Summary
Questo studio stabilisce un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra con resiniferatossina (RTX). Una dose unica di RTX (50 µ g/kg) è ottimale per lo sviluppo di un modello di neuropatia di piccole fibre che imita le caratteristiche dei pazienti e potrebbe aiutare a studiare il significato molecolare nocicettivo sottostante il dolore neuropatico.
Abstract
I pazienti con diabete mellito (DM) o quelli che avvertono gli effetti neurotossici di agenti chemioterapeutici possono sviluppare disturbi della sensazione a causa di degenerazione e lesioni dei neuroni sensoriali di piccolo diametro, indicato come neuropatia delle piccole fibre. Presenti modelli animali della neuropatia delle piccole fibre influenzano entrambi fibre sensoriali di diametro grande e piccolo e così creano un neuropathology troppo complessa per valutare adeguatamente gli effetti dell'infortunato fibre sensoriali di piccolo diametro. Pertanto, è necessario sviluppare un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra di esaminare adeguatamente questi problemi. Questo protocollo descrive un modello sperimentale di neuropatia delle piccole fibre in particolare che interessa i nervi sensoriali di piccolo diametro con resiniferatossina (RTX), un ultrapotent agonista del recettore transitoria potenziali vanilloidi tipo 1 (TRPV1), attraverso una singola dose di iniezione intraperitoneale, indicato come neuropatia RTX. Questa neuropatia RTX ha mostrato manifestazioni patologiche e le anomalie del comportamento che imitano le caratteristiche cliniche dei pazienti con neuropatia delle piccole fibre, tra cui la degenerazione di intraepidermal fibre nervose (IENF), in particolare lesioni in neuroni di piccolo diametro e l'induzione di hypoalgesia termica e allodinia meccanica. Questo protocollo testato tre dosi di RTX (200, 50 e 10 µ g/kg, rispettivamente) e ha concluso che una dose critica di RTX (50 µ g/kg) è necessaria per lo sviluppo delle manifestazioni di neuropatia tipica piccola fibra e preparato una procedura di immunostaining modificate per indagare IENF degenerazione e lesioni di soma neuronale. La procedura modificata è veloce, sistematica ed economica. Valutazione comportamentale del dolore neuropatico è fondamentale per rivelare la funzione dei nervi sensitivi di piccolo diametro. La valutazione delle soglie meccaniche nei roditori sperimentali è particolarmente impegnativa e questo protocollo descrive una rete metallica su misura che è adatta per questo tipo di valutazione nei roditori. In sintesi, la neuropatia RTX è un nuovo e facilmente stabilito modello sperimentale per valutare il significato molecolare e intervento sottostante dolore neuropatico per lo sviluppo di agenti terapeutici.
Introduction
Neuropatia delle piccole fibre che coinvolge il dolore neuropatico, che è evidente dalla degenerazione di IENFs, è comune a vari tipi di condizioni, quali DM e come conseguenza degli effetti neurotossici di agenti chemioterapeutici1,2, 3,4,5. IENFs sono i terminali periferici di piccolo diametro neuroni situati nei gangli di radice dorsale (DRG) e sono interessati in parallelo nei casi di degenerazione di IENF6. Ad esempio, la trascrizione genetica a Monte alterata di somata neuronali ha dimostrata il upregulation di attivazione trascrizione factor-3 (ATF3)6,7. Inoltre, la valutazione dell'innervazione IENFs con la biopsia della pelle è utile per la diagnosi di piccole fibre neuropatia5,8,9. Tradizionalmente, i profili di IENFs sulla biopsia della pelle hanno dipendeva dimostrazione immunohistochemical del prodotto del gene della proteina di 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Presi insieme, i profili patologici dei DRG e IENFs riflettono la neuropatia delle piccole fibre sottostante condizione funzionale e possono essere un indicatore per le conseguenze funzionali di questo tipo di neuropatia sui neuroni di piccolo diametro.
