Summary
Cette étude établit un modèle expérimental de neuropathie pure petites fibres avec résinifératoxine (RTX). Une dose unique de RTX (50 µg/kg) est optimal pour l’élaboration d’un modèle de neuropathie des petites fibres qui imite les caractéristiques des patients et pourrait aider à enquêter sur la signification moléculaire nociceptif qui sous-tendent la douleur neuropathique.
Abstract
Patients atteints de diabète sucré (DM) ou ceux qui connaissent les effets neurotoxiques des agents chimiothérapeutiques peuvent développer des troubles de la sensation due à la dégénérescence et la lésion des neurones sensoriels de petit diamètre, appelée neuropathie des petites fibres. Des modèles animaux présents de neuropathie des petites fibres influent sur les deux fibres sensitives de gros et petit-diamètre et créent ainsi une neuropathologie trop complexes pour évaluer correctement les effets des blessés fibres sensitives de petit diamètre. Par conséquent, il est nécessaire de développer un modèle expérimental de neuropathie pure petites fibres d’examiner adéquatement ces questions. Ce protocole décrit un modèle expérimental de neuropathie de petites fibres affectant spécifiquement les nerfs sensitifs de petit diamètre avec résinifératoxine (RTX), un agoniste ultrapotent du récepteur transitoire vanilloïde type possible 1 (TRPV1), grâce à une dose unique de l’injection intrapéritonéale, appelée neuropathie RTX. Cette neuropathie RTX ont montré des manifestations pathologiques et des anomalies comportementales qui imitent les caractéristiques cliniques des patients atteints de neuropathie des petites fibres, y compris intra-épidermiques fibre nerveuse (IENF) dégénérescence, spécifiquement les blessures en neurones de petit diamètre et l’induction de hypoalgésie thermique et allodynie mécanique. Ce protocole testé trois doses de RTX (200, 50 et 10 µg/kg, respectivement) et a conclu qu’une dose critique de RTX (50 µg/kg) est requis pour le développement des manifestations de neuropathie de typiques petites fibres et préparé une procédure modifiée immunostaining enquêter sur la dégénérescence IENF et lésion neuronale soma. La procédure modifiée est rapide, systématique et économique. Évaluation comportementale de la douleur neuropathique est critique pour révéler la fonction des nerfs sensoriels de petit diamètre. L’évaluation des seuils mécaniques chez les rongeurs expérimentales est particulièrement difficile et ce protocole décrit une maille en métal sur mesure adaptée à ce type d’évaluation chez les rongeurs. En résumé, la neuropathie RTX est un nouveau modèle expérimental facilement établi pour évaluer l’importance moléculaire et l’intervention qui sous-tendent la douleur neuropathique pour le développement d’agents thérapeutiques.
Introduction
Neuropathie de petites fibres impliquant la douleur neuropathique, qui se manifeste par la dégénérescence des IENFs, est fréquente chez les divers types de conditions, telles que DM et à cause des effets neurotoxiques des agents chimiothérapeutiques1,2, 3,4,5. IENFs sont les terminaisons périphériques des neurones de petit diamètre situés dans les ganglions de la racine dorsale (GRD) et sont affectés en parallèle en cas de dégénérescence de IENF6. Par exemple, la transcription génétique en amont altérée de corps cellulaires neurones a été démontrée par l’upregulation de déclenchement transcription factor-3 (ATF3)6,7. En outre, l’évaluation de l’innervation de la IENFs avec biopsie cutanée est utile pour le diagnostic de petites fibres neuropathie5,8,9. Traditionnellement, les profils des IENFs sur la biopsie de la peau ont compté sur immunohistochimique de démonstration du produit de gène de protéine 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Pris ensemble, les profils pathologiques du PMSI et IENFs reflètent la neuropathie de petites fibres sous-jacente condition fonctionnelle et peuvent être un indicateur pour les conséquences fonctionnelles de ce type de neuropathie sur les neurones de petit diamètre.
