Summary
Это исследование устанавливает экспериментальную модель чистой небольшой волоконно невропатии с resiniferatoxin (RTX). Уникальный доза RTX (50 мкг/кг) является оптимальным для разработки модели небольшой волоконно нейропатии, которая имитирует характеристики пациента и может помочь исследовать ноцицептивных молекулярной значения, лежащие в основе нейропатической боли.
Abstract
У пациентов с сахарным диабетом (DM), или тех, кто испытывает нейротоксические эффекты химиотерапевтических агентов, может развиться ощущение расстройств из-за дегенерации и травмы сенсорных нейронов малого диаметра, именуемые как малые волокна нейропатии. Настоящее время Животные модели малых волокна нейропатии влияет на оба большого и малого диаметра чувствительных волокон и тем самым создать невропатология слишком сложны, чтобы должным образом оценить последствия раненых малого диаметра чувствительных волокон. Таким образом необходимо разработать экспериментальную модель чистой небольшой волоконно нейропатии надлежащим образом рассмотреть эти вопросы. Этот протокол описывает экспериментальной модели малых волокна нейропатии, конкретно затрагивающих сензорных нервах малого диаметра с resiniferatoxin (RTX), ultrapotent агонист Переходный рецепторный потенциал vanilloid типа 1 (TRPV1), через одну дозу внутрибрюшинной инъекции, называется RTX нейропатии. Этот RTX нейропатии показал патологических проявлений и поведенческие аномалии, которые имитируют клинических характеристик больных с небольшой волоконно нейропатии, включая intraepidermal дегенерация нервных волокон (IENF), специально травмы в малого диаметра нейронов и индукции hypoalgesia тепловых и механических аллодиния. Этот протокол испытания трех доз RTX (200, 50 и 10 мкг/кг, соответственно) и пришел к выводу, что критической дозой RTX (50 мкг/кг) для развития проявления невропатии типичных малых волокна и подготовила измененный иммуноокрашивания процедура расследования, IENF дегенерация и повреждения нейронов сома. Измененная процедура быстро, систематической и экономической. Поведенческие оценки нейропатической боли важно выявить функции сензорных нервах малого диаметра. Оценка механических порогов в экспериментальной грызунов является особенно сложным, и этот протокол описывает заказной металлической сетки, которая подходит для этого вида оценки грызунов. В целом RTX невропатия является новой и легко установленных экспериментальной модели для оценки молекулярной значимость и вмешательства, лежащие в основе невропатической боли для развития терапевтических агентов.
Introduction
Малые волокна невропатии с участием невропатической боли, которая проявляется на перерождение IENFs, распространены в различных типах условий, таких как DM и в результате нейротоксические эффекты химиотерапевтических агентов1,2, 3,4,5. IENFs являются периферийных терминалы малого диаметра нейронов, расположенный в спинной корень ганглиев (DRG) и страдают параллельно в случаях IENF дегенерация6. К примеру изменены вышестоящим генетических транскрипции нейрональных somata была продемонстрирована upregulation активации транскрипционного фактора-3 (ATF3)6,7. Кроме того Оценка IENFs иннервации с биопсия кожи является полезным для диагностики малых волокна нейропатии5,8,9. Традиционно профили IENFs на биопсии кожи зависели иммуногистохимических демонстрация продукта гена белка 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Взятые вместе, патологических профили DRG и IENFs отражать функционального состояния базовой небольшой волоконно нейропатии и может быть показателем для функциональных последствий этого типа невропатии на малого диаметра нейронов.
Ранее несколько экспериментальных моделей рассмотрели вопрос IENF дегенерации в случаях химиотерапии индуцированной нейропатии12,13 и нервные травмы, вызванные сжатием или перерезка14,15 , 16. Эти экспериментальные модели также пострадавших нервов большого диаметра; Он был, таким образом, не представляется возможным исключить вклад пострадавших нервов большого диаметра в наблюдаемых небольшой волоконно нейропатии; например изучение thermosensation расстройства вредных вывода зависит от функциональных моторных нервных волокон17,18,19. Таким образом создания модели нейропатии чистый небольшой волокна и систематически изучения патологические состояния нейрональных somata и их периферийных кожный нервных волокон в нейронах малого диаметра необходимо и важно.