In precedenza, diversi modelli sperimentali hanno affrontato la questione della degenerazione IENF nei casi della neuropatia indotta da chemioterapia12,13 e nervo ferita causata da compressione o transection14,15 , 16. questi modelli sperimentali anche colpiti i nervi di grande diametro; era, quindi, non è possibile escludere il contributo dei nervi interessati di grande diametro nella neuropatia osservati piccola fibra; per esempio, l'esame di thermosensation disordine da ritiro nociva dipende dalle fibre nervose motorie funzionali17,18,19. Così, che stabilisce un modello di pura fibra piccola neuropatia e indagare sistematicamente lo stato patologico di somata neuronali e loro fibre nervose periferiche cutanee nei neuroni di piccolo diametro sono necessarie e imperativo.
RTX è un analogo di capsaicina e un potente agonista al recettore transitoria potenziali vanilloidi recettore 1 (TRPV1), che media elaborazione nocicettivo20,21,22. Recentemente, periferico RTX trattamento alleviato dolore neurogeno23,24,25 e un'iniezione intragangliari di RTX indotto irreversibile perdita di neuroni DRG22. L'effetto della somministrazione periferica di RTX è dose-dipendente20,26,27, che ha provocato la desensibilizzazione transitoria o degenerazione di IENFs. Intrigante, sistematico della alto-dose RTX trattamento ha condotto a dolore neuropatico28, un sintomo della neuropatia delle piccole fibre. Questi risultati suggeriscono che la modalità di trattamento e la dose di RTX produrre effetti patologici distinti e risposte neuronali; vale a dire, somministrazione periferica impedita la trasmissione del dolore da effetti locali29 e colpite il somata neuronale che sviluppato neuropatico comportamento6. Collettivamente, questi risultati indicano che RTX ha un effetto di multipotenza e sollevato la questione se esista una dose specifica di RTX che potrebbero influenzare sistematicamente i nervi periferici, come il IENFs periferico e centrale somata neuronali. Se è così, RTX potrebbe essere un potenziale agente specificamente influenzano i neuroni di piccolo diametro e imitano neuropatia delle piccole fibre nella clinica. Ad esempio, DM nella clinica è una questione complessa compreso disordine metabolico e neuropatologia dei nervi periferici, che sono le principali caratteristiche della neuropatia delle piccole fibre. I meccanismi della neuropatia associata DM piccola fibra non ha potevano escludere il contributo del disordine metabolico che potrebbe non essere l'agente principale che interessa i nervi periferici. Di conseguenza, neuropatia associata DM piccola fibra richiede un modello animale puro che potrebbe escludere gli effetti di sistematico disordine metabolico. Questo protocollo descrive la dose di lavoro di RTX per sviluppare un modello di neuropatia tipica piccola fibra, compreso IENF degenerazione e lesioni del neurone di piccolo diametro, come dimostrato dall'analisi di immunostaining modificate.
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Protocol
Tutte le procedure descritte sono in conformità con le linee guida etiche per laboratorio animali30, e il protocollo è stato approvato dalla animale Comitato di Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan.
1. istituzione di RTX neuropatia
Attenzione: RTX è neurotossico e pericolose. In contatto, agisce come un irritante per occhi, mucose e delle vie respiratorie superiori. Evitare l'inalazione e indossare occhiali da vista lab e cappotti durante la preparazione di RTX. Sciacquare abbondantemente con acqua in caso di contatto con la pelle o dopo la manipolazione.
- Aggiungere 1 mg di polvere di RTX a un 200 µ l di miscela di volume uguale di Tween 80 ed etanolo assoluto (100 µ l per ogni solvente).
- Aliquota della soluzione RTX (12 µ l/flaconcino) e conservare a-20 ° C, fino a 3 mesi. Questo costituisce il brodo RTX; scartare la soluzione RTX rimanente alla scadenza.
- Diluire lo stock RTX con salino normale ad un volume finale di 600 µ l. La concentrazione finale della soluzione RTX dovrebbe essere 0.01%, che equivale a 1 µ g RTX in 10 µ l di soluzione di veicolo.