Auparavant, plusieurs modèles expérimentaux ont abordé la question de la dégénérescence IENF en cas de neuropathie induite par la chimiothérapie12,13 et nerf blessure causée par la compression ou la transection14,15 , 16. ces modèles expérimentaux a également affecté les nerfs grand diamètre ; C’était, par conséquent, pas possible d’exclure la contribution de nerfs touchés de grand diamètre dans la neuropathie observé de petites fibres ; par exemple, l’examen de la thermosensibilité trouble par nocive retrait dépend fonctionnel fibres nerveuses motrices17,18,19. Ainsi, établir un modèle de neuropathie pure petites fibres et d’étudier systématiquement l’état pathologique des corps cellulaires neurones et leurs fibres périphériques de nerf cutanés dans les neurones de petit diamètre sont nécessaire et impérative.
RTX est un analogue de la capsaïcine et un puissant agoniste de récepteur VANILLOÏDE potentiels transient receptor 1 (TRPV1), qui sert de médiateur nociceptif traitement20,21,22. Récemment, périphérique traitement RTX soulagé la douleur neurogène23,24,25 et une injection intraganglionic de RTX induit la perte irréversible de la DRG neurones22. L’effet de l’administration périphérique de RTX est dose-dépendante,20,26,27, qui a abouti à la désensibilisation transitoire ou la dégénérescence de IENFs. Curieusement, traitement systématique de RTX dose élevée conduit à la douleur neuropathique28, un symptôme de la neuropathie des petites fibres. Ces résultats suggèrent que le mode de traitement et la dose de RTX produisent des effets pathologiques distinctes et des réponses neuronales ; à savoir administration périphérique empêche la transmission de la douleur par des effets locaux29 et touché les corps cellulaires neurones qui a développé le comportement neuropathique6. Collectivement, ces résultats indiquent que RTX a un effet multipotentialité et soulevé la question de savoir s’il existe une dose spécifique de RTX systématiquement susceptibles d’affecter les nerfs périphériques, tels que le IENFs périphériques et centrales corps neurones. Dans l’affirmative, RTX pourrait être un agent potentiel spécifiquement affectent les neurones de petit diamètre et imiter la neuropathie des petites fibres dans la clinique. Par exemple, DM dans la clinique est un problème compliqué, y compris le trouble métabolique et neuropathologie des nerfs périphériques, qui sont les principales caractéristiques de la neuropathie des petites fibres. Les mécanismes de la neuropathie associée à DM petites fibres ne pouvaient exclure la contribution de désordre métabolique qui peut ne pas être le principal agent qui touchent les nerfs périphériques. La neuropathie associée à DM petites fibres exige donc un modèle animal pur qui pourrait exclure les effets de la maladie métabolique systématique. Ce protocole décrit la dose de travail de RTX pour élaborer un modèle de neuropathie de typiques petites fibres, y compris la dégénérescence IENF et lésion du neurone de petit diamètre, comme en témoigne l’analyse immuno-coloration mis à jour le.
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Protocol
Toutes les procédures décrites sont conformes aux directives éthiques pour les animaux de laboratoire30, et le protocole a été approuvé par l’Animal Comité de Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan.
1. création de neuropathie RTX
Mise en garde : RTX est neurotoxique et dangereux. Au contact, il agit comme un irritant pour les yeux, des muqueuses et des voies respiratoires supérieures. Évitez d’inhaler et porter des lunettes de laboratoire et manteaux au cours de la préparation de RTX. Rincer abondamment à l’eau en cas de contact avec la peau ou après manipulation.
- Ajouter 1 mg de poudre de RTX à un 200 µL du mélange d’un volume égal de Tween 80 et éthanol absolu (100 µL pour chacun d’eux).
- Partie aliquote de la solution RTX (12 µL/flacon) et conserver à-20 ° C, pendant 3 mois. Ceci constitue le stock RTX ; jeter la solution restante de RTX à expiration.
