Summary
מחקר זה יוצר מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים עם resiniferatoxin (RTX). מנה ייחודית של RTX (50 µg/kg) היא אופטימלית לפיתוח מודל נוירופתיה סיבים קטנים המחקה מאפייני המטופל יכול לעזור לחקור את המשמעות nociceptive המולקולרי שבבסיס כאב נוירופתי.
Abstract
בחולים עם סוכרת (DM) או אלה חווים את ההשפעות העצבים של סוכנים כימותרפיות עלולים לפתח הפרעות תחושה עקב ניוון ופציעה של נוירונים סנסוריים בקוטר קטן, המכונה נוירופתיה סיבים קטנים. נוכח מודלים חייתיים של נוירופתיה סיבים קטנים להשפיע על סיבי חישה שניהם גדולים - ו בקוטר קטן, ובכך ליצור neuropathology מורכב מדי כדי להעריך כראוי את ההשפעות של נפגעים סיבי חישה בקוטר קטן. לכן, יש צורך לפתח מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים כדי שלמאחה לבחון סוגיות אלה. פרוטוקול זה מתאר מדגם ניסיוני של נוירופתיה סיבים קטנים במיוחד משפיע על העצבים החישה בקוטר קטן עם resiniferatoxin (RTX), אגוניסט ultrapotent של קולטן ארעי פוטנציאליים vanilloid מסוג 1 (TRPV1), דרך מנה אחת הזרקת בקרום הבטן, המכונה RTX נוירופתיה. נוירופתיה RTX הזה הראה ביטויים פתולוגיים חריגות התנהגותית המחקים את המאפיינים הקליניים של חולים עם נוירופתיה סיבים קטנים, כולל ניוון סיבי עצב (IENF) intraepidermal, במיוחד פגיעה ב נוירונים בקוטר קטן, אינדוקציה של hypoalgesia תרמית ועל מכניים allodynia. פרוטוקול זה נבדקו שלוש מנות של RTX (200, 50 ו 10 µg/kg, בהתאמה) והגיע למסקנה כי מנה קריטי של RTX (50 µg/kg) הנדרש לפיתוח של ביטויים נוירופתיה טיפוסי סיבים קטנים, מוכן הליך שונה immunostaining חקירת IENF ניוון ופציעה סומא עצביים. הנוהל שונה הוא מהיר, שיטתי כלכלית. הערכה התנהגותית של כאב נוירופתי הוא קריטי כדי לחשוף את תפקוד העצבים החישה בקוטר קטן. הערכת ספי מכני מכרסמים ניסיוני הוא מאתגר במיוחד ומתאר פרוטוקול זה מותאם אישית מתכת רשת שינוי מתאימה עבור סוג זה של הערכה בחולדות. לסיכום, נוירופתיה RTX הוא מודל ניסיוני חדש, ויצר בקלות כדי להעריך את משמעות מולקולרית והתערבות שבבסיס כאב נוירופתי לפיתוח של סוכני טיפולית.
Introduction
נוירופתיה סיבים קטנים מעורבים כאב נוירופטי, אשר באה לידי ביטוי על ידי התנוונות IENFs, נפוץ בסוגים שונים של תנאים, כגון DM, ונוכח ההשפעות העצבים של סוכנים כימותרפיות1,2, 3,4,5. IENFs המסופים היקפיים של נוירונים בקוטר קטן הממוקם את הגרעינים העזוב שורש (DRG) הינם מושפעים במקביל במקרים של ניוון IENF6. לדוגמה, שינו שעתוק גנטי במעלה הזרם של somata עצביים הוכח על ידי קולטנים upregulation של מפעיל שעתוק מקדם-3 (ATF3)6,7. יתר על כן, הערכת העצבוב IENFs עם העור ביופסיה שימושי לאבחון של סיבים קטנים נוירופתיה5,8,9. באופן מסורתי, הפרופילים של IENFs על ביופסיה העור היו תלויים immunohistochemical הדגמה של המוצר ג'ין חלבון 9.5 (PGP 9.5)1,10,11. יחדיו, הפרופילים פתולוגי של הרפובליקה, IENFs לשקף נוירופתיה סיבים קטנים המשמשים כבסיס את תנאי פונקציונאלי, וייתכן שהוא אינדיקטור בתוצאות תפקודי של סוג זה של נוירופתיה על הנוירונים בקוטר קטן.
