הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1
Summary
מחקר זה יוצר מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים עם resiniferatoxin (RTX). מנה ייחודית של RTX (50 µg/kg) היא אופטימלית לפיתוח מודל נוירופתיה סיבים קטנים המחקה מאפייני המטופל יכול לעזור לחקור את המשמעות nociceptive המולקולרי שבבסיס כאב נוירופתי.
Abstract
בחולים עם סוכרת (DM) או אלה חווים את ההשפעות העצבים של סוכנים כימותרפיות עלולים לפתח הפרעות תחושה עקב ניוון ופציעה של נוירונים סנסוריים בקוטר קטן, המכונה נוירופתיה סיבים קטנים. נוכח מודלים חייתיים של נוירופתיה סיבים קטנים להשפיע על סיבי חישה שניהם גדולים – ו בקוטר קטן, ובכך ליצור neuropathology מורכב מדי כדי להעריך כראוי את ההשפעות של נפגעים סיבי חישה בקוטר קטן. לכן, יש צורך לפתח מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים כדי שלמאחה לבחון סוגיות אלה. פרוטוקול זה מתאר מדגם ניסיוני של נוירופתיה סיבים קטנים במיוחד משפיע על העצבים החישה בקוטר קטן עם resiniferatoxin (RTX), אגוניסט ultrapotent של קולטן ארעי פוטנציאליים vanilloid מסוג 1 (TRPV1), דרך מנה אחת הזרקת בקרום הבטן, המכונה RTX נוירופתיה. נוירופתיה RTX הזה הראה ביטויים פתולוגיים חריגות התנהגותית המחקים את המאפיינים הקליניים של חולים עם נוירופתיה סיבים קטנים, כולל ניוון סיבי עצב (IENF) intraepidermal, במיוחד פגיעה ב נוירונים בקוטר קטן, אינדוקציה של hypoalgesia תרמית ועל מכניים allodynia. פרוטוקול זה נבדקו שלוש מנות של RTX (200, 50 ו 10 µg/kg, בהתאמה) והגיע למסקנה כי מנה קריטי של RTX (50 µg/kg) הנדרש לפיתוח של ביטויים נוירופתיה טיפוסי סיבים קטנים, מוכן הליך שונה immunostaining חקירת IENF ניוון ופציעה סומא עצביים. הנוהל שונה הוא מהיר, שיטתי כלכלית. הערכה התנהגותית של כאב נוירופתי הוא קריטי כדי לחשוף את תפקוד העצבים החישה בקוטר קטן. הערכת ספי מכני מכרסמים ניסיוני הוא מאתגר במיוחד ומתאר פרוטוקול זה מותאם אישית מתכת רשת שינוי מתאימה עבור סוג זה של הערכה בחולדות. לסיכום, נוירופתיה RTX הוא מודל ניסיוני חדש, ויצר בקלות כדי להעריך את משמעות מולקולרית והתערבות שבבסיס כאב נוירופתי לפיתוח של סוכני טיפולית.
Introduction
נוירופתיה סיבים קטנים מעורבים כאב נוירופטי, אשר באה לידי ביטוי על ידי התנוונות IENFs, נפוץ בסוגים שונים של תנאים, כגון DM, ונוכח ההשפעות העצבים של סוכנים כימותרפיות1,2, 3,4,5. IENFs המסופים היקפיים של נוירונים בקוטר קטן הממוקם את הגרעינים העזוב שורש (DRG) הינם מושפעים במקביל במקרים של ניוון IENF6. לדוגמה, שינו שעתוק גנטי במעלה הזרם של somata עצביים הוכח על ידי קולטנים upregulation של מפעיל שעתוק מקדם-3 (ATF3)6,7. יתר על כן, הערכת העצבוב IENFs עם העור ביופסיה שימושי לאבחון של סיבים קטנים נוירופתיה5,8,9. באופן מסורתי, הפרופילים של IENFs על ביופסיה העור היו תלויים immunohistochemical הדגמה של המוצר ג’ין חלבון 9.5 (PGP 9.5)1,10,11. יחדיו, הפרופילים פתולוגי של הרפובליקה, IENFs לשקף נוירופתיה סיבים קטנים המשמשים כבסיס את תנאי פונקציונאלי, וייתכן שהוא אינדיקטור בתוצאות תפקודי של סוג זה של נוירופתיה על הנוירונים בקוטר קטן.