- Utilizzare topi ICR maschio adulto di 8-settimana-vecchio (35-40 g) come animali da esperimento e somministrare una singola dose di soluzione RTX (dose: 200, 50 e 10 µ g/kg, rispettivamente) per via intraperitoneale (i.p.) con una siringa di microiniezione per i topi. Topi è stato anestetizzato di inalatore con isoflurano 5% per l'anestesia profonda. Se i topi hanno mostrato azione di ritiro delle estremità durante l'iniezione di RTX, topi dovrebbero prendere più tempo inalazione dell'anestesia.
Esempio: Se il mouse pesa 40 g, quindi riceverà 20 µ l della soluzione RTX, che rappresenta la dose di 50 µ g/kg. - Dare un volume uguale di veicolo (10% Tween 80 e 10% di etanolo assoluto in soluzione salina), un gruppo di topi come controllo.
- Dopo l'iniezione di RTX, restituire i topi di una gabbia di plastica su un 12-h luce/12-h scuro ciclo e forniscono cibo e acqua ad libitum.
2. valutazione del comportamento neuropatico
Nota: Mantenere gli animali in un ambiente confortevole (passo 1.6) per permettere il recupero dopo l'iniezione. Al 7 ° giorno post RTX ad iniezione (D7), ogni animale esegue i test di filamento di capelli piastra calda e von Frey il giorno stesso per ridurre i pregiudizi del tempo e promuovere l'efficienza dei test comportamentali. Portare gli animali in una camera tranquilla che è mantenuta ad una temperatura (27 ° C) e umidità stabile (40%) per ottimizzare acclimatazione degli animali e ridurre gli effetti ambientali durante i test comportamentali. Non disturbare gli animali durante i periodi di prova; i test comportamentali sono previsti settimanalmente.
- Misurazione delle latenze termiche con il test della piastra calda
- Metti l'animale delicatamente su un piatto di metallo caldo (27 cm × 29 cm) con una gabbia di Plexiglas trasparente (lunghezza × larghezza × altezza: 22 cm × 22 cm × 25 cm; Figura 1A). Impostare la temperatura della piastra riscaldante in metallo a 52 ° C.
- Iniziare a misurare la durata della latenza termica dell'animale sulla piastra calda con il timer passo-on, built-in della piastra riscaldante una volta si dell'animale toccare la piastra calda e osservano le risposte del si dell'animale. Se l'animale Mostra agitazione, leccare di si, o saltando mentre sulla piastra calda, rimuoverlo e registrare la durata che l'animale è rimasto sulla piastra calda. Questa durata di tempo definisce la latenza termica di un singolo animale. Registrare la latenza termica la più vicina 0.1 s.
- Per ogni sessione di test, è necessario eseguire tre prove con intervalli di 30 min per la normalizzazione di risposta dopo l'ultima prova della piastra calda. Se l'animale non è nessuna risposta sulla piastra calda, interrompere la sessione dopo 25 s per evitare potenziali danni ai tessuti.
- Test di misurazione della soglia meccanica con il filamento di capelli di von Frey
- Mettere l'animale sulla maglia metallica su misura (dimensioni delle maglie: 5 × 5 mm) con una gabbia di Plexiglas semi-trasparente cilindro (diametro: 13 cm; altezza: 12 cm) (Figura 1B) per acclimatazione per almeno 2 h.
- Applicare i diversi calibri dei filamenti di capelli di von Frey alla regione plantare del hindpaw con il metodo altalenante31. Avviare applicazione iniziale dalla forza centrale di un insieme di filamenti di von Frey capelli per una durata di applicazione di filamento di 5-8 s.
- Utilizzare un intervallo di 2 minuti tra le applicazioni del filamento per ottimizzare la normalizzazione degli animali. Cambiare la forza applicata filamento basata sulla risposta ultima dell'animale.