בעבר, מספר מודלים ניסיוניים התייחס לנושא של ניוון IENF במקרים של נוירופתיה כימותרפיה12,13 ו עצב פגיעה הנגרמת על ידי14,דחיסה או חיתוך15 , 16. מודלים ניסיוניים אלה מושפעים גם קוטר גדול העצבים; זה היה, לפיכך, לא ניתן לכלול את התרומה של העצבים שנפגעו קוטר גדול ב נוירופתיה שנצפה סיבים קטנים; למשל, הבחינה של הפרעת thermosensation על ידי נסיגה יתמודד תלוי פונקציונלי סיבי עצב מוטורי17,18,19. לפיכך, הקמת מודל נוירופתיה טהור סיבים קטנים באופן שיטתי חוקרת את מצב פתולוגי somata עצביים והן שלהם סיבי עצב עורית היקפי בנוירונים בקוטר קטן הם הכרחי, חיוני.
RTX הוא אנלוגי קפסאיצין אגוניסט חזק לקולטן קולטן ארעי פוטנציאליים vanilloid 1 (TRPV1), אשר שמתווכת עיבוד nociceptive20,21,22. לאחרונה, טיפול RTX היקפיים הקלה בכאב neurogenic23,24,25 , זריקה intraganglionic של RTX induced אובדן בלתי הפיך של נוירונים DRG22. ההשפעה של הממשל RTX היקפיים הוא תלוי במינון20,26,27, אשר הביא הקהיה ארעי או ניוון של IENFs. מסקרן, טיפול שיטתי של RTX במינון גבוה הובילה כאב נוירופתי28, סימפטום של נוירופתיה סיבים קטנים. ממצאים אלה מראים כי מצב הטיפול ואת המינון של RTX לייצר אפקטים פתולוגיים ברורים ותגובות עצביים; כלומר, הממשל היקפיים למנוע שידור הכאב על ידי ההשפעות המקומיות29 , מושפעות somata עצביים שהתפתח התנהגות נוירופתי6. באופן קולקטיבי, ממצאים אלו מצביעים על כך RTX יש אפקט multipotency מעלה את סוגיית אם יש מינון מסוים של RTX העלולות להשפיע באופן שיטתי את העצבים, כגון IENFs היקפי ו somata העצבית המרכזית. אם כך, ייתכן RTX סוכן פוטנציאלי כדי להשפיע על נוירונים בקוטר קטן במיוחד ומחקים סיבים קטנים נוירופתיה במרפאה. לדוגמה, מיט במרפאה הוא נושא מורכב, כולל הפרעה מטבולית, neuropathology של העצבים ההיקפיים, אשר הם המאפיינים העיקריים של נוירופתיה סיבים קטנים. המנגנון של נוירופתיה DM-הקשורים סיבים קטנים לא יכול לכלול את התרומה של הפרעה מטבולית, זה לא יכול להיות הסוכן הראשי משפיע על העצבים ההיקפיים. לכן, נוירופתיה DM-הקשורים סיבים קטנים דורש מודל חיה טהורה יכול לכלול את ההשפעות של הפרעה מטבולית שיטתית. פרוטוקול זה מתאר את מינון עבודה RTX לפתח מודל נוירופתיה טיפוסי סיבים קטנים, כולל IENF ניוון ופציעה נוירון בקוטר קטן, כפי שמתואר על ידי ניתוח שונה immunostaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים הם על פי מוסר מנחים חיות מעבדה30, הפרוטוקול אושרה על-ידי חיה ועדת של Kaohsiung הרפואי האוניברסיטה, בלגיה.
1. הקמת RTX נוירופתיה
התראה: RTX הוא העצבים מסוכנים. על קשר, היא פועלת כמו מגרים העיניים, הקרומים הריריים בדרכי הנשימה העליונות. למנוע שאיפת וללבוש משקפיים מעבדה ומעילים במהלך ההכנה RTX. לשטוף עם הרבה מים במקרה של מגע עם העור או לאחר טיפול.
- להוסיף 1 מ ג של אבקת RTX µL 200 של תערובת של נפח שווה Tween 80 ואתנול מוחלטת (100 µL עבור כל ממס).
- Aliquot הפתרון RTX (µL 12/מבחנה) ולאחסן ב-20 ° C, עד 3 חודשים. זה מהווה את המניה RTX; לבטל את הפתרון RTX הנותרים על התפוגה.
