Summary
정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.
Abstract
마우스에 ejaculated 정액은 자 궁에 입금 됩니다. 사정 후 정액에서 젤 같은 일관성을 변경 물, 프로세스 라는 액 화. 이 연구에서 우리는 마우스 모델에서 여성 재생산 지역에서 후 ejaculated 정액을 수집 하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 성인 여성 쥐 발 정기 단계에서 남자의 감 금 소에 하룻밤 보관 되어 있었다. 다음날 아침, 결합 질에 copulatory 플러그의 존재에 의해 확인 됐다. 여성 쥐 copulatory 플러그와 안락사 했다 고 각 생식 관 (질, 자 궁, oviducts, 난소), 전체적으로 수집 된 정액을 포함 하는 닫힌된 시스템을 보장. 튜브에 정액을 풀어 질 렸와 생식로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었다. 분석에 대 한 최대 정액 볼륨을 보장 하기 위해, 한적한 집게는 나머지 정액을 추방 하는 질 끝에 난소에서 자 궁 뿔을 집어넣은 사용 되었다. 전체 생식 관은 다음 삭제 됩니다. 정액에 포함 된 튜브는 잠시 내려 냈 지. 25 μ 모 세관 피 펫 (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 튜브에 배치 했다. 25 μ 라인에 모 세관 튜브를 작성 하는 데 사용 하는 시간을 기록 했다. 검증 된 남성 종 축에서 정액은 일반적으로 25 μ 모 세관 튜브를 채우기 위해 약 60-180 s를 걸립니다. 이 정액 컬렉션 기술은 또한 정자 이미징 및 운동 성 분석 등 다른 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
Introduction
여성 재생산 지역 상위 및 하위 책자의 구성 됩니다. 위 재생산 지역에는 나 팔 관, 자 궁 그리고 endocervix는 포함 되어 있습니다. 낮은 재생산 지역에는 ectocervix 및 질 포함 됩니다. 인간에서는, ejaculated 정액 ectocervix1에 인접 한 질 앞쪽 벽에 입금 됩니다. 그러나 쥐,, 정액은 휩 쓸 자 궁으로2짝짓기 후 분 이내.
정액 침투 수를 정자를 일으키는 루의 초 이내에 경화 되 고3움직일 정액 젤을 포함 합니다. 액 화 물 일관성에 젤 같은에서 정액을 변경 하 여 고정된 정자를 해제 합니다. 이 과정은 정자의 운동 성 및 포유류 복제에 대 한 필수적입니다. 정액 액 화의 지식은 주로 어디 정액 문화 접시에 액 화 된다 생체 외에서 연구 기반으로 합니다. 인간에서는, 전립선 특정 항 원 또는 PSA (일컬어 kallikrein 관련 peptidase 3 또는 KLK3)의 효소 활동은 semenogelins (젤 형성 단백질 정액에 존재)4 의 가수분해를 통해 액 화에 대 한 주요 기여자 ,56. Semenogelins의 정자 이동성 증가 정액 coagulum에서 정자를 줘 라. 계란을 기름 지 게 나 팔 관으로 정자 수영을 해제. 액 화 (또는 정액 점도) 테스트는 불 임 클리닉 남성 불 임7평가에서 정액 분석을 위한 표준 초기 검 진 중 하나.
최근에 출판 된 기사를 정액 액체 여성 마우스 생식 관 후 짝짓기에서 수집 된의 분석 이후에 다 산 결함8를 일으킬 수 있는 액 화 결핍을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 결함이 액 정액 hyperviscosity 같은 남자9, 일반 액 화는 포유류 복제를 위한 불가결 제안에 불 임 사례의 11.8 32.3%에 기여 한다. 그러나, 연구 및 치료 액 결함의 남성7에 독점적으로 집중 했다. 여성 재생산 지역 정액 액 화에서 역할을 담당 하는 가능성은 탐구 하지. 따라서, 정액 수집 및 액 화 시간 측정 방법 연구 액 관심의 모델 생물에서 불 임의 원인 중 하나 될 수 있는지 여부를 결정 하는 새로운 진단 도구를 제공 합니다.
