Summary
이 연구는 resiniferatoxin (RTX)와 순수한 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 설정합니다. RTX의 독특한 복용량 (50 µ g/k g)은 환자 특성을 모방 하는 작은 섬유 신경 모델을 개발 하기 위한 최적의 neuropathic 고통을 기본 nociceptive 분자 의미를 조사 하는 것을 도울 수 있었다.
Abstract
당뇨병 mellitus (DM) 또는 화학요법 대리인의 신경 효과 발생 환자 변성 및 작은 직경 감각 뉴런, 작은 섬유 신경으로의 부상으로 인해 감각 장애를 개발할 수 있습니다. 작은 섬유 신경 병의 현재 동물 모델 모두 큰 및 작은-직경 감각 섬유에 영향을 하 고 따라서는 neuropathology 제대로 부상된 작은 직경 감각 섬유의 효과 평가 하기 위해 너무 복잡 한 만듭니다. 따라서, 그것은 순수한 작은 섬유 신경 적절 하 게 이러한 문제를 조사 하는 실험 모델을 개발 하는 데 필요한입니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 특히 작은-직경 resiniferatoxin (RTX) 유형의 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 단일 투여를 통해 ultrapotent 주 작동 근과 감각 신경에 영향을 미치는 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 RTX 신경의 복 주입이 하 라고. 병 적인 발현 및 intraepidermal 신경 섬유 (IENF) 변성, 특히에 상해를 포함 하 여 작은 섬유 신경 병을 가진 환자의 임상 특성을 모방 행동 이상이이 RTX 신경 병 작은 직경 뉴런, 그리고 열 hypoalgesia 및 기계적 용어인 유도. 이 프로토콜 테스트 RTX의 3 개의 복용량 (200, 50, 및 10 µ g/k g, 각각)와 결론을 RTX의 중요 한 복용량 (50 µ g/k g)는 전형적인 작은 섬유 신경 병 발현의 개발에 필요한 고 수정된 immunostaining 절차를 준비 IENF 변성 및 신경 소마 상해 조사. 수정된 절차는 빠르고, 체계적, 경제. Neuropathic 고통의 행동 평가 작은-직경 감각 신경의 기능을 중요 합니다. 실험적인 설치류에 기계적 임계값의 평가 특히 도전 그리고 설치류에 평가의이 유형에 적합 한 사용자 지정된 금속 메쉬가이 프로토콜에 설명 합니다. 요약 하자면, RTX 신경 분자와 개입 neuropathic 통증 치료제의 개발에 대 한 기본 평가를 쉽게 설립 하 고 새로운 실험 모델입니다.
Introduction
Neuropathic 고통, IENFs의 변성에 의해 분명 하다를 포함 하는 작은 섬유 신경 병은 다양 한 화학요법 에이전트1,2,의 neurotoxic 효력 결과로 및 DM, 같은 조건에서에서 일반적 이다 3,,45. IENFs 지 루트 신경 절 (DRG)에 있는 작은 직경의 주변 단말기 이며 IENF 변성6의 경우에 동시에 영향을 받습니다. 예를 들어 신경 somata의 변경 된 업스트림 유전자 녹음 방송은 활성화 녹음 방송 요인 3 (ATF3)6,7의 upregulation에 의해 증명 되었습니다. 또한, 피부 생 검으로 IENFs 신경 분포의 평가 작은 섬유 신경5,,89의 진단에 유용 합니다. 전통적으로, 피부 생 검에 IENFs의 프로필 9.5 (PGP 9.5)1,,1011단백질 유전자 제품의 immunohistochemical 데모에 의존 했습니다. 함께 찍은, DRG와 IENFs의 병 적인 프로필 기능 조건 기본 작은 섬유 신경 병을 반영 하 고이 유형의 작은 직경 뉴런에서 신경 기능 결과 대 한 표시기를 있을 수 있습니다.