RTX является аналогом капсаицина и мощный агонист Переходный рецепторный потенциал vanilloid рецепторов 1 (TRPV1), которая опосредует ноцицептивных обработки20,21,22. Недавно периферических RTX лечения освобожден нейрогенный боль23,24,25 и intraganglionic инъекции RTX индуцированной необратимой потере DRG нейронов22. Эффект периферийных RTX администрации является дозозависимый20,26,27, которые привели к временной десенсибилизация или дегенерации IENFs. Интригующе систематического лечения RTX высок дозы привело к невропатической боли28, симптом малых волокна нейропатии. Эти результаты показывают, что режим лечения и доза RTX производить различных патологических эффектов и нейронных ответов; именно, периферийных администрации предотвратить боль передачи местных эффектов29 и пострадавших нейрональных somata, разработанные нейропатической поведение6. Вместе эти результаты показывают, что RTX имеет multipotency эффект и поднял вопрос, есть ли конкретные дозы RTX, которые систематически могут повлиять на периферических нервов, например IENFs периферических и центральных нейронов somata. Если это так, RTX может быть потенциальным агентом конкретно затрагивают малого диаметра нейронов и имитировать небольшой волоконно невропатии в клинике. К примеру DM в клинике является сложным вопросом, включая метаболические расстройства и невропатологии периферических нервов, которые являются основными характеристиками малых волокна нейропатии. Механизмы DM-связанных небольшой волоконно невропатии не может исключать вклад метаболические расстройства, которое не может быть основным агентом, затрагивающих периферических нервов. Таким образом нейропатии DM-связанных небольшой волоконно требует чистой животных модель, которая могла бы исключить влияние систематического метаболические расстройства. Этот протокол описывает рабочую дозу RTX разработать модель типичный небольшой волоконно нейропатии, включая IENF дегенерация и малого диаметра нейронных травмы, как это продемонстрировано изменение иммуноокрашивания анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные в соответствии с этические руководящие принципы для лабораторных животных30, и протокол был одобрен животное Комитет Гаосюн медицинского университета, Гаосюн, Тайвань.
1. Создание RTX нейропатии
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: RTX нейротоксического и опасными. На контакт он действует как раздражитель глаз, слизистых оболочек и верхних дыхательных путей. Избегать вдыхания и носить очки лаборатории и пальто в ходе подготовки RTX. Промыть большим количеством воды в случае контакта кожи или после обработки.
- Добавьте 1 мг порошка RTX 200 мкл смесь равных объемов анимации 80 и абсолютного этанола (100 мкл для каждого растворителя).
- Алиготе RTX решение (12 мкл/флакона) и хранить при температуре от-20 ° C, на срок до 3 месяцев. Это представляет собой запас RTX; отменить оставшиеся RTX решение на выдыхе.
- Разбавьте RTX акций с физиологическим окончательный объем 600 мкл. Конечная концентрация раствора RTX должно быть 0,01%, что составляет 1 мкг RTX в 10 мкл раствора транспортного средства.
- Использовать 8-недельных взрослых самцов ICR мышей (35-40 г) в качестве подопытных животных и управлять одной дозы раствора RTX (доза: 200, 50 и 10 мкг/кг, соответственно) внутрибрюшинно (и.п.) с помощью шприца микроинъекции для мышей. Мышь была под наркозом, ингалятор с 5% изофлюрановая для глубокой анестезии. Если мышь показан вывод действий конечностей во время инъекции RTX, мышей следует принимать больше ингаляционной анестезии.
Пример: Если мышь весит 40 g, то он будет получать 20 мкл раствора RTX, представляющие в дозе 50 мкг/кг. - Дать одной группе мышей равный объем транспортного средства (10% 80 анимации и 10% абсолютного этанола в физиологический раствор), как элемент управления.
- После инъекции RTX возвращение мышей в пластиковых клетку на 12-свет/12-ч темные цикла и предоставления продовольствия и воды ad libitum.