בעבר, מספר מודלים ניסיוניים התייחס לנושא של ניוון IENF במקרים של נוירופתיה כימותרפיה12,13 ו עצב פגיעה הנגרמת על ידי14,דחיסה או חיתוך15 , 16. מודלים ניסיוניים אלה מושפעים גם קוטר גדול העצבים; זה היה, לפיכך, לא ניתן לכלול את התרומה של העצבים שנפגעו קוטר גדול ב נוירופתיה שנצפה סיבים קטנים; למשל, הבחינה של הפרעת thermosensation על ידי נסיגה יתמודד תלוי פונקציונלי סיבי עצב מוטורי17,18,19. לפיכך, הקמת מודל נוירופתיה טהור סיבים קטנים באופן שיטתי חוקרת את מצב פתולוגי somata עצביים והן שלהם סיבי עצב עורית היקפי בנוירונים בקוטר קטן הם הכרחי, חיוני.
RTX הוא אנלוגי קפסאיצין אגוניסט חזק לקולטן קולטן ארעי פוטנציאליים vanilloid 1 (TRPV1), אשר שמתווכת עיבוד nociceptive20,21,22. לאחרונה, טיפול RTX היקפיים הקלה בכאב neurogenic23,24,25 , זריקה intraganglionic של RTX induced אובדן בלתי הפיך של נוירונים DRG22. ההשפעה של הממשל RTX היקפיים הוא תלוי במינון20,26,27, אשר הביא הקהיה ארעי או ניוון של IENFs. מסקרן, טיפול שיטתי של RTX במינון גבוה הובילה כאב נוירופתי28, סימפטום של נוירופתיה סיבים קטנים. ממצאים אלה מראים כי מצב הטיפול ואת המינון של RTX לייצר אפקטים פתולוגיים ברורים ותגובות עצביים; כלומר, הממשל היקפיים למנוע שידור הכאב על ידי ההשפעות המקומיות29 , מושפעות somata עצביים שהתפתח התנהגות נוירופתי6. באופן קולקטיבי, ממצאים אלו מצביעים על כך RTX יש אפקט multipotency מעלה את סוגיית אם יש מינון מסוים של RTX העלולות להשפיע באופן שיטתי את העצבים, כגון IENFs היקפי ו somata העצבית המרכזית. אם כך, ייתכן RTX סוכן פוטנציאלי כדי להשפיע על נוירונים בקוטר קטן במיוחד ומחקים סיבים קטנים נוירופתיה במרפאה. לדוגמה, מיט במרפאה הוא נושא מורכב, כולל הפרעה מטבולית, neuropathology של העצבים ההיקפיים, אשר הם המאפיינים העיקריים של נוירופתיה סיבים קטנים. המנגנון של נוירופתיה DM-הקשורים סיבים קטנים לא יכול לכלול את התרומה של הפרעה מטבולית, זה לא יכול להיות הסוכן הראשי משפיע על העצבים ההיקפיים. לכן, נוירופתיה DM-הקשורים סיבים קטנים דורש מודל חיה טהורה יכול לכלול את ההשפעות של הפרעה מטבולית שיטתית. פרוטוקול זה מתאר את מינון עבודה RTX לפתח מודל נוירופתיה טיפוסי סיבים קטנים, כולל IENF ניוון ופציעה נוירון בקוטר קטן, כפי שמתואר על ידי ניתוח שונה immunostaining.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיפול אפקטיבי של סיבים קטנים נוירופתיה במרפאה נדרש לקדם את שחזור פונקציונלי ואת איכות החיים של חולים. כיום, יש חוסר מדריך טיפולי מיקוד ליקוי בעיבוד חושי המשויך סיבים קטנים נוירופתיה בשל חוסר הבנה מקיפה המנגנונים המולקולריים שבבסיס פציעה עצביים בקוטר קטן. דגמים קודמים של נוירופתיה מושפע ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי משרד המדע, הטכנולוגיה (106-2320-B-037-024), Kaohsiung הרפואי האוניברסיטאי (KMU-M106028, KMU-S105034), המטרה עבור גרנט אוניברסיטאות Top (TP105PR15), Kaohsiung הרפואי האוניברסיטאי, טייוואן.
Materials
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