- לדלל את המניה RTX עם תמיסת מלח לאמצעי הסופי של 600 µL. הריכוז הסופי של הפתרון RTX צריך להיות 0.01%, אשר שווה ל- 1 µg RTX בפתרון הרכב µL 10.
- להשתמש בן שבוע 8 מבוגרים זכר ICR עכברים (35-40 גרם) כמו חיות ניסוי ולפקח מנה אחת של פתרון RTX (מינון: 200, 50 ו 10 µg/kg, בהתאמה) intraperitoneally (i.p.) בעזרת מזרק microinjection לעכברים. עכברים היה ומורדמת באמצעות משאף עם 5% איזופלוריין על הרדמה עמוקה. אם עכברים הראה פעולה נסיגה של הגפיים במהלך ההזרקה RTX, עכברים קח עוד שאיפה של הרדמה.
דוגמה: אם העכבר שוקל 40 גרם, אז הוא יקבל 20 µL של הפתרון RTX, המייצג את המינון של µg 50/ק"ג. - לתת קבוצה אחת של עכברים אמצעי שווה של הרכב (10% Tween 80 ו- 10% מוחלטת אתנול בתמיסת), בתור פקד.
- לאחר ההזרקה RTX, להחזיר העכברים בכלוב פלסטיק על 12-h אור/12-לדמותו של אפל מחזור ו לספק מזון ומים ad libitum.
2. הערכת התנהגות נוירופתי
הערה: לשמור על החיות בסביבה נוחה (שלב 1.6) כדי לאפשר שחזור לאחר ההזרקה. יום 7 פוסט RTX זריקה (D7), כל בעל חיים מבצע הבדיקות פילמנט שיער פלטה ופון פריי באותו יום כדי להפחית הטיית זמן לקדם את היעילות של הבדיקות התנהגותית. להביא את החיות בחדר השקט נשמר יציב לחות (40%), טמפרטורה (27 ° C) אופטימיזציה של הסתגלות בעלי חיים והפחתת השפעות סביבתיות במהלך בדיקה התנהגותית. נא לא להפריע החיות בתקופות המבחן; הבדיקות התנהגותית מתוזמנות שבועי.
- מדידה של השהיות תרמי עם הבדיקה פלטה
- מקם את החיה בעדינות על פלטה ממתכת (27 ס"מ × 29 ס מ) עם כלוב פרספקס שקוף (אורך רוחב × × גובה: 22 ס"מ × 22 ס"מ × 25 ס"מ; איור 1 א'). הגדר את הטמפרטורה של הכיריים מתכת 52 ° C.
- תתחילי למדוד את משך השהיית תרמי של החיה הכיריים ששעון העצר שלב-און, מובנה של הכיריים ברגע hindpaws של החיה לגעת את הכיריים, ולבחון את התגובות של hindpaws של החיה. אם החיה מראה רועדת, ליקוק של hindpaws, או קפיצות בזמן הכיריים, להסיר אותו ולהקליט את משך הזמן שנותר החיה על הכיריים. משך זמן זה מגדיר את ההשהיה תרמי בעל חיים בודדים. להקליט את ההשהיה תרמית כדי 0.1 הקרוב ביותר s.
- עבור כל מושב הבדיקה, בצע שלושה ניסויים עם מרווחי 30-מין תגובה נרמול לאחר הבדיקה האחרונה פלטה. אם החיה מראה שום תגובה על הכיריים, להפסיק את ההפעלה לאחר 25 s כדי למנוע נזק לרקמות פוטנציאליים.
- מדידה של הסף מכני עם חוט הלהט שיער פון פריי מבחן
- לשים את החיה על מתכת רשת שינוי מותאם אישית (רשת שינוי גודל: 5 מ מ × 5 מ"מ) עם כלוב פרספקס שקוף למחצה גליל (קוטר: 13 ס מ; גובה: 12 ס מ) (איור 1B) עבור הסתגלות כבר לפחות שעתיים.
- להחיל את סוגי קליעים? שונים של חוטים שיער פריי פון באזור כפות הרגליים של hindpaw עם שיטת שיהיה31. אתחול היישום הראשוני הכוח האמצעי של קבוצת חוטים שיער פון פריי עבור משך זמן של יישום נימה של ש' 5-8.
- השתמש מרווח 2 דקות בין יישומים נימה כדי למטב את הנורמליזציה בעלי חיים. לשנות את הכוח פילמנט יישומית בהתבסס על התגובה האחרונה של החיה.