Nota: Un insieme di filamenti di capelli di von Frey costituito 0,064, 0,085, 0,145, 0,32, 0,39, 1.1 e 1,7 g forza applicazione. Ad esempio, se si è verificato hindpaw ritiro con una forza iniziale di 0,32 g, quindi applicare 0,145 g. In assenza di ritiro della zampa, quindi viene applicata una forza di 0,39 g. Ulteriori quattro filamenti delle diverse forze vengono applicate in base alle risposte precedenti, quindi il limite meccanico è calcolato secondo una formula pubblicato31. - Per ogni sessione di test, sono la bilaterale si. Eseguire tre prove per ogni hindpaw. Esprimere la media di queste sei soglie meccaniche come la soglia meccanica media (mg) di ogni animale.
Figura 1. Su misura gabbia di Plexiglas e metallo mesh per la valutazione del dolore neuropatico nel modello del topo di resiniferatossina (RTX)-indotto neuropatia delle piccole fibre. (A, B) Questi grafici mostrano l'attrezzatura utilizzata per misurare (A) le latenze termiche da una piastra in metallo (27 cm × 29 cm) con una gabbia di Plexiglas trasparente (lunghezza × larghezza × altezza: 22 cm × 22 cm × 25 cm) e valutazione (B) la soglia meccanica di una meta su misura maglia l (maglia taglia: 5 × 5 mm) con una gabbia di Plexiglas semi-trasparente cilindro (diametro: 13 cm; altezza: 12 cm) nei topi con la neuropatia indotta da RTX piccola fibra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. pelle biopsia preparazione e valutazione di innervazione IENFs
- Dopo comportamento test, anestetizzare gli animali con 5% isoflurane e sacrificare animali, mediante perfusione intracardiaca con tampone fosfato 0,1 M (PB) (pH 7.4), seguiti da paraformaldeide al 4% (4P) in PB 0,1 M.
- Tagliare il primo footpads dei due si dopo perfusione e post-loro fissarsi in 4P per h. 6 un altro trasferimento del tessuto grassatore a PB 0,1 M a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Cryoprotect footpads con 30% di saccarosio in PB durante la notte e taglio in verticale alla superficie plantare maniera in fette dello spessore di 30 µm. Etichetta il grassatore sezioni in sequenza e quindi memorizzare in antigelo a-20 ° C.
Nota: La composizione di antigelo è come segue: acqua distillata, glicerolo di etilene, glicerolo e 2 x PB in un rapporto di 3:3:3:1. - Per garantire un prelievo corretto, selezionare ogni terza sezione del grassatore.
- Mettere le sezioni selezionate grassatore sulle lastre di vetro rivestito e li asciugare all'aria.
- Coprire una piastra di copertura in plastica sulla diapositiva e processo con procedure standard che immunostaining.
- Placare le sezioni grassatore con 1% H2O2 in metanolo per 30 min e bloccare con latte in polvere senza grassi 0,5% e 0,1% Triton X-100 nel buffer 0.5 M Tris (Tris) per 1 h.
- Incubare per sezioni grassatore con antisieri contro pan axonal marcatore, PGP 9.5 (alzato dentro coniglio; 1:1, 000), una notte a 4 ° C.
- Incubare le sezioni grassatore con un anticorpo biotinilato capra anti-coniglio IgG secondario a temperatura ambiente (TA) per 1 h e poi incubare con il complesso avidina-biotina al RT per 45 min.
- Visualizzare il prodotto di reazione con 0,05% 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) soluzione per 45 s. Poi lavare sezioni grassatore con acqua distillata e asciugare li per il montaggio.
Nota: Gli antisieri primari e secondari sono diluiti con latte in polvere senza grassi 0,5% a 0,5 M Tris.
4. DRG sezione preparazione e valutazione dei feriti neuroni di piccolo diametro
- Sezionare il 4th e 5th lombare DRG e post-fix per un altro 2 h.