이전에 몇 가지 실험 모델 IENF 변성 부상의 화학요법 유도 신경12,13 및 신경 압축 또는 transection14,15 로 인 한 경우의 문제 해결 , 16. 이러한 실험 모델 또한 영향을 큰 직경 신경; 그것은, 따라서, 불가능; 관찰된 작은 섬유 신경에 영향을 받는 큰 직경 신경의 기여를 제외 하 예를 들어, 유해 철수에 의해 thermosensation 장애의 검사 기능 모터 신경 섬유17,,1819에 따라 달라 집니다. 따라서, 순수한 작은 섬유 신경 모델을 수립 하 고 체계적으로 작은 직경 신경에 있는 그들의 주변 피부 신경 섬유와 신경 somata의 병 적인 상태를 조사 하 고 필요 하 고 긴급 있습니다.
RTX는 capsaicin 아날로그 및 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 수용 체 1 (TRPV1), nociceptive 처리20,,2122중재는 강력한 길 항 제 이다. 최근, 주변 RTX 치료 안심 neurogenic 통증23,,2425 와 intraganglionic 주사 RTX의 유도 DRG 뉴런22의 돌이킬 수 없는 손실. 주변 RTX 관리의 효과 복용량-의존20,26,27, 과도 둔감 또는 IENFs의 퇴보 귀착되는. 글, 체계적인 높은 복용량 RTX 치료 neuropathic 고통을28, 작은 섬유 신경 병의 증 후에 지도 했다. 이 발견은 건의 한다 치료 방식과 RTX의 복용량 생산 뚜렷한 병 적인 효과 신경 응답; 즉, 주변 관리 지역 효과29 에 의해 고통 전송 방해 하 고 개발 neuropathic 동작6신경 somata를 영향을. 샨 다, 이러한 결과 나타냅니다 RTX multipotency 효과가 RTX 체계적으로 주변 IENFs 및 중앙 신경 somata 같은 주변 신경에 영향을 미칠 수 있는 특정 복용량 인지 문제를 제기. 그렇다면, RTX 특히 작은 직경 뉴런에 영향을 하 고 병원에서 작은 섬유 신경 모방 잠재적인 에이전트 수 있습니다. 예를 들어 병원에서 DM 대사 장애 등 neuropathology 작은 섬유 신경 병의 주요 특성은 주변 신경의 복잡 한 문제입니다. DM 관련 작은 섬유 신경 병의 메커니즘은 주변 신경에 영향을 미치는 주요 에이전트를 되지 않을 수 있습니다 대사 장애의 기여를 제외 하지 수 없습니다. 따라서, DM 관련 작은 섬유 신경 체계적인 대사 장애의 영향을 제외 수는 순수한 동물 모델을 필요 합니다. 이 프로토콜 수정된 immunostaining 분석에 의해 증명으로 IENF 변성 및 작은 직경 신경 상해를 포함 하 여 전형적인 작은 섬유 신경 모델을 개발 하는 RTX의 작업 복용량을 설명 합니다.
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Protocol
설명 하는 모든 절차는 실험실 동물30에 대 한 윤리 지침에 따라 그리고 프로토콜 동물 위원회의 가오슝 의학 대학, 가오슝, 대만 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 설립 RTX 신경의
주의: RTX은 신경 하 고 위험한. 접촉, 그것은 상부 호흡기, 점 막, 눈 자극 역할. 흡입을 방지 하 고 RTX 준비 하는 동안 실험실 안경, 코트를 착용. 충분 한 피부 접촉 또는 처리 후 물으로 씻어.
- 트윈 80 및 절대 에탄올 (각 용 매에 대 한 100 µ L)의 동등한 양의 혼합물의 200 µ L를 RTX 분말의 1 밀리 그램을 추가 합니다.
- 약 수 RTX 솔루션 (12 µ L/유리병) 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장. 이 구성 RTX 주식; 만료에 나머지 RTX 솔루션을 삭제 합니다.
- RTX 주식 600 µ L의 최종 볼륨을 일반적인 염 분을 희석. RTX 솔루션의 최종 농도 0.01%, 10 µ L 차량 솔루션에서 1 µ g RTX와 같은 이어야 한다.