הערה: ערכה של פון פריי שיער חוטים מורכב 0.064, 0.085, 0.145, 0.32 נקודות, 0.39, 1.1 ו- 1.7 g כוח הבקשה. לדוגמה, אם hindpaw נסיגה התרחשה עם כוח הראשונית של 0.32 גרם, לאחר מכן להחיל 0.145 g. בהיעדר כפת גמילה, כוח 0.39 g מחילה. לאחר מכן ארבעה חוטים נוספים של כוחות שונים מוחלים בהתבסס על התגובות הקודמות, הסף מכני מחושב לפי נוסחה שפורסמו31. - עבור כל מושב מבחן, כוללים את hindpaws דו צדדיים. בצע שלושה ניסויים עבור כל hindpaw. לבטא את הממוצע של אלה ספי מכני שישה כמו הסף מכני רשע (מ ג) של כל בעל חיים.
איור 1. כלוב פרספקס ומתכת לפי הזמנה mesh על ההערכה של כאב נוירופתי במודל עכברים של resiniferatoxin (RTX)-induced סיבים קטנים נוירופתיה. (A, B) גרפים אלה להראות את ציוד למדידת (A) של השהיות תרמי על ידי פלטה חמה מתכת (27 ס"מ × 29 ס מ) עם כלוב פרספקס שקוף (אורך רוחב × × גובה: 22 ס"מ × 22 ס"מ × 25 ס מ) והערכה (B) הסף מכני באמצעות meta מותאם אישית l רשת (רשת שינוי גודל: 5 מ מ × 5 מ"מ) עם כלוב פרספקס שקוף למחצה גליל (קוטר: 13 ס מ; גובה: 12 ס מ) בעכברים עם נוירופתיה הנגרמת RTX סיבים קטנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
3. העור ביופסיה הכנה והערכת העצבוב IENFs
- לאחר התנהגות בדיקות, עזים ומתנגד החיות עם 5% איזופלוריין, להקריב את החיות על ידי זלוף intracardiac עם מאגר פוספט 0.1 M (PB) (pH 7.4) ואחריו paraformaldehyde 4% (P 4) ב PB 0.1 M.
- לחתוך את footpads הראשון של hindpaws שני אחרי זלוף, שלאחר שמלמדות אותם ב- P 4 עבור עוד 6-אייץ העברת הרקמה לו טביעות רגל 0.1 M PB ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.
- Footpads Cryoprotect עם 30% סוכרוז ב PB בן לילה, גזור אנכי plantar האופן משטח פרוסות בעובי של 30-מיקרומטר. תווית לו טביעות רגל של קטעים ברצף ולאחר מכן לאחסן חומר נגד קיפאון ב-20 ° C.
הערה: הרכב חומר נגד קיפאון הוא כדלקמן: מים מזוקקים, אתילן גליצרול, גליצרול, ו- PB 2 x ביחס 3:3:3:1. - כדי להבטיח דגימה נאותה, בחר בכל החלק השלישי של לו טביעות רגל.
- לשים את המקטעים שבחרת לו טביעות רגל בשקופיות מצופה זכוכית, מילה נהדרת אותם.
- מכסים coverplate פלסטיק על שקופית ועל תהליך immunostaining רגיל נהלים.
- להרוות את המקטעים לו טביעות רגל ב- 1% H2O2 ב מתנול למשך 30 דקות וחסום עם חלב יבש ללא שומן 0.5% ו- 0.1% טריטון X-100 במאגר טריס M 0.5 (טריס) לשעה.
- דגירה לו טביעות רגל מקטעים עם אנטיגן נגד מרקר עצב פאן, 9.5 PGP (ארנב וגדלתי; 1:1, 000), בין לילה ב 4 º C.
- דגירה לו טביעות רגל מקטעים עם biotinylated עז ארנב אנטי איג משני נוגדן בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 h ולאחר מכן דגירה עם קומפלקס אבידין-ביוטין-RT למשך 45 דקות.
- דמיינו את המוצר התגובה עם 0.05% 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) פתרון עבור 45 s. לאחר מכן לשטוף לו טביעות רגל מקטעים עם מים מזוקקים, מילה נהדרת אותם להרכבת.
הערה: אנטיגן והמשניים הם מדולל עם 0.5% שומן חלב יבש ב- 0.5 מ' טריס.