- Diluer le stock RTX avec une solution saline normale pour un volume final de 600 µL. La concentration finale de la solution RTX devrait être 0,01 %, ce qui équivaut à 1 µg RTX à 10 µL de solution de véhicule.
- Utiliser 8 semaines ICR des souris mâles adultes (35-40 g) comme des animaux de laboratoire et d’administrer une dose unique de solution RTX (dose : 200, 50 et 10 µg/kg, respectivement) par voie intrapéritonéale (i.p.) avec une seringue de microinjection à la souris. Souris a été anesthésiés par inhalateur avec 5 % isoflurane pour une anesthésie profonde. Si les souris ont montré des mesures de retrait des extrémités pendant l’injection de RTX, souris devraient prendre une inhalation plus longue de l’anesthésie.
Exemple : Si la souris pèse 40 g, puis il reçoit 20 µL de la solution RTX, qui représente la dose de 50 µg/kg. - Donner à un groupe de souris un volume égal de véhicule (10 % Tween 80 et 10 % éthanol absolu dans une solution saline), comme un contrôle.
- Après l’injection de RTX, retourner les souris à une cage en plastique sur un 12 h lumière/12 heures sombres cycle et fournissent de la nourriture et l’eau ad libitum.
2. évaluation du comportement neuropathique
Remarque : Maintenir les animaux dans un environnement confortable (étape 1.6) pour permettre la récupération après l’injection. Jour 7 post RTX injection (D7), chaque animal effectue les tests de filament de cheveux plaque chauffante et von Frey le jour même de réduire le temps de biais et de promouvoir l’efficacité des tests comportements. Amener les animaux dans une pièce calme qui est maintenue à une humidité stable (40 %) et la température (27 ° C) afin d’optimiser les animale acclimatation et réduire les effets environnementaux au cours des tests comportementaux. Ne pas déranger les animaux pendant les périodes d’essai ; les tests comportements sont programmés chaque semaine.
- Mesure des latences thermiques avec l’essai de plaque chauffante
- Placez l’animal doucement sur une plaque métallique (27 cm × 29 cm) avec une cage en Plexiglas transparente (longueur x largeur x hauteur : 22 cm x 22 cm x 25 cm ; Figure 1 a). Régler la température de la plaque métallique à 52 ° C.
- Commencer à mesurer la durée de latence thermique de l’animal sur la plaque de cuisson avec la minuterie, Built-à bord de la plaque chauffante une fois les pattes de l’animal touchent la plaque chauffante et observent les réactions des pattes de l’animal. Si l’animal présente des secousses, léchage de pattes, ou sauter tandis que sur la plaque de cuisson, retirez-la et enregistrer la durée pendant laquelle l’animal est resté sur la plaque chauffante. Cette durée de temps définit la latence thermique d’un animal individuel. Enregistrer la latence thermique à la plus proche 0.1 s.
- Pour chaque séance d’essais, effectuer trois essais avec des intervalles de 30 min pour la normalisation de la réponse après le dernier essai de plaque chauffante. Si l’animal ne présente pas de réponse sur la plaque chauffante, arrêter la session après 25 s pour éviter tout dommage tissulaire.
- Test de mesure de seuil mécanique avec le filament de cheveux von Frey
- Mettre l’animal sur la maille en métal sur mesure (grosseur de maille : 5 mm × 5 mm) avec une cage de Plexiglas semi-transparente cylindre (diamètre : 13 cm ; hauteur : 12 cm) (Figure 1 b) pour l’acclimatation pendant au moins 2 h.
- Appliquer les différents calibres des filaments cheveux von Frey à la région plantaire de la hindpaw avec la méthode va-et-vient31. Démarrer application initiale de la force moyenne d’un ensemble de filaments de von Frey cheveux pour une durée d’application de filament de 5-8 s.
- Utilisez un intervalle de 2 min entre les applications de filament pour optimiser la normalisation animale. Changer la force appliquée filament basée sur la dernière réponse de l’animal.