- 8 주 오래 된 성인 남성 ICR 마우스 (35-40 g)를 사용 하 여 실험 동물로 RTX 솔루션의 단 하나의 복용량을 관리 하 고 (복용량: 200, 50, 및 10 µ g/k g, 각각) intraperitoneally (i.p.) 쥐에 microinjection 주사기. 마우스 깊은 마 취에 대 한 5 %isoflurane 흡입기에 의해 anesthetized 되었습니다. 마우스 RTX 주입 중 사지의 철수 작업 면, 쥐 더 이상 흡입 마 취의를 취해야 한다.
예: 마우스 무게 40 g, 경우 다음 그것은 받을 것 이다 50 µ g/kg의 복용량을 나타내는 RTX 솔루션의 20 µ L. - 컨트롤 1 쥐 그룹이 차량 (10% 트윈 80 및 10% 절대 에탄올에 염 분 해결책)의 동일한 볼륨을 줄.
- RTX 주입 후는 12 h 빛/12-h에 어두운 플라스틱 케이지를 마우스 주기 및 음식을 제공 및 광고 libitum물 반환 합니다.
2입니다. Neuropathic 행동의 평가
참고: 주사 후 복구를 허용 하도록 편안한 환경 (단계 1.6)에서 동물을 유지 한다. 7 일 게시물 RTX 주사 (D7), 각 동물 행동 테스트의 효율성을 증진을 시간을 줄이고 같은 날에 핫 플레이트와 폰 Frey 머리 필 라 멘 트 테스트를 수행 합니다. 동물 순응을 최적화 하 고 행동 테스트 하는 동안 환경에 미치는 영향을 감소에 대 한 조용한 방에 안정적인 습도 (40%)와 온도 (27 ℃)에서 유지 관리 하는 동물을가지고. 테스트 기간; 동물을 방해 하지 마십시오 행동 테스트는 매주 계획 하 고 있다.
- 핫 플레이트 테스트와 열 대기의 측정
- 투명 한 유리 야 케이지로 부드럽게 금속 핫 플레이트 (27 cm × 29 cm)에 동물을 배치 (길이 × 너비 × 높이: 22 cm × 22 c m × 25 cm; 그림 1A)입니다. 52 ° c 금속 열판의 온도 설정
- 일단 동물의 hindpaws 핫 플레이트를 터치 하 고 동물의 hindpaws의 응답을 관찰 핫 플레이트의 단계에, 내장 된 타이머와 함께 핫 플레이트에 동물의 열 대기 기간을 측정 시작. 동물 경우 떨고, hindpaws의 사슬 또는 뜨거운 접시에 그것을 제거 하 고 동물 뜨거운 접시에 남아 있는 기간을 기록. 이 기간 개별 동물의 열 대기 시간을 정의합니다. 가장 가까운 0.1 열 대기 시간 기록 s.
- 각 테스트 세션에 대 한 응답 정규화 후 마지막 핫 플레이트 테스트에 대 일 분 간격으로 3 개의 시험을 수행 합니다. 25 후 세션을 중지 하는 동물 핫 플레이트에 응답이 없을 경우, 잠재적인 조직 손상을 방지 하는 s.
- 폰 Frey 머리 필 라 멘 트와 함께 기계적 임계값의 측정 테스트
- 사용자 지정 된 금속 메쉬에 동물을 넣어 (메쉬 크기: 5mm × 5mm) 반투명 실린더 유리 야 케이지로 (직경: 13 cm, 높이: 12cm) (그림 1B) 적어도 2 시간에 대 한 순응에 대 한.
- 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 다른 구경 위아래 메서드31hindpaw의 발바닥의 영역에 적용 됩니다. 5-8 s의 필 라 멘 트 적용 기간에 대 한 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 세트의 중간 힘에서 초기 응용 프로그램을 시작 합니다.
- 동물 정규화를 최적화 하기 위해 응용 프로그램 필 라 멘 트 사이 2 분 간격을 사용 합니다. 동물의 마지막 응답에 따라 적용 된 필 라 멘 트 힘을 변경 합니다.