- Tessuti Cryoprotect DRG con 30% di saccarosio in PB durante la notte e tagliare a un 8-µm di spessore in sequenza, posizionare su vetrini da microscopio e l'etichetta. Memorizzare sezioni DRG in un congelatore a-80 ° C.
- Sezioni di Immunostain DRG in 80 µm-intervalli per garantire un prelievo corretto.
- Eseguire procedure di immunostaining DRG come quelli delle sezioni grassatore, fatta eccezione per le procedure di immunofluorescenza doppia marcatura. In alternativa, includere ATF3 (alzato dentro coniglio; 1: 100), un indicatore di pregiudizio e desmina (alzato dentro mouse; 1: 800), un marker neuronale di piccolo diametro in antisieri primari.
- Incubare le sezioni DRG con la miscela di antisieri primari durante la notte a 4 ° C.
- Incubare le sezioni DRG con entrambi Texas rosso o fluoresceina isotiocianato (FITC)-coniugato secondari antisieri (1: 200), corrispondente a antisieri primari appropriati al RT per 1 h e poi montare per quantificazione.
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Representative Results
Questo protocollo descrive un modello di topo romanzo della neuropatia RTX, che colpisce in particolare i neuroni di piccolo diametro, compreso degenerazione IENF, associata a disturbi sensoriali (Figura 2). Seguendo il protocollo descritto nel presente documento, gli animali hanno esibito hypoalgesia termica e allodinia meccanica presso D7 post iniezione RTX. Per stabilire questo modello di neuropatia di piccole fibre, tre dosi di RTX: 200, 50 e 10 µ g/kg sono stati amministrati per via i.p.. La dose RTX (50 µ g/kg) è stata ritenuta critica e lo studio preliminare ha mostrato che della alto-dose RTX (200 µ g/kg) ha causato letalità elevata del mouse (Figura 3).
Figura 2. Schema del modello del topo di resiniferatossina (RTX)-indotto neuropatia delle piccole fibre. Lo schema mostra il protocollo della neuropatia stabiliti indotta da RTX piccola fibra. Per la valutazione sistematica, la valutazione del comportamento e l'esame di neuropathological, inclusa la piastra calda e von Frey test e studi double-labeled immunostaining, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Dose-effetto di resiniferatossina (RTX) su animali letalità e disfunzione comportamentistica. (A) Diverse dosi di RTX sono state amministrate tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.). La letalità dell'effetto dose era dose-dipendente; ad esempio, un'alto-dose di RTX (200 µ g/kg) ha causato mortalità 100%. (B, C) Latenze termiche e meccanica delle soglie sono state valutate con la piastra (B) e test di von Frey filamento (C), rispettivamente. Una dose di 50 µ g/kg di RTX indotta hypoalgesia termica e allodinia meccanica rispetto al veicolo e al gruppo 10 µ g/kg-amministrato. Veicolo di quadrati, aperto; Aprire il cerchio, 50 µ g/kg; Aprire diamante, 10 µ g/kg. Linea tratteggiata in (B), punto di tempo di taglio della piastra di prova. p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Patologico, ci era degenerazione IENF e contrassegnato ATF3 induzione. Doppia marcatura gli studi hanno mostrato che i neuroni feriti erano specificamente i neuroni di piccolo diametro di peripherin(+). In contrasto, la basso-dose di RTX (10 µ g/kg) non ha stabilito la neuropatia delle piccole fibre, tra cui nessun cambiamento nell'innervazione IENF (Figura 4) e nessuna lesione di un neurone (ATF3 induzione) (Figura 5). Di conseguenza, questo protocollo ritiene la 50 µ g/kg dose fondamentale per stabilire il modello murino di neuropatia delle piccole fibre.
In sintesi, amministrazione sistematica di RTX con dose di 50 µ g/kg in particolare interessati piccole fibre nervose. Per esempio, ha condotto al soma neuronale ferita e degenerazione IENF periferica, che sono associati con disturbi sensoriali.
