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Neuroscience

Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1

Published: February 13, 2018
doi:
10.3791/56651
, ,
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine,Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research,Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory,Kaohsiung Medical University Hospital

Summary

Este estudo estabelece um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena com reductase (RTX). Uma única dose de RTX (50 µ g/kg) é ideal para o desenvolvimento de um modelo de neuropatia de pequenas fibras que imita as características do pacientes e pode ajudar a investigar o significado molecular nociceptivo subjacente a dor neuropática.

Abstract

Pacientes com diabetes mellitus (DM) ou aqueles que experimentam os efeitos neurotóxicos dos agentes quimioterápicos podem desenvolver transtornos sensação devido à degeneração e lesão dos neurônios sensoriais de pequeno diâmetro, referida como neuropatia de pequenas fibras. Modelos animais presentes de neuropatia de pequenas fibras afetam ambas as fibras sensoriais de grande e pequena-diâmetro e assim criar uma neuropatologia demasiado complexo para avaliar correctamente os efeitos do lesionado fibras sensoriais de pequeno diâmetro. Portanto, é necessário desenvolver um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena adequadamente examinar estas questões. Este protocolo descreve um modelo experimental de neuropatia de pequenas fibras especificamente que afetam os nervos sensoriais de pequeno diâmetro com reductase (RTX), um agonista ultrapotente transitória do receptor potencial da tipo do vanilloid de 1 (TRPV1), através de uma dose única de injeção intraperitoneal, referida como neuropatia RTX. Esta neuropatia RTX mostrou manifestações patológicas e anormalidades comportamentais que imitam as características clínicas dos pacientes com neuropatia de pequenas fibras, incluindo intra-epidérmicas degeneração de fibras nervosas (IENF), especificamente de lesões em neurônios de pequeno diâmetro e indução térmico obtidos e alodinia mecânica. Este protocolo testado três doses de RTX (200, 50 e 10 µ g/kg, respectivamente) e concluiu que uma dose de crítica de RTX (50 µ g/kg) é necessária para o desenvolvimento das manifestações de neuropatia de fibra pequena típica e preparado um procedimento modificado imunocoloração para investiga IENF degeneração e lesão neuronal soma. O procedimento modificado é rápida, sistemática e econômica. Avaliação comportamental de dor neuropática é essencial para revelar a função dos nervos sensoriais de pequeno diâmetro. A avaliação dos limiares de mecânicas em roedores experimentais é particularmente desafiadora e este protocolo descreve uma malha de metal personalizada que é apropriada para este tipo de avaliação em roedores. Em resumo, neuropatia RTX é um modelo experimental de novo e facilmente estabelecido para avaliar a significância molecular e intervenção subjacentes dor neuropática para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.

Introduction

Neuropatia de pequenas fibras envolvendo dor neuropática, que é evidente pela degeneração do IENFs, é comum em vários tipos de condições, tais como DM e como resultado os efeitos neurotóxicos da agentes quimioterapêuticos1,2, 3,4,5. IENFs são os terminais periféricos dos neurônios de pequeno diâmetro, localizados no gânglio da raiz dorsal (DRG) e são afetados em paralelo em caso de degeneração de IENF6. Por exemplo, a transcrição genética montante alterada do somata neuronal demonstrou o upregulation de ativação de transcrição fator-3 (ATF3)6,7. Além disso, a avaliação da inervação IENFs com biópsia de pele é útil para o diagnóstico de neuropatia de pequenas fibras5,8,9. Tradicionalmente, os perfis das IENFs sobre a biópsia de pele têm dependia de imuno-histoquímica demonstração do produto do gene da proteína 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Tomados em conjunto, os perfis patológicos de DRG e IENFs refletem a neuropatia de pequenas fibras subjacente condição funcional e podem ser um indicador para as consequências funcionais deste tipo de neuropatia em neurônios de pequeno diâmetro.

Anteriormente, vários modelos experimentais têm abordou a questão da degeneração IENF em casos de neuropatia induzida por quimioterapia12,13 e nervo lesões causadas por compressão ou transecção de14,15 , 16. estes modelos experimentais também afetou os nervos de grande diâmetro; foi, portanto, não é possível excluir a contribuição dos nervos de grande diâmetro afetados em neuropatia a fibra pequena observados; por exemplo, o exame de desordem de thermosensation pela retirada nociva depende funcional fibras nervosas motoras17,18,19. Assim, estabelecer um modelo de neuropatia de pura fibra pequena e sistematicamente a investigar o estado patológico do somata neuronal e suas fibras de nervo periféricas cutâneas nos neurônios de pequeno diâmetro são necessário e imperativo.