4. הערכה של נוירונים בקוטר קטן הפצוע והכנה של סעיף DRG
- לנתח את 4th ו 5th המותני DRG, שלאחר תיקון עבור עוד 2 h.
- Cryoprotect DRG רקמות עם 30% סוכרוז ב PB לילה לחתוך ברצף עובי 8-מיקרומטר, הניחו על שקופיות מיקרוסקופ, ואת תווית. חנות DRG מקטעים במקפיא-80 ° C.
- Immunostain DRG סעיפים 80 מיקרומטר-במרווחי זמן כדי להבטיח דגימה מספקת.
- לבצע הליכים immunostaining DRG כמו אלה של הסעיפים לו טביעות רגל, חוץ ההליכים immunofluorescent כפול-תיוג. לחלופין, כוללים ATF3 (ארנב וגדלתי; 1: 100), סמן פציעה, ו peripherin (העכבר וגדלתי; 1:800), סמן עצביים בקוטר קטן ב אנטיגן העיקרי.
- דגירה DRG מקטעים עם התערובת של אנטיגן העיקרי בין לילה ב 4 º C.
- דגירה DRG מקטעים עם או טקסס אדום או fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת אנטיגן המשני (1:200), המתייחס אנטיגן הראשית המתאימה ב- RT לשעה ולאחר מכן לטעון על כימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר את הרומן העכבר בדגם RTX נוירופתיה, המשפיע במיוחד בקוטר קטן הנוירונים, כולל ניוון IENF, הקשורים עם הפרעות חושית (איור 2). בעקבות פרוטוקול המתוארים בזאת, חיות הציג התרמי hypoalgesia ו- allodynia מכני-D7 פוסט RTX הזרקה. להקים מודל זה נוירופתיה סיבים קטנים, שלוש מנות של RTX: 200, 50 ו- µg 10/kg נוהלו על ידי תוואי i.p.. המינון RTX (50 µg/kg) הוערך קריטי, מחקר ראשוני הראה כי מינון הגבוה RTX (200 µg/kg) גרם גבוהה עכבר קטלני (איור 3).
באיור 2. ערכה של העכבר המודל של resiniferatoxin (RTX)-induced סיבים קטנים נוירופתיה. ערכת מראה הפרוטוקול של סיבים קטנות הנוצרות על-ידי RTX הוקמה נוירופתיה. הערכה שיטתית, התנהגות, והערכת בדיקה neuropathological, הוא כלל את בדיקות פלטה פון פריי, ולימודים התווית על-ידי כפול immunostaining, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. מינון-אפקט של resiniferatoxin (RTX) על בעלי חיים lethality ועל תפקוד התנהגותי. (א) מנות מגוונות של RTX נוהלו על ידי זריקה בקרום הבטן (i.p.). הקטלניות של אפקט המינון היה תלוי במינון; לדוגמה, מינון גבוה של RTX (200 µg/kg) גרם 100% הקטלניות. (B, C) השהיות תרמי וגדלי סף מכני הוערכו עם פלטה (B), בדיקות פילמנט פון פריי (C), בהתאמה. מנה µg/kg 50 של RTX המושרה hypoalgesia תרמית ועל מכניים allodynia לעומת הרכב הקבוצה 10 µg/kg-מנוהל. הרכב מרובע, פתוחה; לפתוח את המעגל, µg 50/ק ג; פתח את יהלום, µg 10/ק"ג. קו מקווקו (B), להקה נקודת מבחן פלטה. p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
פתולוגית, היה IENF ניוון מסומן ATF3 אינדוקציה. תיוג-כפול מחקרים הראו כי נוירונים הפצועים היו במיוחד peripherin(+) בקוטר קטן נוירונים. לעומת זאת, במינון נמוך של RTX (10 µg/kg) לא להקים נוירופתיה סיבים קטנים, כולל שאין שינוי העצבוב IENF (איור 4), אין פגיעה עצביים (אינדוקציה ATF3) (איור 5). בהתאם לכך, פרוטוקול זה לקריטי המינון µg/kg 50 לביסוס המודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים.
לסיכום, ניהול שיטתי RTX עם מנה µg/kg 50 מושפעים במיוחד סיבי עצב קטן. למשל, זה הוביל הפגיעה העצבית סומא ניוון IENF היקפיים, אשר משויכות הפרעות חושית.