2. Оценка нейропатической поведения
Примечание: Сохранить животных в комфортной среде (шаг 1.6), чтобы обеспечить возможность восстановления после инъекции. На 7 день пост RTX инъекции (D7) каждое животное выполняет тесты нити волос поджарки и фон Фрей в тот же день, чтобы сократить время и повысить эффективность поведенческие тесты. Принесите животных в тихой комнате, которая поддерживается на стабильную влажность (40%) и температуры (27 ° C) для оптимизации акклиматизации животных и уменьшения воздействия на окружающую среду в ходе поведенческого тестирования. Не беспокоить животных в периоды испытаний; поведенческие тесты запланировано за неделю.
- Измерение теплового задержки с терморегуляцией тест
- Поместите животное мягко на металлические плита (27 см × 29 см) с клетке прозрачный Plexiglas (длина × ширина × высота: 22 см × 22 × 25 см; Рисунок 1A). Установите температуру металлические плита на 52 ° C.
- Начните измерения длительности животного тепловой задержки на горячей плите с шаг, встроенный таймер поджарки после животного hindpaws сенсорных поджарки и наблюдать реакцию животного hindpaws. Если животное показывает, тряски, облизывая hindpaws, или прыгать на горячей пластине, удалите его и записывать продолжительность, что животное остается на горячей плите. Это время продолжительности определяет тепловой задержка индивидуального животного. Записывать тепловые задержку до ближайших 0,1 s.
- Для каждого сеанса тестирования выполняют три испытания с интервалом 30 мин для нормализации ответ после последнего испытания для поджарки. Если животное показывает никакого ответа на горячей плите, остановить сеанс после 25 s, чтобы избежать повреждения ткани.
- Измерения механических порога с нити волос фон Frey тест
- Положить животное на заказной металлическая сетка (размер сетки: 5 × 5 мм) с сепаратором оргстекло полупрозрачные цилиндра (диаметр: 13 см, высота: 12 см) (рис. 1B) для акклиматизации для минимум 2 ч.
- Применение различных калибров нити волос фон Frey подошвенной регион hindpaw с прихваченного метод31. Начните начальное приложение от средней силы набора фон Frey волос нитей продолжительностью накаливания применения 5-8 сек.
- Используйте 2 мин интервал между приложениями накаливания для оптимизации животных нормализации. Измените силу прикладной накаливания, на основе последнего ответа животного.
Примечание: Набор фон Frey нити волос состоит из 0.064, 0,085, 0,145, 0,32, 0,39, 1.1 и 1.7 g приложения сил. Например если вывод hindpaw произошло с начальной силой 0,32 g, затем примените 0,145 г. В отсутствие вывода лапой затем применяется 0,39 g силу. Затем четыре дополнительные нити различной силы применяются на основании предыдущих ответов и порог механического рассчитывается согласно опубликованной формулы31. - Для каждого испытания сессии включают двусторонние hindpaws. Выполните три испытания для каждого hindpaw. Экспресс среднее значение этих шести механические порогов как средняя механическая порог (мг) каждого животного.
Рисунок 1. Заказные оргстекло клетке и металла сетка для оценки невропатической боли в мышиной модели resiniferatoxin (RTX)-индуцированной небольшой волоконно нейропатии. (A, B) Эти графики показывают оборудование, используемое для измерения (A) тепловой задержки на металлические плита (27 см × 29 см) с клетке прозрачный Plexiglas (длина × ширина × высота: 22 см × 22 × 25 см) и оценки (B) порог механического заказной мета l сетка (размер сетки: 5 × 5 мм) с сепаратором оргстекло полупрозрачные цилиндра (диаметр: 13 см, высота: 12 см) у мышей с RTX-индуцированной небольшой волоконно нейропатии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. Подготовка биопсии и оценки IENFs иннервации кожи
- После тестирования поведения анестезировать животных с 5% изофлюрановая и жертву животных, внутрисердечного перфузии с 0,1 М фосфатного буфера (PB) (рН 7,4) следуют параформальдегида 4% (4P) в 0,1 М PB.
- Вырезать первый башмаки двух hindpaws после перфузии и после фиксировать их в 4 P для другой 6 h. Передача ткани зверолов 0,1 М PB на 4 ° C для длительного хранения.
