के) पांडुलिपि के लिए अपने महत्वपूर्ण इनपुट के लिए एक डेमो कैमरा और डेविड वोंग के ऋण की व्यवस्था के लिए ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021
    Hyclone FetalClone III Serum GE Healthcare SH30109.03
    Neurobasal medium Thermofisher 21103049 basal medium
    Bovine Serum Albumin Sigma A4919
    Catalase Sigma C40
    Glutathione Sigma G6013
    Insulin Sigma I1882
    Superoxide Dismutase Sigma S5395
    Holo-transferrin Calbiochem 616424
    T3 (triiodo-L-thyronine Sigma T6397
    L-Carnitine Sigma C7518
    Ethanolamine Sigma E9508
    D (+)-Galactose Sigma G0625
    Putrescine Sigma P5780
    Sodium Selenite Sigma S9133
    Corticosterone Sigma C2505
    Linoleic Acid Sigma L1012
    Linolenic Acid Sigma L2376
    Lipoic Acid Sigma T1395
    Progesterone Sigma P8783
    Retinol Acetate Sigma R7882
    Retinol, all trans Sigma 95144
    D,L-alpha-Tocopherol Sigma 95240
    D,L-alpha-Tocopherol acetate Sigma T3001
    Sodium Bicarbonate Solution Sigma S8761-100ML
    GlutaMAX (100x) Gibco 35050-038
    Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
    Galaxy 170R incubator  Eppendorf CO17301001
    Luciferin Biosynth L-8220
    D -(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML
    DMEM powder Sigma D5030
    MOPS Sigma PHG0007
    1 mm I.D. silicone tubing  GE Healthcare 19-4692-01
    Elbow luer connector Ibidi 10802
    Male luer fittings Ibidi 10826
    Female luer fittings Ibidi 10825
    µ-slide luer I 0.6 Ibidi 80196
    BD plastipak 20ml syringe Becton Dickinson 300613
    1mm I.D. ETFE tubing GE Healthcare 18-1142-38
    PF670462 Sigma SML0795
    B27 Supplement (50x) ThermoFisher 17504044
    iXon Ultra EMCCD camera Andor iXon 888
    Fiji ImageJ N/A
    Prism 7.0 Graphpad Software N/A
    Trypan blue Sigma T8154
    Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP
    Heated neutral density filter  Cairn Research Custom item
    Osmomat 030 Gonotech Discontinued
    300 mOsmol/kg calibration standard Gonotech 30.9.0020
    Measuring vessel Gonotech 30.9.0010
    Focusing cylinder Cairn Research Custom item
    NE-1600 programmable syringe pump Pump Systems inc. NE-1600
    Andor Solis Software Andor N/A

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    References

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