Figura 4. Degenerazione delle fibre nervose intraepidermiche (IENFs) in neuropatia resiniferatossina (RTX). (A-C) Sezioni di tessuto dalla pelle grassatore dei topi immunostained con prodotto 9.5 (PGP 9.5) del gene della anti-proteina antisieri a bordo del veicolo (A), 50 µ g/kg-(B) e gruppi di 10 µ g/kg-amministrato (C). PGP 9.5(+) IENFs derivano dal plesso di nervo sottoepidermica con un tipico aspetto varicosa. IENFs PGP 9.5 (+) contrassegnato sono ridotti a 50 µ g/kg, ma non nel gruppo di 10 µ g/kg. IENFs (D) sono stati quantificati in base ai risultati di immunohistochemical di A-C. Veicolo di quadrati, aperto; Aprire il cerchio, 50 µ g/kg; Aprire diamante, 10 µ g/kg. p < 0,001 confrontato al gruppo del veicolo. Barra della scala, 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Specificità della lesione del neurone di piccolo diametro in neuropatia resiniferatossina (RTX). (A-C) Doppia marcatura immunofluorescente macchiatura è stata effettuata con anti-attivazione trascrizione factor-3 (ATF3; A-C, in verde) e la desmina (A-C, in rosso) all'interno del veicolo (A), 50 µ g/kg-(B) e gruppi di 10 µ g/kg-amministrato (C). (D), il diagramma indica le variazioni di densità dei neuroni ATF3(+). ATF3(+) neuroni sono stati aumentati a 50 µ g/kg, ma non nel veicolo e 10 µ g/kg gruppi. Veicolo di quadrati, aperto; Aprire il cerchio, 50 µ g/kg; Aprire diamante, 10 µ g/kg. p < 0,001 confrontato al gruppo del veicolo. Barra della scala, 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Terapia efficace della neuropatia delle piccole fibre nella clinica è necessaria per promuovere il recupero funzionale e la qualità della vita dei pazienti. Attualmente, c'è mancanza di una guida terapeutica targeting sensoriale disordine connesso con neuropatia delle piccole fibre dovuta alla mancanza di comprensione dei meccanismi molecolari alla base di lesione di un neurone di piccolo diametro. Modelli precedenti di neuropatia solitamente colpiti entrambi i nervi sensoriali di grande e piccolo-diametro; per esempio, i modelli della neuropatia indotta da chemioterapia12,32,33 e neuropatia indotta da meccanica34,35. Così, il contributo della debolezza di motore e danni del nervo sensoriale di grande diametro non poteva essere completamente escluso nel test del comportamento di questi modelli di neuropatia. Il presente protocollo descrive un nuovo modello di neuropatia delle piccole fibre nei topi, che colpisce solo i nervi sensoriali di piccolo diametro fornendo prove funzionali e patologiche di degenerazione IENFs.
RTX è un agonista ultrapotent di TRPV1 e un analogo di capsaicina, che potrebbe causare perdita di peptidergic neuroni DRG in coltura36 e in vivo sistemi18,19. Gli studi precedenti su RTX e capsaicina sono concentrati principalmente sulla perdita morfologica o funzionale di corpi delle cellule neuronali del DRG, che ha rivelato il ruolo di TRPV1 nella trasmissione termica risposta37,38,39. Inoltre, uno studio precedente ha dimostrato sistematico trattamento di RTX della alto-dose (200 µ g/kg) in ratti, indotto allodinia meccanica e termica hypoalgesia, probabilmente a causa di patologia di fibre nervose di grande diametro28. La dose di 200 µ g/kg, tuttavia, è una dose letale nei topi e questo protocollo corrente ha sviluppato un modello di neuropatia pura piccola fibra riducendo la dose RTX (50 µ g/kg). Questa dose di RTX (50 µ g/kg) è fondamentale per stabilire un modello di neuropatia pura piccola fibra, che è superiore a quello precedentemente segnalato28, come si risparmia grandi fibre18. Cioè, interessa solo piccole fibre nervose; vale a dire, solo i neuroni di piccolo diametro sono rimasti feriti, come confermato dall'induzione di ATF3 upregulation6,40 su neuroni di DRG di piccolo diametro e IENFs degenerazione6,18,19 ,41, associata a disturbi sensoriali. Queste manifestazioni patologiche completamente imitano i sintomi clinici della neuropatia delle piccole fibre. Inoltre, questo modello attuale ha indotto il neuropathology tipico e profilo di dolore neuropatico di neuropatia delle piccole fibre e gli effetti è durato 8 settimane post RTX trattamento6,18,19. Le durate di neuropatologia e dolore neuropatico erano equivalenti e potrebbero essere invertite promuovendo la sintesi del fattore di crescita nervoso (NGF)18,40,41. Collettivamente, questo protocollo sia stabilito un modello di pura fibra piccola neuropatia ed evidenziato il potenziale terapeutico possibile di NGF.