Remarque : Un ensemble de filaments de von Frey cheveux consistant de 0,064, 0,085, 0,145, 0,32, 0,39, 1,1 et 1,7 g force demande. Par exemple, en cas de retrait de hindpaw avec une force initiale de 0,32 g, puis appliquez 0,145 g. En l’absence de retrait de la patte, une force de 0,39 g est alors appliquée. Puis quatre filaments supplémentaires de forces différentes sont appliquées basé sur les réponses précédentes et le seuil mécanique est calculé selon une formule publié31. - Pour chaque séance d’essais, notamment les pattes bilatéraux. Effectuer trois essais pour chaque hindpaw. Exprimer la moyenne de ces six seuils mécaniques comme le seuil moyen mécanique (mg) de chaque animal.
Figure 1. Cage de Plexiglas sur mesure et le métal mesh pour l’évaluation de la douleur neuropathique chez le modèle murin de la résinifératoxine (RTX)-induite par la neuropathie des petites fibres. (A, B) Ces graphiques montrent l’équipement utilisé pour mesurer (A) les latences thermiques par une plaque métallique (27 cm × 29 cm) avec une cage en Plexiglas transparente (longueur x largeur x hauteur : 22 cm x 22 cm x 25 cm) et d’évaluer (B) le seuil mécanique par un meta personnalisés maille de l (grosseur de maille : 5 mm × 5 mm) avec une cage de Plexiglas semi-transparente cylindre (diamètre : 13 cm ; hauteur : 12 cm) chez les souris avec neuropathie induite par RTX petites fibres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. la peau biopsie préparation et évaluation de l’Innervation de la IENFs
- Après un comportement stable, anesthésier les animaux avec 5 % isoflurane et sacrifier les animaux par perfusion intracardiaque avec un tampon phosphate 0,1 M (PB) (pH 7,4) suivies de 4 % de paraformaldéhyde (4p) dans 0,1 M PB.
- Couper les pattes premières des deux pattes après la perfusion et après de les fixer dans les 4 P pour un autre 6 h. transfert du tissu du coussinet plantaire à PB de 0,1 M à 4 ° C pour le stockage à long terme.
- Cryoprotect pads avec 30 % de saccharose en PB du jour au lendemain et couper à la verticale d’une manière surface plantaire en tranches épaisses de 30 µm. Étiqueter le coussinet plantaire sections dans l’ordre et ensuite stocker dans l’antigel à-20 ° C.
Remarque : La composition de l’antigel est comme suit : l’eau distillée, glycérol d’éthylène, glycérol et 2 x PB dans une proportion de 3:3:3:1. - Pour garantir un échantillonnage adéquat, sélectionnez chaque troisième section de la PAD.
- Mettre les sections de coussinet plantaire choisie sur des lames de verre et les sécher à l’air.
- Couvrir d’un couvercle en plastique sur la lame et le processus avec les procédures standard immunostaining.
- Étancher les sections du coussinet plantaire avec 1 % H2O2 dans le méthanol pendant 30 min et bloquer avec lait écrémé 0,5 % et 0,1 % de Triton X-100 dans un tampon Tris de M 0,5 (Tris) pendant 1 h.
- Incuber les sections coussinet plantaire avec antisérums contre pan axonale marqueur, PGP 9.5 (élevé à lapin ; 1 / 1 000), une nuit à 4 ° C.
- Incuber les sections du coussinet plantaire avec un anticorps secondaire biotinylé chèvre anti-lapin IgG à température ambiante (RT) pendant 1 h et ensuite incuber avec le complexe avidine-biotine au RT pendant 45 min.
- Visualiser le produit de réaction avec 0.05 % 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) solution pour 45 s. Laver ensuite les sections du coussinet plantaire avec de l’eau distillée et les sécher à l’air pour le montage.
Remarque : Les antisérums primaires et secondaires sont dilués avec de lait sec de 0,5 % en 0,5 M Tris.
4. DRG Section préparation et évaluation des neurones lésés de petit diamètre
- Disséquer la 4ème et 5ème lombaire PMSI et après correction pour un autre 2 h.