- Cryoprotect башмаки с 30%-ая сахароза в одночасье PB и нарезать в вертикальной подошвенной поверхности манере ломтиками толщиной 30 мкм. Ярлык зверолов разделы последовательно, а затем хранить в антифриз при-20 ° C.
Примечание: Состав антифриз является следующим: дистиллированная вода, глицерол этилена, глицерина и 2 x PB в соотношении 3:3:3:1. - Для обеспечения адекватной выборки, выберите каждый третий раздел зверолов.
- Добавление выбранной зверолов разделы на стекло с покрытием слайды и просушите их.
- Обложка пластиковые вентильной плитой на слайд и процесс с стандартным иммуноокрашивания процедур.
- Утолить зверолов секции с 1% H2O2 в метаноле 30 мин и блокировать с обезжиренное сухое молоко 0,5% и 0,1% тритон X-100 в 0.5 М трис-буфере (Tris) за 1 ч.
- Инкубировать зверолов секции с антисыворотками против Пан аксональное маркер, PGP 9.5 (поднял в Кролик; 1:1, 000), на ночь при 4 ° C.
- Инкубировать зверолов секции с биотинилированным коза анти кролик IgG вторичное антитело при комнатной температуре (RT) за 1 ч, затем и инкубировать и с авидин Биотин комплекс в РТ по 45 мин.
- Визуализировать продукт реакции с 0,05% 3, 3'-диаминобензидин (DAB) решение для 45 s. Затем вымойте зверолов секции с дистиллированной водой и просушите их монтажа.
Примечание: Первичный и вторичный антисыворотками разрежаются с 0,5% обезжиренное сухое молоко в 0,5 М трис.
4. DRG секции подготовки и оценки потерпевшего нейронов малого диаметра
- Вскрыть 4-й и 5й поясничный DRG и после исправления для еще 2 ч.
- Cryoprotect DRG тканей с 30%-ая сахароза в PB на ночь и сократить до толщины 8 мкм последовательно, на скольжениях микроскопа и метка. Хранить DRG разделами в морозильной камере-80 ° C.
- Имунноконтраст DRG разделы в 80 мкм интервалы для обеспечения адекватного выборки.
- Выполните процедуры иммуноокрашивания DRG как те зверолов разделов, за исключением двойного маркировки immunofluorescent процедур. Кроме того, включают ATF3 (поднял в Кролик; 1: 100), маркер травмы и peripherin (поднял в мышь; терапевтами), малого диаметра нейрональных маркер в первичной антисыворотками.
- Инкубировать DRG секции с смеси первичных антисыворотками на ночь при 4 ° C.
- Инкубировать DRG секции с либо Техас красный или флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных вторичных антисыворотками (1: 200), соответствующий соответствующей первичной антисыворотками в РТ за 1 ч, а затем смонтировать для количественной оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает модель Роман мыши RTX нейропатии, который конкретно затрагивает малого диаметра нейронов, включая IENF дегенерации, связанные с сенсорными расстройствами (рис. 2). После протокол, описанные здесь животных выставлены hypoalgesia тепловых и механических аллодиния на D7 пост RTX инъекций. Установить этот небольшой волоконно нейропатии модель, три дозы RTX: 200, 50 и 10 мкг/кг были ведении и.п. маршрут. RTX дозе (50 мкг/кг) была сочтена критических и предварительное исследование показало что высок дозы RTX (200 мкг/кг) вызвало высокий мыши летальности (рис. 3).