Clinicamente, il gold standard per lo studio di neuropatie che interessano i nervi nocicettivo di piccolo diametro8,9 è pelle di arto di biopsie per valutare l'innervazione della pelle. Il nostro rapporto attuale applicato questa tecnica per la pelle di zampa di animali da esperimento per valutare l'innervazione della pelle di un modello di neuropatia di piccole fibre, che poteva imitare la patologia del IENFs nella clinica e anche studiato i profili morfologici di DRG sezioni con l'indicatore di pregiudizio, ATF3, a rivelare lo stato patologico di somata neuronali. In particolare, le distribuzioni spaziali di IENFs all'interno dell'epidermide sono altamente ramificazione e i criteri di conteggio sono il fattore principale che conduce a differenza statistica fra i gruppi. Ad esempio, il nostro protocollo corrente contato ogni IENF con punti di ramificazione solo nel derma e IENFs con punti di ramificazioni all'interno dell'epidermide come una singola IENF14,18,19. Questo criterio potrebbe aver causato una densità inferiore di IENFs nelle nostre indagini rispetto a quelli di altri gruppi. Abbiamo preparato ed elaborato la pelle e le sezioni DRG di animali da esperimento in modo sistematico e di massa-valutazione con il nostro attuale protocollo modificato. Di conseguenza, queste indagini sistematiche di degenerazione IENF e lesione di un neurone potrebbero evitare la distorsione stereologiche delle condizioni patologiche e funzionali dei neuroni di piccolo diametro in neuropatia delle piccole fibre.
La valutazione funzionale dei nervi di piccolo diametro con comportamentali test, specialmente con innocua applicazione di filamento dei capelli di von Frey, è stato tradizionalmente applicata alla pelle dei pazienti per la diagnosi della fibra di piccolo sottostante di sensibilità meccanica neuropatia. L'osservazione di allodinia meccanica in animali da esperimento è difficile a causa di piedi sulla maglia metallica, che è considerata esogena stimolazione meccanica, di messa a terra e gli animali sono altamente attivi durante le prove. L'attuale protocollo ottimizzato un pavimento di wire mesh dimensioni specifico (5 × 5 mm) in una gabbia di plastica semi-trasparente per l'adattamento ambientale degli animali da laboratorio per i test comportamentali. Questa dimensione del pavimento maglia potrebbe ridurre la stimolazione esogena del piede a terra ed evitare piedi-caduta.
Questo modello di mouse RTX della neuropatia potrebbe essere applicato a diversi tipi di neuropatia delle piccole fibre, come il diabete, che è associata con degenerazione IENF1,42. Tuttavia, questo modello rimane limitato. Ad esempio, il modello animale di nervo spinale legatura43 con le caratteristiche della neuropatia delle piccole fibre, indicato come la radicolopatia in clinica, può anche interessare le grandi fibre nella radichetta spinale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (106-2320-B-037-024), Università medica di Kaohsiung (KMU-M106028, KMU-S105034) e obiettivo per il Top Università Grant (TP105PR15), Università medica di Kaohsiung, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
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