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Protocol
모든 동물 및 절차가이 연구에 사용 된은 WSU 승인 동물 프로토콜 #4702 # 4735과 워싱턴 주립 대학 (WSU) 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 합니다.
1입니다. 마우스
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사용 하 여 표준 C57BL/6J 성인 남성 쥐 또는 관심의 다른 긴장. 물과 음식 광고 libitum 액세스와 온도 및 습도 제어 환경에서 동물을 유지 한다.
- 8 주 정도에서 10 개월에 이르기까지 남성 브리 더를 사용 합니다. 실험에서 입증 된 종만을 사용 합니다.
-
재생산 지역 스 트로 겐 수용 체 α ( Esr1 유전자 인코딩)의 조직 선택적 삭제와 성인 여성 쥐를 사용 하 여 상피 세포10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, 녹아웃 또는 "코" 라고)이이 연구에서 littermates (Esr1f/f, "CTRL" 라는) 제어.
- 8 주 된 여성을 사용 합니다. 여성의 연령대의 실험에 따라 다양합니다.
- 아침 08시 h에 estrous 사이클의 단계를 결정 합니다. 주기의 발 정기 단계에서 여성만을 사용 합니다. 질 번짐 및 cytological 분석의 자세한 방법에 대 한 이전 게시 절차11를 참조 하십시오.
2. 짝짓기와 Copulatory 플러그를 평가
- 발 정기 (16시 h) 일에서 남자의 감 금 소에 여성을 집.
- 다음날 아침 (08시 h), 남성 마우스에서 여성을 구분 합니다.
- 짝짓기의 표시로 질 또는 copulatory 플러그의 유무를 이전에 게시 방법12 의 적응을 사용 합니다.
- 짧게 뒷 다리 사지를 들어 꼬리의 기지에서 여성 마우스를 잡아.
- 이쑤시개를 사용 하 여 질 오프닝에서 하얀 정액 coagulum의 존재에 의해 copulatory 플러그를 찾아. 있으면 copulatory 플러그, 이쑤시개 질 운하에 삽입할 수 없습니다.
3입니다. 조직 컬렉션 전에 준비
- 10 mL Leibovitz의 L-15 미디어, 보충 1% 태아 둔감 한 혈 청의 준비 (라고 L15 미디어 + 1 %FBS) 15 mL 튜브에. waterbath에 15 분 동안 37 ° C에서 미디어를 품 어.
- 조직 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정자의 생존을 위해, 미리 데워 진 L15 미디어 + 1%의 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge에서 FBS 조직 컬렉션에 대 한 관.
- 37 ° c.에 stereomicroscope의 단계를 따뜻한 37 ° C로 열 블록을 설정 하 고 블록에는 빈 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치.
- 다운스트림 응용 프로그램에서는 정자의 운동 성, 따뜻한의 37 ° c 유리 슬라이드 이미징 하는 경우
4. 조직 컬렉션
- 조직 컬렉션 영역에 미리 따뜻하게 L15 미디어 + 1 %FBS 약 수를가지고.
- 여성 안락사 (~ 08:30 h) 자 궁 경관 탈 구 다음 이산화탄소 질 식을 사용 하 여.
참고: 이것은 대략 8 h 짝짓기 후 가정 자정에 일어난 짝짓기입니다. - 복 부 영역을 노출 하는 부정사 위치에 동물을 놓습니다.
- 복 부 뒷 다리 사지 근처에 70% 알코올을 스프레이.
- 낮은 복 부의 피부에 작은 상처 (~ 1 cm)을 해가 위를 사용 합니다.
- 지배적인 손을 꼬리 (및 필요한 경우 뒷 다리 사지)를 사용 하 여 비 지배적인 손을 당긴 다 피부 (머리)를 향해 반대 방향으로 복 부 근육을 노출 하는 동안. 이 메서드는 내장 장기에 머리 오염의 최소화 하는 데 사용 됩니다.