Рисунок 2. Схема модели мыши resiniferatoxin (RTX)-индуцированной небольшой волоконно нейропатии. Схема показывает протокол установленных RTX-индуцированной небольшой волоконно нейропатии. Для систематической оценки, оценки поведения и патологического обследования она включала поджарки и фон Фрей тесты и двойной меченых иммуноокрашивания исследований, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Доза эффект resiniferatoxin (RTX) на животных летальности и поведенческая дисфункция. (A) различных доз RTX были в ведении инъекций внутрибрюшинного (и.п.). Поражающее действие эффекта доза была дозозависимый; Например, высок дозы RTX (200 мкг/кг) вызвало 100% летальность. (B, C) Тепловой задержек и механические пороги были оценены с плитой (B) и фон Frey накаливания тесты (C), соответственно. Дозе 50 мкг/кг RTX индуцированных hypoalgesia тепловых и механических аллодиния, по сравнению с автомобиля и 10 мкг/кг управляемые группы. Открытые площади, транспортное средство; Откройте круг, 50 мкг/кг; Откройте алмаз, 10 мкг/кг. Пунктирная линия в (B), точку отсечки время поджарки теста. p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Патологически, там был IENF дегенерация и отмеченные ATF3 индукции. Двухместный маркировки исследования показали, что потерпевшее нейроны были специально peripherin(+) малого диаметра нейронов. В отличие от этого, низкодозированные RTX (10 мкг/кг) не создать небольшой волоконно нейропатии, включая никаких изменений в IENF иннервации (Рисунок 4) и не нейронных травмы (ATF3 индукции) (Рисунок 5). Соответственно этот протокол считает дозе 50 мкг/кг, решающее значение для установления модель мыши малых волокна нейропатии.
В резюме систематические RTX администрации с дозе 50 мкг/кг специально затронуты мелких нервных волокон. Например это привело к повреждения нейронов сома и периферийных IENF дегенерации, которые связаны с сенсорными нарушениями.
Рисунок 4. Дегенерация intraepidermal нервных волокон (IENFs) в resiniferatoxin (RTX) нейропатии. (A-C) Разделах ткани от кожи зверолов мышей были immunostained с анти белка гена продукт 9.5 (PGP 9.5) антисыворотками в транспортном средстве (A), 50 мкг/кг-(B) и 10 мкг/кг управляемые (C) групп. PGP 9.5(+) IENFs возникают из субэпидермальной нервных сплетений с типичный вид варикозного расширения. PGP 9.5 (+) IENFs заметно сокращаются в 50 мкг/кг, но не в группе 10 мкг/кг. (D) IENFs были предел по результатам иммуногистохимических A-C. Открытые площади, транспортное средство; Откройте круг, 50 мкг/кг; Откройте алмаз, 10 мкг/кг. p < 0,001 по сравнению с группой транспортного средства. Шкалы, 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Специфика малого диаметра нейронных травмы в resiniferatoxin (RTX) нейропатии. (A-C) Двухместный маркировки immunofluorescent окрашивание была выполнена с анти активация транскрипции фактор-3 (ATF3; A-C, в зеленый) и peripherin (A-C, красным) в автомобиле (A), 50 мкг/кг-(B) и 10 мкг/кг управляемые (C) групп. (D) диаграмма показывает изменения плотности ATF3(+) нейронов. ATF3(+) нейроны были увеличены в 50 мкг/кг, но не в транспортное средство и 10 мкг/кг групп. Открытые площади, транспортное средство; Откройте круг, 50 мкг/кг; Откройте алмаз, 10 мкг/кг. p < 0,001 по сравнению с группой транспортного средства. Шкалы, 25 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективной терапии нейропатии малых волокна в клинике требуется для восстановления функций и качество жизни пациентов. В настоящее время есть отсутствие руководства терапевтических ориентации сенсорные расстройства, связанные с небольшой волоконно нейропатии из-за отсутствия полное понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе нейронных травмы малого диаметра. Предыдущие модели нейропатии обычно затрагивает оба сенсорные нервы большого и малого диаметра; например модели химиотерапии индуцированной нейропатии12,,3233 и механические индуцированной нейропатии34,35. Таким образом вклад мотор слабость и большого диаметра чувствительных нервных ущерб не могут быть полностью исключены в поведенческих тестирование этих моделей нейропатии. Настоящий Протокол описывает новую модель небольшой волоконно нейропатии у мышей, которая влияет только на сенсорные нервы малого диаметра, предоставляя патологических и функциональных свидетельства о IENFs дегенерации.