באיור 4. ניוון של סיבי עצב intraepidermal (IENFs) ב resiniferatoxin (RTX) נוירופתיה. (A-C) מקטעי רקמת מהעור לו טביעות רגל של עכברים היו immunostained עם ג'ין חלבונים אנטי מוצר 9.5 (PGP 9.5) אנטיגן ברכב (), µg 50/kg-(B), וקבוצות 10 µg/kg-מנוהל (C). PGP 9.5(+) IENFs נובעים מקלעת העצבים subepidermal עם דליות מראה אופייני. 9.5 PGP (+) IENFs מופחתים בצורה ניכרת את 50 µg/ק ג, אך לא בקבוצה 10 µg/kg. (ד) IENFs היו quantitated על פי ממצאי immunohistochemical A-C. הרכב מרובע, פתוחה; לפתוח את המעגל, µg 50/ק ג; פתח את יהלום, µg 10/ק"ג. p < 0.001 לעומת קבוצת הרכב. סולם בר, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. ייחודה של נוירון בקוטר קטן פציעה על נוירופתיה resiniferatoxin (RTX). (A-C) תיוג-כפול מכתים immunofluorescent בוצעה עם שעתוק אנטי הפעלת פקטור-3 (ATF3; A-C, בצבע ירוק), peripherin (A-C, באדום) ברכב (A), µg 50/kg-(B), וקבוצות 10 µg/kg-מנוהל (C). (D) בדיאגרמה מצביע על השינויים צפיפות של נוירונים ATF3(+). הנוירונים ATF3(+) היו גדל µg 50/ק ג, אך לא את הרכב וקבוצות 10 µg/kg. הרכב מרובע, פתוחה; לפתוח את המעגל, µg 50/ק ג; פתח את יהלום, µg 10/ק"ג. p < 0.001 לעומת קבוצת הרכב. סולם בר, 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפול אפקטיבי של סיבים קטנים נוירופתיה במרפאה נדרש לקדם את שחזור פונקציונלי ואת איכות החיים של חולים. כיום, יש חוסר מדריך טיפולי מיקוד ליקוי בעיבוד חושי המשויך סיבים קטנים נוירופתיה בשל חוסר הבנה מקיפה המנגנונים המולקולריים שבבסיס פציעה עצביים בקוטר קטן. דגמים קודמים של נוירופתיה מושפע בדרך כלל שני העצבים החישה של גדולים - ו בקוטר קטן; למשל, המודלים של נוירופתיה כימותרפיה12,32,33 ל נוירופתיה מכני-induced34,35. לפיכך, התרומה של חולשה מוטורית, נזק עצבי חישה קוטר גדול יכול לא לגמרי ייכללו בבדיקת התנהגותית של מודלים אלה נוירופתיה. בפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל חדש של נוירופתיה סיבים קטנים בעכברים, אשר משפיעה רק על העצבים החישה בקוטר קטן על-ידי מתן עדויות ניוון IENFs פתולוגית ופונקציונלית.
RTX הוא אגוניסט ultrapotent של TRPV1 ו אנלוגי של קפסאיצין, אשר עלולה לגרום לאבדן peptidergic DRG נוירונים תרבות36 וויוו מערכות18,19. מחקרים קודמים על RTX, קפסאיצין התמקדו בעיקר ההפסד מורפולוגיים או פונקציונלי של גופים תאים עצביים DRG, אשר חשף את התפקיד של TRPV1 ב38,3937,תגובת שידור תרמי. יתר על כן, מחקר קודם הראה שיטתית טיפול RTX במינון גבוה (200 µg/kg) בחולדות, המושרה allodynia מכני, hypoalgesia תרמית, כנראה עקב פתולוגיה של סיבי עצב גדולים בקוטר28. המינון של 200 µg/kg, לעומת זאת, מנה קטלנית בעכברים, בפרוטוקול הנוכחי זה פיתח מודל נוירופתיה טהור סיבים קטנים על-ידי הפחתת המינון RTX (50 µg/kg). זו מנה של RTX (50 µg/kg) הוא קריטי לביסוס מודל נוירופתיה סיבים קטנים טהור, אשר עדיפה שדווחה בעבר את28, כפי יינצלו סיבים גדולים18. כלומר, היא משפיעה רק על סיבי עצב קטן; כלומר, רק בקוטר קטן נוירונים נפצעו, כפי שאושר על-ידי אינדוקציה של ATF3 קולטנים upregulation6,40 על נוירונים DRG בקוטר קטן, IENFs ניוון6,18,19 ,41, הקשורים עם הפרעות חושית. אלה ביטויים פתולוגיים לחקות באופן מקיף את הסימפטומים הקליניים של נוירופתיה סיבים קטנים. יתר על כן, המודל הנוכחי המושרה את neuropathology טיפוסי, כאב נוירופתי פרופיל של נוירופתיה סיבים קטנים ואת ההשפעות נמשך במשך 8 שבועות פוסט RTX טיפול6,18,19. משך הזמן של neuropathology וכאב נוירופתי היו שווי ערך, יוכל להעצר על ידי קידום הסינתזה של גורם הגדילה העצבי (גורם הגדילה העצבי)-18,-40,-41. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה הקימה מודל נוירופתיה סיבים קטנים טהור והן הדגיש את הפוטנציאל הטיפולי אפשרי של גורם הגדילה העצבי.