RTX é um análogo da capsaicina e um potente agonista ao receptor transitória potencial vanilloid receptor 1 (TRPV1), que medeia o processamento nociceptivo20,21,22. Recentemente, tratamento de RTX periférico aliviou a dor neurogênica23,24,25 e uma injeção intraganglionic de RTX induzida perda irreversível da DRG neurônios22. O efeito da administração de RTX periférica é dose-dependente20,26,27, que resultou na dessensibilização transitória ou degeneração de IENFs. Curiosamente, tratamento de RTX sistemático do elevado-dose levou a dor neuropática28, um sintoma da neuropatia de pequenas fibras. Estes achados sugerem que o modo de tratamento e dose de RTX produzam efeitos patológicos distintos e respostas neuronais; a saber, administração periférica impediu a transmissão de dor por efeitos locais29 e afetou o somata neuronal que desenvolveu comportamento neuropática6. Coletivamente, esses achados indicam que RTX tem um efeito multipotency e levantou a questão de saber se existe uma dose específica de RTX que sistematicamente poderia afetar os nervos periféricos, tais como o IENFs periféricas e central somata neuronal. Em caso afirmativo, RTX poderia ser um potencial agente especificamente afetar os neurônios de pequeno diâmetro e imitar a neuropatia de pequenas fibras na clínica. Por exemplo, o DM na clínica é uma questão complicada, incluindo distúrbio metabólico e neuropatologia de nervos periféricos, que são as principais características da neuropatia de pequenas fibras. Os mecanismos de neuropatia associada a DM pequena fibra não poderiam excluir a contribuição da desordem metabólica que pode não ser o principal agente que afectam os nervos periféricos. Portanto, a neuropatia associada a DM pequena fibra requer um modelo animal puro que pudesse excluir os efeitos da desordem metabólica sistemática. Este protocolo descreve a dose de trabalho de RTX para desenvolver um modelo de neuropatia de fibra pequena típica, incluindo IENF degeneração e lesão do neurônio de pequeno diâmetro, como demonstrado pela análise de imunocoloração modificados.

Protocol

Todos os procedimentos descritos estão em conformidade com as diretrizes éticas para animais de laboratório30, e o protocolo foi aprovado pela Animal Comité de Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan. 1. estabelecimento de neuropatia RTX Atenção: RTX é neurotóxico e perigosos. Ao entrar em contato, ele age como um irritante para os olhos, mucosas e trato respiratório superior. Evitar a inalação e vestir casac…

Representative Results

Este protocolo descreve um modelo de romance do rato de neuropatia RTX, que especificamente afeta os neurônios de pequeno diâmetro, incluindo degeneração IENF, associada com distúrbios sensoriais (Figura 2). Seguindo o protocolo descrito neste documento, animais exibiram térmico obtidos e alodinia mecânica em injeção de RTX D7 post. Para estabelecer este modelo de neuropatia de pequenas fibras, três doses de RTX: 200, 50 e 10 µ g/kg foram administr…

Discussion

Terapia eficaz de neuropatia de pequenas fibras na clínica é necessária para promover a recuperação funcional e qualidade de vida dos pacientes. Atualmente, não há falta de um guia terapêutico visando a desordem sensorial associada com a neuropatia de pequenas fibras devido à falta de compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes a lesão neuronal de pequeno diâmetro. Modelos anteriores de neuropatia geralmente afetado ambos os nervos sensoriais de grande e pequena-diâmetro; por exemplo, os mo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência e tecnologia (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) e objetivo para a concessão de universidades de topo (TP105PR15), universidade médica de Kaohsiung, Taiwan.

Materials

Chemical reagent
Resiniferatoxin Sigma R8756
Tween 80 Sigma P1754
3,3’-diaminobenzidine Sigma D8001
avidin-biotin complex Vector PK-6100
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antisera
Peripherin Chemicon MAB-1527
ATF3 Santa Cruz SC-188
PGP9.5 UltraClone RA95101
Name Company Catalog Number Comments
Secondary Antisera
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector BA-1000
Texas Red-conjugated goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-075-146
Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-095-152
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hot plate IITC Model 39
von Frey filament Somedic Sales AB 10-600-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Shandon coverplate Thermo scientific 72110017
Slide rack Thermo scientific 73310017
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Lee, Y., Lu, S., Hsieh, Y. Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1. J. Vis. Exp. (132), e56651, doi:10.3791/56651 (2018).
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