RTX является ultrapotent агониста TRPV1 и аналогом капсаицин, который может привести к потере peptidergic DRG нейронов в культуре36 и в естественных условиях систем18,19. Предыдущие исследования RTX и капсаицин главным образом были посвящены морфологических и функциональных потери DRG нейрональных клеток тела, которые показали роль TRPV1 в тепловой передачи ответ37,,3839. Кроме того предыдущие исследования продемонстрировали систематического лечения RTX высок дозы (200 мкг/кг) в организме крыс, индуцированных механических аллодиния и тепловой hypoalgesia, возможно из-за патологии большого диаметра нервных волокон28. Доза 200 мкг/кг, однако, является летальная доза в мышей, и этот текущий протокол разработали модель нейропатии чистый небольшой волоконно путем уменьшения RTX дозе (50 мкг/кг). Эта доза RTX (50 мкг/кг) имеет решающее значение для создания чистой небольшой волоконно нейропатии модели, которая превосходит что сообщалось ранее28, как он жалеет большие волокон18. То есть это влияет только на небольших нервных волокон; именно, получили ранения только малого диаметра нейронов, как подтверждается индукции ATF3 upregulation6,40 малого диаметра DRG нейронов и IENFs дегенерация6,18,19 ,41, связанные с сенсорными нарушениями. Эти патологические проявления всесторонне имитировать клинических симптомов нейропатии малых волокна. Кроме того этой текущей модели индуцированной типичный невропатологии и невропатической боли профиль малых волокна нейропатии и эффекты длился 8 недель после RTX лечения6,18,19. Длительности невропатологии и невропатической боли были эквивалентны и может быть обращена вспять путем содействия синтез фактора роста нервов (ФРН)18,40,41. Коллективно этот протокол как создана модель нейропатии чистый небольшой волокна и выделены возможные терапевтический потенциал NGF.
Клинически золотой стандарт для расследования невропатий, затрагивающих малого диаметра ноцицептивных нервы8,9 -biopsying конечности кожи для оценки иннервации кожи. Наш текущий отчет применяется этот метод к коже зверолов экспериментальных животных для оценки иннервации кожи небольшой волоконно нейропатии модели, которая может имитировать патологии IENFs в клинике, а также Исследована морфологическая профили DRG разделы с маркером травмы, ATF3, чтобы выявить патологические состояния нейрональных somata. В частности пространственного распределения IENFs в пределах эпидермиса высоко ветвления и подсчета критерии являются основным фактором, ведущим к статистические различия между группами. Например наш текущий протокол считается каждый IENF с ветвлением точек только в дерме и IENFs с ветвлением точками в пределах эпидермиса единый18,IENF14,19. Этот критерий может быть причиной более низкую плотность IENFs в наших исследований, чем в других групп. Мы подготовили и обработки кожи и секции DRG экспериментальных животных на основе систематической и массовой оценки с нашей нынешней измененного Протокола. Соответственно эти систематические исследования IENF дегенерация и нейронных травмы может избежать стереологических смещения функциональных и патологических условиях малого диаметра нейронов в небольших волокна нейропатии.
Функциональная оценка нервов малого диаметра с поведенческой тестирования, особенно с нетоксичная приложения нити волос фон Frey, традиционно применялся для кожи пациентов для диагностики механических чувствительность базовой небольшой волоконно нейропатии. Наблюдение за механических аллодиния подопытных животных сложной из-за ног заземления на металлической сетки, которая считается внешних механических раздражений, и животные очень активны во время испытаний. Текущий протокол оптимизирован определенного размера сетки проволока пол (5 × 5 мм) в клетке полупрозрачных пластиковых экологической адаптации экспериментальных животных на поведенческие тесты. Этот размер сетки пола может уменьшить экзогенных стимуляции ног заземления и избежать фут снижается.
Эта модель мыши RTX невропатии могут применяться для различных типов малых волокна нейропатии, таких как диабет, который связан с IENF дегенерация1,42. Однако эта модель остается ограниченным. К примеру животной модели спинного нерва лигирование43 с характеристиками малых волокна нейропатии, именуемый радикулопатии в клинике, может также повлиять на большие волокон в спинномозговой корешок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана от грантов от министерства науки и технологии (106-2320-B-037-024), медицинский университет Гаосюн (KMU M106028, КМУ-S105034) и цель для топ университетов Грант (TP105PR15), медицинский университет Гаосюн, Тайвань.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