참고: 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 집합 0.064, 0.085, 0.145, 0.32, 0.39, 1.1, 및 1.7 g 강제로 응용 프로그램의 구성 됩니다. 예를 들어 hindpaw 철수 0.32 g의 초기 힘으로 발생 한 경우 다음 0.145 g 적용 됩니다. 발 철수의 부재, 0.39 g 힘 적용 됩니다. 이전 응답에 따라 적용 되는 다양 한 힘의 4 개의 추가 필 라 멘 트 그리고 기계적인 임계값31게시 수식 따라 계산 됩니다. - 각 테스트 세션에 대 한 양국간 hindpaws를 포함 합니다. 각 hindpaw에 대 한 세 가지 실험을 수행 합니다. 각 동물의 의미 기계 임계값 (mg)으로이 6 개의 기계적인 임계값의 평균을 표현 한다.
그림 1입니다. Resiniferatoxin (RTX)의 마우스 모델에 neuropathic 고통의 평가 위한 맞춤 유리 야 케이지 및 금속 메쉬-작은 섬유 신경 병 유발. (A, B) 이러한 그래프 표시 (A)를 측정 하는 데 사용 되는 장비와 투명 한 유리 야 케이지 금속 핫 플레이트 (27 cm × 29 cm)에 의해 열 대기 (길이 × 너비 × 높이: 22 cm × 22 c m × 25 cm) 및 (B) 사용자 지정된 메타에 의해 기계적 임계값 평가 l 메시 (메쉬 크기: 5 m m × 5 m m) 반투명 실린더 유리 야 케이지로 (직경: 13 cm, 높이: 12cm) RTX 유도 작은 섬유 신경와 쥐에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3. 피부 생 검 준비 및 IENFs 신경 분포의 평가
- 동작 테스트 후 5 %isoflurane 동물을 anesthetize 하 고 0.1 M 샌드위치에 4 %paraformaldehyde (4 P) 다음 0.1 M 인산 버퍼 (PB) (pH 7.4) intracardiac 관류에 의해 동물 희생.
- 재 관류 후 두 hindpaws의 첫 번째 올리십시오 고 후 다른 6 h. 전송 노상 강도 조직 장기 저장을 위한 4 ° C에서 0.1 M PB에 대 한 4 P에 그들을 흥분.
- PB 하룻밤에 30% 자당과 30 µ m 두꺼운 조각에 발바닥 표면 방식으로 수직 컷 Cryoprotect 올리십시오. 노상 강도 섹션을 순차적으로, 라벨 그리고-20 ° c.에 부동 액에 저장
참고: 부동 액 조성은 다음과 같습니다: 증류수, 에틸렌 글리세롤, 글리세롤, 그리고 3:3:3:1 비율에 2 x PB. - 을 보장 하기 위해 적절 한 샘플링은 노상 강도의 모든 세 번째 섹션을 선택 합니다.
- 코팅된 유리 슬라이드에 선택한 노상 강도 섹션을 넣어 하 고 그들을 건조.
- 슬라이드 및 표준 immunostaining 절차와 과정에 플라스틱 coverplate 커버.
- 메탄올 30 분에 1% H2O2 와 노상 강도 섹션을 냉각 하 고 트라이 톤 X-100 0.5 M Tris 버퍼 (Tris) 1 시간에에서 0.5% 무 지방 건조 우유와 0.1% 차단 합니다.
- 4 ° c.에 하룻밤 팬 axonal 마커, PGP 9.5 (제기에 토끼; 1:1, 000)에 대 한 antisera 노상 강도 섹션을 품 어
- 노상 강도 biotinylated 염소-토끼 IgG 이차 항 체 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 섹션을 품 어 그리고 45 분 동안 RT에서 avidin 비타민 b 복합체 복합물으로 품 어.
- 0.05% 반응 제품 시각화 45 3, diaminobenzidine (DAB)-3' 솔루션 s. 다음 증류수와 노상 강도 섹션을 세척 하 고 설치를 위해 그들을 건조.
참고: 기본 및 보조 antisera 0.5 M Tris에서 0.5% 무 지방 건조 우유 희석 됩니다.