- Tissus Cryoprotect DRG avec 30 % de saccharose en PB du jour au lendemain et raccourcir à une épaisseur de 8 µm séquentiellement, placez sur lames de microscope et l’étiquette. Stocker les sections DRG dans un congélateur à-80 ° C.
- Sections Immunostain DRG à 80 µm-intervalles, pour garantir un échantillonnage adéquat.
- Effectuez DRG immunostaining procédures que celles des sections coussinet plantaire, à l’exception des procédures par immunofluorescence marquage double. Vous pouvez également inclure ATF3 (élevé à lapin ; 1/100), un marqueur de la blessure et la périphérine (élevé à souris ; 1:800), un marqueur neuronal de petit diamètre dans les antisérums primaires.
- Incuber les sections DRG avec le mélange des antisérums primaires durant la nuit à 4 ° C.
- Incuber les sections DRG avec soit Texas red ou fluorescéine isothiocyanate (FITC)-conjugué antisérum secondaire (1 : 200), correspondant à l’antisérum primaire approprié à ta pendant 1 h et ensuite monter pour la quantification.
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Representative Results
Ce protocole décrit un modèle de souris roman de neuropathie RTX, qui affecte plus particulièrement les neurones de petit diamètre, y compris la dégénérescence IENF, associée à des troubles sensoriels (Figure 2). Suivant le protocole décrit ci-après, les animaux ont montré hypoalgésie thermique et allodynie mécanique à D7 post injection de RTX. Pour établir ce modèle de neuropathie de petites fibres, trois doses de RTX : 200, 50 et 10 µg/kg ont été administrées par voie intrapéritonéale. La dose RTX (50 µg/kg) a été jugée critique et l’étude préliminaire a montré qu’une dose élevée RTX (200 µg/kg) une souris haute létalité (Figure 3).
Figure 2. Schéma du modèle souris de la résinifératoxine (RTX)-induite par la neuropathie des petites fibres. Le schéma montre le protocole de neuropathie induite par RTX établie petites fibres. Pour une évaluation systématique, l’évaluation du comportement et examen neuropathologique, il inclus les tests plaque chauffante et von Frey et marqués au double immunomarquage études, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Dose-effet de résinifératoxine (RTX) sur la mortalité animale et dysfonctionnement comportemental. (A) diverses doses de RTX ont été administrés par injection intrapéritonéale (i.p.). La létalité de l’effet de la dose a été dose-dépendante ; par exemple, une forte dose de RTX (200 µg/kg) une létalité 100 %. (B, C) Latences thermiques et mécaniques seuils ont été évalués avec la plaque chauffante (B) et les essais de filaments de von Frey (C), respectivement. Une dose de 50 µg/kg de RTX induit hypoalgésie thermique et allodynie mécanique par rapport au véhicule et le groupe de 10 µg/kg-administrée. Véhicule de carrés, ouvert ; ouvrir le cercle, 50 µg/kg ; Ouvrez le diamant, 10 µg/kg. Ligne pointillée (B), heure de tombée des point d’essai de la plaque chauffante. p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Pathologiquement, il y avait la dégénérescence IENF et marqué ATF3 induction. Double-marquage des études ont montré que les neurones blessés étaient spécifiquement les neurones de petit diamètre peripherin(+). En revanche, la faible dose de RTX (10 µg/kg) n’a pas établi de neuropathie des petites fibres, dont aucun changement dans l’innervation IENF (Figure 4) et aucune lésion neuronale (induction ATF3) (Figure 5). Par conséquent, ce protocole estime essentiel d’établir le modèle de souris de neuropathie des petites fibres la dose de 50 µg/kg.
En résumé, administration systématique de RTX 50 µg/kg dose affectés spécifiquement petites fibres nerveuses. Par exemple, il a conduit à la lésion neuronale soma et la dégénérescence IENF périphérique, qui sont associés à des troubles sensoriels.
