Summary

Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1

Published: February 13, 2018
doi:

Summary

Diese Studie stellt ein experimentelles Modell der reinen kleine Faser Neuropathie mit Resiniferatoxin (RTX). Eine einmalige Dosis von RTX (50 µg/kg) ist optimal für die Entwicklung eines Modells der kleine Faser-Neuropathie, die Patientencharakteristika imitiert und könnte dazu beitragen, die nozizeptiven molekularen Bedeutung zugrunde liegenden neuropathischen Schmerzen zu untersuchen.

Abstract

Patienten mit Diabetes Mellitus (DM) oder diejenigen erleben die neurotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika entstehen Empfindung Störungen durch Degeneration und Verletzung von kleinem Durchmesser sensorischen Neuronen, als kleine Faser Neuropathie bezeichnet. Derzeitigen Tiermodelle der kleine Faser Neuropathie beeinflussen sowohl große und kleine-Durchmesser sensorischen Fasern und schaffen damit eine Neuropathologie zu komplex, um die Auswirkungen der verletzten kleinem Durchmesser sensorischen Fasern richtig einschätzen zu können. Daher ist es notwendig, ein experimentelles Modell der reinen kleine Faser Neuropathie, diese Fragen hinreichend zu prüfen zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Modell der kleine Faser Neuropathie speziell auf kleinem Durchmesser Sinnesnerven mit Resiniferatoxin (RTX), ein ultrapotent-Agonist der Transienten Rezeptor potential Vanilloid Typ 1 (TRPV1), durch eine einzelne Dosis von intraperitoneale Injektion als RTX Neuropathie bezeichnet. Dieser zeigte pathologischen Erscheinungen und Verhaltens-Anomalien, die die klinischen Merkmale der Patienten mit Neuropathie kleine Faser, einschließlich Intraepidermal Nervenfaser (IENF) Degeneration, insbesondere Verletzungen im nachahmen RTX-Neuropathie kleinem Durchmesser Neuronen und Induktion von thermischen Hypoalgesia und mechanische Allodynie. Dieses Protokoll getestet drei Dosen von RTX (200, 50 und 10 µg/kg, beziehungsweise) und kam zu dem Schluss, dass eine kritische Dosis von RTX (50 µg/kg) ist für die Entwicklung der typischen kleinen Faser Neuropathie Manifestationen erforderlich und ein veränderter Immunostaining Verfahren zur IENF Degeneration und neuronale Soma Verletzungen zu untersuchen. Das geänderte Verfahren ist schnell, systematische und wirtschaftliche. Verhaltens Bewertung des neuropathischen Schmerzes ist entscheidend für die Funktion von kleinem Durchmesser sensorischen Nerven zu zeigen. Die Bewertung der mechanischen Schwellen in experimentellen Nagetiere ist eine besondere Herausforderung, und dieses Protokoll beschreibt eine maßgeschneiderte Metallgewebe, die für diese Art der Bewertung bei Nagetieren geeignet ist. Zusammenfassend lässt sich sagen dass RTX Neuropathie ein neues und gut etablierten experimentellen Modell zur Bewertung der molekularen Bedeutung und Intervention zugrunde liegenden neuropathischen Schmerzen für die Entwicklung von Therapeutika.

Introduction

Kleine Faser Neuropathie bei neuropathischen Schmerzen, die durch Degeneration der IENFs hervorgeht, ist häufig in verschiedenen Arten von Bedingungen, wie z. B. DM und als Folge die neurotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika1,2, 3,4,5. IENFs sind die peripheren Terminals von kleinem Durchmesser Neuronen befindet sich in den dorsalen Wurzel Ganglien (DRG) und parallel in Fällen von IENF Degeneration6betroffen sind. Beispielsweise wurde die veränderte vorgelagerten genetische Transkription des neuronalen Somata durch die Hochregulierung des Aktivierens Transkription Faktor 3 (ATF3)6,7nachgewiesen. Darüber hinaus eignet sich die Bewertung der IENFs Innervation mit Hautbiopsie zur Diagnose von small Fiber Neuropathie5,8,9. Traditionell sind die Profile der IENFs auf die Hautbiopsie immunhistochemischen Nachweis der Protein-Genprodukt 9.5 (PGP 9.5)1,10,11angewiesen. Zusammengenommen, die pathologische Profile der DRG und IENFs reflektieren die Funktionszustand zugrunde liegende kleine Faser Neuropathie und möglicherweise ein Indikator für die funktionelle Folgen dieser Art von Neuropathie auf kleinem Durchmesser Neuronen.

Bisher haben mehrere experimentelle Modelle die Angelegenheit der IENF Degeneration in Fällen der Chemotherapie-induzierte Neuropathie12,13 und Nerv Schädigung durch Kompression oder Durchtrennung14,15 , 16. Diese experimentelle Modelle betroffen auch großem Durchmesser Nerven; Daher war es nicht möglich, den Beitrag der betroffenen Großrohre Nerven in den beobachteten kleine Faser Neuropathie; auszuschließen zum Beispiel hängt die Prüfung der Thermosensation Störung durch schädliche Rückzug funktionellen motorischen Nervenfasern17,18,19. So sind eine reine kleine Faser Neuropathie Modell zu etablieren und systematisch untersucht den pathologischen Status der neuronalen Somata und ihre peripheren kutanen Nervenfasern in kleinem Durchmesser Neuronen notwendig und unerlässlich.