4. DRG 섹션 준비 및 부상 작은 직경의 평가
- 4번째 및 5번째 해 부 요 추 DRG와 다른 2 h에 대 한 사후 수정.
- 샌드위치에 30% 자당 Cryoprotect DRG 조직 하룻밤 8 µ m 두께 순차적으로 잘라, 현미경 슬라이드 및 라벨에. -80 ° C 냉장고에 DRG 섹션을 저장 합니다.
- 적절 한 샘플링 되도록 80 µ m 간격에 Immunostain DRG 섹션입니다.
- 이중 라벨 immunofluorescent 절차를 제외 하 고는 노상 강도 섹션의 DRG immunostaining 절차를 수행 합니다. 또는, ATF3 포함 (제기에 토끼; 1: 100), 부상 마커, 그리고 peripherin (에 올려진된 마우스; 1:800), 기본 antisera에 작은 직경 신경 마커.
- DRG 섹션 4 ° c.에 하룻밤 기본 antisera의 혼합물을 품 어
- DRG 섹션 중 텍사스 레드 또는 fluorescein isothiocyanate (FITC)을 품 어-보조 antisera (1: 200), 해당 1 h, RT에서 적절 한 기본 antisera 하 활용 한 정량화에 대 한 다음 탑재.
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Representative Results
이 프로토콜 RTX 신경 장 해, 특히 IENF 변성, 감각 장애 (그림 2)와 관련 된 포함 하는 작은-직경 신경에 영향을 미치는의 소설 마우스 모델을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 동물 전시 열 hypoalgesia와 D7 게시물 RTX 주사 기계 용어인. 이 작은 섬유 신경 모델, RTX의 3 개의 복용량을 설정 하려면: 200, 50, 및 10 µ g/k g i.p. 경로 의해 관리 되었다. RTX 복용량 (50 µ g/k g)이 중요 한 것으로 간주 됐다 고 예비 연구는 높은 복용량 RTX (200 µ g/k g) 발생 높은 마우스 치 사 율 (그림 3).
그림 2입니다. Resiniferatoxin (RTX)의 마우스 모델의 계획-작은 섬유 신경 병 유발. 계획 설립된 RTX 유도 작은 섬유 신경 병의 프로토콜을 보여 줍니다. 체계적인 평가, 행동 평가 및 neuropathological 시험, 그것 포함 핫 플레이트와 폰 Frey 테스트와 더블 표시 된 immunostaining 연구, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Resiniferatoxin (RTX) 동물 치 사 율 및 행동 장애의 복용량 효과. (A) 다양 한 복용량 RTX의 복 (i.p.) 주입에 의해 관리 되었다. 복용량 효과의 치 사 율은 복용량-의존; 예를 들어 RTX의 높은 복용량 (200 µ g/k g) 100% 치 명 발생. (B, C) 열 대기 시간 및 기계적 임계값 핫 플레이트 (B)와 폰 Frey 필 라 멘 트 테스트 (C), 각각 평가 했다. RTX의 50 µ g/k g 복용량 유도 열 hypoalgesia 및 차량과 10 µ g/k g-관리 그룹에 비해 기계적 용어인. 열린 광장, 차량; 원, 50 µ g/k g; 오픈 다이아몬드, 10 µ g/k g을 엽니다. (B)에서 파선, 핫 플레이트 테스트의 차단 시간 포인트. p < 0.001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
병 적, IENF 변성 있었습니다 ATF3 유도 표시. 더블 라벨 연구 부상된 신경 특히 peripherin(+) 작은 직경 신경 세포는 나타났다. 에 대비, RTX의 낮은 복용량 (10 µ g/k g) 작은 섬유 신경 병, IENF 신경 분포 (그림 4) 변경 등 아무 신경 상해 (ATF3 유도)을 설정 하지 않았다 (그림 5). 따라,이 프로토콜을 50 µ g/k g 복용량의 작은 섬유 신경 병 마우스 모델을 구축 하는 중요 한 고려 합니다.