קלינית, תקן זהב עבור חוקרים צווארית משפיע על העצבים nociceptive בקוטר קטן8,9 הוא עור הגפיים מילדים להערכת העצבוב העור. הדו ח הנוכחי שלנו שהוחל טכניקה זו העור לו טביעות רגל של חיות ניסוי כדי להעריך את העצבוב העור של מודל נוירופתיה סיבים קטנים, אשר עשויה לחקות הפתולוגיה של IENFs במרפאה, גם חקרה את הפרופילים מורפולוגי של DRG סעיפים עם הסמן פציעה, ATF3, כדי לחשוף את מצב פתולוגי של somata עצביים. ראוי לציין, חלוקות המרחבי של IENFs בתוך האפידרמיס הם מאוד הסתעפות, הקריטריונים הספירה הגורם המוביל סטטיסטי הבדלים בין קבוצות. לדוגמה, פרוטוקול הנוכחי שלנו לספור כל IENF עם נקודות הסתעפות רק בדרמיס, IENFs עם נקודות הסתעפות בתוך האפידרמיס יחיד IENF14,18,19. קריטריון זה אולי גרמו צפיפות נמוכה של IENFs בחקירות שלנו מאשר אלה של קבוצות אחרות. אנו מוכנים, לעבד את העור ואת DRG מקטעים של חיות ניסוי בצורה שיטתית והערכה בתפזורת עם פרוטוקול ששונה הנוכחי שלנו. בהתאם לכך, האלה החקירות שיטתית IENF ניוון ופציעה עצביים יכול להימנע stereological משוא הפנים של תנאים פונקציונלי ופתולוגיים של נוירונים בקוטר קטן בנוירופתיה סיבים קטנים.
הערכת תפקודי העצבים בקוטר קטן עם התנהגות בדיקות, במיוחד עם innoxious פון פריי שיער פילמנט יישום, באופן מסורתי הוחלה על העור המטופלים לאבחון רגישות מכני המשמש כבסיס סיבים קטנים נוירופתיה. התבוננות allodynia מכני בחיות ניסוי הוא מאתגר עקב הרגל ההארקה על רשת מתכת, אשר נחשב להיות אקסוגני גירוי מכני, והם בעלי החיים פעיל ביותר במהלך הבדיקות. בפרוטוקול הנוכחי אופטימיזציה רצפת חוטי מתכת רשת שינוי בגודל מסוים (5 מ"מ × 5 מ"מ) בכלוב פלסטיק שקוף למחצה עבור הסתגלות סביבתית של חיות ניסוי למבחנים התנהגותיים. גודלו של רשת רצפת יכול להפחית את הגירוי אקסוגני של הרגל ההארקה ולהימנע שומטת את הרגל.
יכול להיות מיושם מודל העכבר זה RTX של נוירופתיה לסוגים שונים של נוירופתיה סיבים קטנים, כמו סוכרת, אשר מזוהה עם IENF-ניוון-1,-42. עם זאת, מודל זה נותר מוגבל. לדוגמה, המודל החייתי של עצבי השדרה מצדו43 בעל המאפיינים של נוירופתיה סיבים קטנים, המכונה את radiculopathy במרפאה, עשוי להשפיע גם על הסיבים גדול rootlet בעמוד השדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי משרד המדע, הטכנולוגיה (106-2320-B-037-024), Kaohsiung הרפואי האוניברסיטאי (KMU-M106028, KMU-S105034), המטרה עבור גרנט אוניברסיטאות Top (TP105PR15), Kaohsiung הרפואי האוניברסיטאי, טייוואן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al.
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