Figure 4. La dégénérescence des fibres nerveuses d’intra-épidermiques (IENFs) dans les neuropathies résinifératoxine (RTX). (A-C) Des sections de tissu de la peau du coussinet plantaire de souris ont été immunomarquées avec le produit du gène de la anti-protéine 9,5 (PGP 9.5) antisérums dans le véhicule (A), 50 µg/kg-(B) et les groupes de 10 µg/kg-administré (C). PGP 9.5(+) IENFs proviennent du plexus nerveux sous-épidermiques avec un aspect typique de varices. PGP 9.5 (+) IENFs sont nettement réduites dans les 50 µg/kg, mais pas dans le groupe de 10 µg/kg. IENFs (D) ont été dosés selon les résultats immunohistochimiques de A-C. Véhicule de carrés, ouvert ; ouvrir le cercle, 50 µg/kg ; Ouvrez le diamant, 10 µg/kg. p < 0,001 par rapport au groupe de véhicule. Balance bar, 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Spécificité des blessures de neurone de petit diamètre dans les neuropathies résinifératoxine (RTX). (A-C) Marquage double immunofluorescence a été réalisée avec anti-activateur de transcription factor-3 (ATF3 ; A-C, en vert) et la périphérine (A-C, en rouge) dans le véhicule (A), 50 µg/kg-(B) et les groupes de 10 µg/kg-administré (C). (D) le diagramme indique la modification de la densité des neurones ATF3(+). ATF3(+) neurones ont été augmentés dans les 50 µg/kg, mais pas dans le véhicule et 10 µg/kg de groupes. Véhicule de carrés, ouvert ; ouvrir le cercle, 50 µg/kg ; Ouvrez le diamant, 10 µg/kg. p < 0,001 par rapport au groupe de véhicule. Balance bar, 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il faut une thérapie efficace de neuropathie des petites fibres dans la clinique pour la promotion de la récupération fonctionnelle et la qualité de vie des patients. Actuellement, il y a absence d’un guide thérapeutique ciblant les troubles sensoriels associés à la neuropathie des petites fibres due au manque de compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les lésions neuronales de petit diamètre. Les modèles précédents de neuropathie habituellement affecté les deux nerfs sensitifs du grand et petit-diamètre ; par exemple, les modèles de neuropathie induite par la chimiothérapie12,32,33 et neuropathie induite par le mécanique34,35. Ainsi, la contribution de faiblesse moteur et des lésions nerveuses sensorielles de grand diamètre ne pouvait être totalement exclue dans les tests comportementaux de ces modèles de neuropathie. Le présent protocole décrit un nouveau modèle de neuropathie de petites fibres chez les souris, qui affecte uniquement les nerfs sensitifs de petit diamètre en fournissant des preuves pathologiques et fonctionnelle de la dégénérescence IENFs.
RTX est un agoniste ultrapotent de TRPV1 et un analogue de la capsaïcine, qui peut entraîner une perte de peptidergiques neurones DRG en culture36 et in vivo des systèmes18,19. Des études antérieures sur RTX et de capsaïcine ont principalement porté sur la perte morphologique ou fonctionnelle du corps cellulaires neurones DRG, qui a révélé le rôle de TRPV1 dans la transmission thermique réponse37,38,39. Par ailleurs, une étude antérieure a montré traitement systématique de RTX des doses élevées (200 µg/kg) chez le rat, induit allodynie mécanique et thermique hypoalgésie, probablement à cause de la pathologie des fibres nerveuses de gros diamètre28. La dose de 200 µg/kg, cependant, est une dose létale chez la souris et ce protocole actuel a élaboré un modèle de neuropathie de pures petites fibres en réduisant la dose RTX (50 µg/kg). Cette dose de RTX (50 µg/kg) est essentiel d’établir un modèle de neuropathie pure petites fibres, qui est supérieur à celui indiqué précédemment28, qu’il épargne grandes fibres18. Autrement dit, elle affecte uniquement les petites fibres nerveuses ; à savoir, seulement les neurones de petit diamètre ont été blessés, tel que confirmé par l’induction de ATF3 upregulation6,40 les neurones DRG de petit diamètre et IENFs dégénérescence6,18,19 ,41, associés aux troubles sensoriels. Ces manifestations pathologiques sont globalement imite les symptômes cliniques de neuropathie des petites fibres. En outre, ce modèle courant induit la neuropathologie typique, et le profil de douleur neuropathique Neuropathie des petites fibres et les effets ont duré pendant 8 semaines après RTX traitement6,18,19. Les durées de neuropathologie et douleurs neuropathiques sont équivalentes et pourraient être inversées en favorisant la synthèse de facteur de croissance de nerf (NGF)18,40,41. Collectivement, ce protocole établi un modèle de neuropathie pure petites fibres et mis en évidence le potentiel thérapeutique possible du NGF.