요약 하자면, 특히 체계적인 RTX 관리 50 µ g/k g 복용량 작은 신경 섬유에 영향을 받습니다. 예를 들어, 그것은 감각 장애와 관련 된 신경 소마 상해 및 주변 IENF 변성, 지도.
그림 4입니다. Intraepidermal 신경 섬유 (IENFs) resiniferatoxin (RTX) 신경의 변성. (A C) 쥐의 노상 강도 피부에서 조직 섹션은 반대로 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP 9.5) immunostained antisera (A) 차량에서 50 µ g/k g-(B), 및 10 µ g/k g-관리 (C) 그룹. PGP 9.5(+) IENFs 전형적인 정 모습 subepidermal 신경 총에서 발생 한다. PGP 9.5 (+) IENFs은 50 µ g/k g, 10 µ g/kg 그룹에만 현저 하 게 감소 된다. (D) IENFs A-C의 immunohistochemical 결과 quantitated 했다. 열린 광장, 차량; 원, 50 µ g/k g; 오픈 다이아몬드, 10 µ g/k g을 엽니다. p < 0.001 차량 그룹에 비해. 눈금 막대, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. Resiniferatoxin (RTX) 신경에 작은 직경 신경 상해의 특이성. (A C) 반대로 활성화 전사와 함께 수행한 immunofluorescent 얼룩 더블 라벨 요소 3 (ATF3; A-C, 녹색에서) 및 차량 (A), 50 µ g/k g에서에서 peripherin (A C, 레드)-(B), 및 10 µ g/k g-관리 (C) 그룹. (D) 다이어그램 ATF3(+) 신경의 밀도 변화를 나타냅니다. ATF3(+) 신경 50 µ g/k g, 차량 및 10 µ g/k g 그룹에만 증가 했다. 열린 광장, 차량; 원, 50 µ g/k g; 오픈 다이아몬드, 10 µ g/k g을 엽니다. p < 0.001 차량 그룹에 비해. 눈금 막대, 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
병원에서 작은 섬유 신경 병의 효과적 치료는 기능 복구 및 환자의 삶의 질 증진을 위한 필요 합니다. 현재, 거기에 작은 직경 신경 상해 기본 분자 메커니즘의 포괄적인 이해의 부족으로 인해 작은 섬유 신경와 관련 된 감각 장애를 대상으로 치료 가이드의 부족이 이다. 신경의 이전 모델 일반적으로 영향을 모두 큰 및 작은-직경 감각 신경; 예를 들어, 화학요법 유도 신경12,,3233 및 기계 유도 신경34,35의 모델. 따라서, 모터 약점 및 큰 직경 감각 신경 손상의 기여 수 제외할 수 없습니다 완전히 이러한 신경 모델의 행동 테스트. 현재 프로토콜 IENFs 변성의 병 적인 기능 증거를 제공 하 여 작은 직경 감각 신경에만 영향을 마우스에 작은 섬유 신경의 새로운 모델을 설명 합니다.
RTX는 TRPV1의 문화36 그리고 vivo에서 시스템18,19peptidergic의 손실 DRG 뉴런 발생할 수 있습니다 capsaicin 아날로그 ultrapotent 주 작동 근 이다. RTX 및 capsaicin에 이전 연구는 열 전송 응답37,,3839에서 TRPV1의 역할을 밝혀 DRG 신경 셀 시체의 형태 또는 기능 손실에 주로 집중 된다. 또한, 이전 연구 쥐, 유도 기계 용어인과 큰 직경 신경 섬유28의 병 리 현상으로 인해 열 hypoalgesia에에서 체계적인 높은 복용량 RTX 치료 (200 µ g/k g) 증명. 그러나 200 µ g/kg의 복용량, 쥐에서 치 사 량 이며이 현재 프로토콜 RTX 복용량 (50 µ g/k g)를 감소 시켜 순수한 작은 섬유 신경 모델을 개발. RTX의이 복용량 (50 µ g/k g)는 그 이전에 보고 된28, 우수한 큰 섬유18여분으로 순수한 작은 섬유 신경 모델을 수립에 매우 중요 하다. 즉, 그것만 영향을 줍니다 작은 신경 섬유; 즉, 작은 직경 뉴런만 했음, 작은 직경 DRG 신경 및 IENFs 변성6,18,19 ATF3 upregulation6,40 의 유도 의해 확인 ,41, 감각 장애와 관련 된. 이러한 병 적인 발현은 포괄적으로 작은 섬유 신경 병의 임상 증상을 모방. 또한,이 현재 모델 유도 일반적인 neuropathology 그리고 neuropathic 고통 프로필 작은 섬유 신경 병 및 효과의 지속 8 주 t RTX 치료6,,1819. Neuropathology과 neuropathic 고통의 기간 해당 되었고 신경 성장 인자 (NGF)18,,4041의 합성을 촉진 하 여 되돌릴 수 있습니다. 공동으로,이 프로토콜 모두 순수한 작은 섬유 신경 모델 고 NGF의 가능한 치료 잠재력을 강조 했다.