RTX ist ein Analogon der Capsaicin und ein potenter Agonist, Transienten Rezeptor potential Vanilloid-Rezeptor 1 (TRPV1), der nozizeptiven Verarbeitung20,21,22vermittelt. Vor kurzem, periphere RTX Behandlung erleichtert neurogene Schmerzen23,24,25 , und eine intraganglionic Injektion von RTX induzierte irreversiblen Verlust der DRG-Neuronen-22. Die Wirkung der peripheren RTX-Verwaltung ist dosisabhängig20,26,27, die die vorübergehende Desensibilisierung oder Degeneration der IENFs geführt. Faszinierenderweise führte systematische Hochdosis-RTX Behandlung zu neuropathischen Schmerzen28, ein Symptom für kleine Faser Neuropathie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung Modus und Dosis von RTX deutliche pathologische Effekte und neuronalen Antworten produzieren; nämlich, periphere Verwaltung Schmerz Übertragung durch lokale Effekte29 verhindert und beeinflusst die neuronalen Somata, die neuropathischen Verhalten6entwickelt. Gemeinsam zeigen diese Erkenntnisse, dass RTX Multipotenz wirkt und die Frage aufgeworfen, ob gibt es eine bestimmte Dosis von RTX, die systematisch die peripheren Nerven, wie die peripheren IENFs und zentralen neuronalen Somata beeinträchtigen könnten. Wenn dies der Fall ist, möglicherweise RTX eine potenzielle Agent gezielt Einfluss auf kleinem Durchmesser Neuronen und kleine Faser Neuropathie in der Klinik zu imitieren. DM in der Klinik ist beispielsweise ein kompliziertes Thema, einschließlich Stoffwechselstörung und Neuropathologie der peripheren Nerven, die die wichtigsten Merkmale der kleine Faser Neuropathie sind. Die Mechanismen der kleine Faser DM-assoziierte Neuropathie konnte nicht den Beitrag der Stoffwechselstörung ausschließen, die nicht der Hauptwirkstoff, die periphere Nerven betreffen kann. Kleine Faser DM-assoziierter Neuropathie erfordert daher eine reine Tiermodell, das die Auswirkungen der systematischen Stoffwechselstörung ausgeschlossen werden konnte. Dieses Protokoll beschreibt die Arbeiten Dosis von RTX, eine typische kleine Faser Neuropathie Modell, einschließlich IENF Degeneration und kleinem Durchmesser Neuron Verletzungen, wie modifizierte Immunostaining Analyse zeigt zu entwickeln.

Protocol

Die beschriebenen Verfahren sind im Einklang mit ethischen Richtlinien für Labor Tiere30, und das Protokoll genehmigt wurde, durch die Tier Ausschuss von Kaohsiung medizinische Universität, Kaohsiung, Taiwan. 1. Aufbau der RTX Neuropathie Vorsicht: RTX ist neurotoxisch und gefährlich. Kontakt fungiert es als reizend auf die Augen, die Schleimhäute und die oberen Atemwege. Nicht einatmen und während RTX Vorbereitung Labor B…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt eine neue Maus-Modell der RTX Neuropathie, betrifft insbesondere kleinem Durchmesser Neuronen, einschließlich IENF Degeneration, sensorische Störungen (Abbildung 2) zugeordnet. Nach dem hier beschriebenen Protokoll ausgestellten Tiere thermische Hypoalgesia und mechanische Allodynie D7 Post RTX Injektion. Dieses kleine Faser Neuropathie Modell, drei Dosen von RTX herstellen: 200, 50 und 10 µg/kg i.p Weg verabreicht wurden. Die R…

Discussion

Wirksame Therapie der Neuropathie kleine Faser in der Klinik ist erforderlich für die funktionelle Erholung und Lebensqualität der Patienten zu fördern. Derzeit gibt es Mangel an eine therapeutische Anleitung targeting sensorischen Störung kleine Faser Neuropathie aufgrund mangelnder umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen zugrunde liegenden neuronalen Verletzung kleinem Durchmesser zugeordnet. Frühere Modelle der Neuropathie betroffen in der Regel sowohl große und kleine-Durchmesser Sinnesnerven; zum …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) und Ziel für die Top Universitäten Grant (TP105PR15), Kaohsiung Medical University, Taiwan.

Materials

Chemical reagent
Resiniferatoxin Sigma R8756
Tween 80 Sigma P1754
3,3’-diaminobenzidine Sigma D8001
avidin-biotin complex Vector PK-6100
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antisera
Peripherin Chemicon MAB-1527
ATF3 Santa Cruz SC-188
PGP9.5 UltraClone RA95101
Name Company Catalog Number Comments
Secondary Antisera
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector BA-1000
Texas Red-conjugated goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-075-146
Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-095-152
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hot plate IITC Model 39
von Frey filament Somedic Sales AB 10-600-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Shandon coverplate Thermo scientific 72110017
Slide rack Thermo scientific 73310017

References

  1. Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
  2. Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
  3. Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
  4. Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
  5. Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
  6. Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
  7. Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
  8. Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
  9. Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
  10. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
  11. Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
  12. Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
  13. Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
  14. Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
  15. Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
  16. Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
  17. Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
  18. Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
  19. Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
  20. Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
  21. Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
  22. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  23. Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
  24. Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
  25. Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), 1253-1258 (2002).
  26. Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
  27. Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
  28. Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
  29. Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
  30. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
  31. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  32. Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
  33. Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
  34. Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
  35. Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
  36. Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
  37. Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
  38. Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
  39. Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
  40. Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
  41. Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
  42. Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
  43. Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).

Play Video

Cite This Article
Lee, Y., Lu, S., Hsieh, Y. Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1. J. Vis. Exp. (132), e56651, doi:10.3791/56651 (2018).

View Video