Cliniquement, l’étalon-or pour enquêter sur les neuropathies qui affectent les nerfs nociceptifs petit diamètre8,9 est peau membre biopsying pour évaluer l’innervation de la peau. Notre rapport actuel appliqué cette technique à la peau de coussinet plantaire des animaux de laboratoire afin d’évaluer l’innervation de la peau d’un modèle de neuropathie des petites fibres, qui pourrait imiter la pathologie de la IENFs à la clinique et aussi enquêté sur les profils morphologiques des DRG sections avec le marqueur de la blessure, ATF3, de révéler l’état pathologique des corps cellulaires neurones. Notamment, les distributions spatiales de IENFs au sein de l’épiderme sont hautement ramification et les critères de comptage sont le principal facteur conduisant à des différences significatives entre les groupes. Par exemple, notre protocole actuel compté chaque IENF avec bifurcations que dans le derme et IENFs avec bifurcations au sein de l’épiderme comme une seule IENF14,18,19. Ce critère peut avoir causé une densité plus faible de IENFs dans nos enquêtes que dans celles des autres groupes. Nous avons préparé et traitées de la peau et les sections DRG des animaux de laboratoire de façon systématique et en vrac-évaluation avec notre protocole modifié actuel. En conséquence, ces enquêtes systématiques de la dégénérescence IENF et lésion neuronale peuvent d’éviter le biais stéréologique des conditions fonctionnelles et pathologiques des neurones de petit diamètre dans la neuropathie des petites fibres.
L’évaluation fonctionnelle des nerfs de petit diamètre avec comportement stable, particulièrement associé à l’application de la filament de cheveux von Frey inoffensif, a été traditionnellement appliquée à la peau des patients pour diagnostiquer la fibre petit sous-jacent de sensibilité mécanique neuropathie. L’observation d’allodynie mécanique des animaux de laboratoire est difficile en raison de pied mise à la terre sur le treillis métallique, qui est considéré comme une stimulation mécanique exogène, et les animaux sont très actifs pendant les essais. Le protocole actuel optimisé un plancher de fil spécifique maille taille (5 mm × 5 mm) dans une cage en plastique semi-transparent pour l’adaptation environnementale des animaux de laboratoire pour les tests comportements. Cette dimension de la parole de maille pourrait réduire la stimulation exogène de pied mise à la terre et éviter le souffle pied.
Ce modèle de souris RTX de neuropathie pourrait s’appliquer aux différents types de neuropathie des petites fibres, telles que le diabète, qui est associé à IENF dégénérescence1,,42. Cependant, ce modèle reste limité. Par exemple, le modèle animal du nerf spinal ligature43 avec les caractéristiques de neuropathie des petites fibres, dénommé la radiculopathie dans la clinique, peut-être également affecter les grandes fibres dans la racine de la colonne vertébrale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de la Science et technologie (106-2320-B-037-024), Université de médecine de Kaohsiung (KMU-M106028, KMU-S105034) et but pour l’octroi d’universités de haut (TP105PR15), Université de médecine de Kaohsiung, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al.
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