임상, neuropathies 작은 직경 nociceptive 신경8,9 에 영향을 미치는 조사에 대 한 황금 표준 피부 신경 분포를 평가 하기 위한 biopsying 다리 피부입니다. 우리의 현재 보고서 클리닉에 IENFs의 병 리를 모방 수 있으며 DRG의 형태학 프로 파일 조사는 작은 섬유 신경 모델의 피부 신경 분포를 평가 하는 실험 동물의 노상 강도 피부에이 기술을 적용 부상 표시자 ATF3, 신경 somata의 병 적인 상태를 공개 하는 섹션입니다. 특히, 표 피 내에서 IENFs의 공간적 분포는 매우 분기 하 고 계산 기준은 그룹 간의 통계적 차이를 선도 하는 주요 요인. 예를 들어 우리의 현재 프로토콜 단일 IENF14,,1819로 분기 포인트 진 피에만 각각 IENF와 IENFs 표 피 내에서 분기 포인트를 계산. 이 기준 보다 다른 그룹의 그들에 우리의 조사에 IENFs의 더 낮은 밀도 발생 수 있습니다. 우리는 준비 하 고 피부와 체계적이 고 일괄 평가 방식 실험 동물의 DRG 섹션 우리의 현재 수정된 프로토콜 처리. 따라서, 이러한 체계적인 조사 IENF 변성 및 신경 상해의 작은 섬유 신경에 작은 직경의 기능 및 병 적인 조건의 stereological 바이어스를 피할 수 있습니다.
행동으로 작은 직경 신경의 기능 평가 테스트, 특히 무해 폰 Frey 머리 필 라 멘 트 응용 프로그램과 함께, 전통적으로에 적용 된 기계적 감도 기본 작은 섬유를 진단 하기 위한 환자 피부 신경 병입니다. 기계적인 용어인 실험 동물에서 관찰 exogenous 기계적 자극으로 간주 됩니다, 금속 메쉬에 접지 하는 발 인 도전 이며 동물 테스트 하는 동안 매우 활성화 됩니다. 현재 프로토콜 행동 테스트에 대 한 실험 동물의 환경 적응에 대 한 반투명 플라스틱 장에 특정 크기의 메쉬 와이어 바닥 (5 m m × 5 m m)를 최적화. 메쉬 바닥의이 크기 발 접지의 외 인 자극을 줄일 수 있고 발 낙하 방지.
신경의이 RTX 마우스 모델 작은 섬유 신경 병, 당뇨병, 관련 된 IENF 변성1,42등의 종류에 적용할 수 있습니다. 그러나,이 모델은 제한 된 남아 있습니다. 예를 들어 병원, radiculopathy 라고 작은 섬유 신경 병의 특성을 가진 척추 신경 결 찰43 의 동물 모델 척추 rootlet에서 큰 섬유에 영향을 또한 수 있습니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품은 사역의 과학 및 기술 (106-2320-B-037-024), 카오 슝 의과대학 (KMU-M106028, KMU-S105034) 및 상위 대학 그랜트 (TP105PR15), 카오 슝 의과대학, 대만 대 한 목표에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
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