- V-모양에 인접 한 질, 복 부의 기지에서 내장 장기를 노출 하는 복 부 근육을 잘라.
- 내장 및 복 부 지방 노출 재생산 지역 쪽으로 이동 합니다.
- 방광과 질 영역 위에 다른 조직에서 트림.
- 음모 관절 질 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 떨어져 잘라.
- 질에 질 직물 들어올린 직장 조직에서 질 운하를 분리 하는 위를 사용 하 여.
- 신중 하 게 봄이 위를 사용 하 여 자 궁의 양쪽에서 mesenteric 지방에서 트림.
주의: 자 궁 안에 정액 매우 깨지기 쉬운입니다. 자 궁을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오 또는 다른 정액 손실 됩니다. - 더 낮은 재생산 지역 들어올리고 양쪽의 난소 지방 패드를 잘라 합니다.
- 미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 + 1%의 관에는 전체 생식 기관 전송 FBS.
5. 자 궁 콘텐츠 컬렉션에서 정액 액 화 (점도)의 측정
- stereomicroscope의 열띤된 무대에서 35mm 무 균 조직 문화 접시에 조직 3.5 mL 가득 전송 사전 예 열 L-15 미디어 + 1 %FBS 혈액과 다른 오염 물질의 조직 청소.
주의: 세척, 동안 지방, 아니라 자 궁 조직을 잡아. 정액이 시점에서 예상 되는 자 궁 안에 그대로 수. - 실험실 물티슈를 사용 하 여 초과 미디어의 조직 오 점.
- 미리가 열된 microcentrifuge 관에서 난소 끝을 배치 하면서 조직 질 끝에 잡으십시오. 질 끝을 잡고, 자 궁, 자 궁 뿔 microcentrifuge 튜브에 빠지게 할 수 있도록의 기지에서 자 궁 뿔을 잘라.
- 정액 하 게 튜브에 자 궁 뿔에서 흐름. 한적한 포 셉을 사용 하 여 부드럽게 질 끝, 남은 정액 밖으로 추방 하는 난소에서 자 궁 뿔을 짠 다.
- 생물 학적 가방에서 티슈를 삭제 하 고 소 각.
- 짧게는 minicentrifuge에 정액 아래로 회전 (1 ~ 2 s).
- 튜브, 열띤된 무대에 평행 하다-정액 밖으로 유출 하지 않습니다.
- 타이머를 준비 하 고 '을 계산 하 는'로 설정.
- (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 정액 샘플으로 25 µ L 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 이것은 다른 각도에서 모 세관 튜브를 잡고 각 조사 사이 가변성을 최소화 하는 것입니다.
- 모 세관 튜브 게 타이머를 누르면 정액과 접촉.
- 정액 25 µ L 라인에 도달 하는 데 걸리는 시간 (s)를 기록 합니다.
- 측정 완료 되 면 바로 추가 기능 분석, 정자 운동 성의 비디오 영상 등을 위해 건조 열 블록에 다시 정액을 포함 하는 튜브를 넣어.
- 20 분 동안 10% 표 백제 솔루션에서 튜브를 immersing 하 여 정액을 포함 하는 모 세관 튜브를 소독 하 고 세관 sharps 컨테이너에서 삭제.
6. 비디오 이미징 정자 운동 성의
- 현미경 및 비디오 이미징 소프트웨어 설정.
- 유리 슬라이드 온수 스테이지에 배치 하는 동안 미리 데워 진된 유리 슬라이드에 남은 정액의 20 µ L를 플라스틱.
- 유리 coverslip 커버.
- 현미경 슬라이드 coverslip 측면을 내려 놓습니다.
- 20 X 렌즈를 사용 하 여 관심 영역을 찾을 수 있습니다.
- 100 X 객관적 렌즈 비디오 영상에 대 한 변경 합니다.
- 30 12 프레임/s (fps)에서 비디오 s.
- 임의로 동물 당 적어도 3 개의 다른 영역에 동영상을 기록 합니다.
- 이미징 수행 신속 하 고 정자의 운동 성 및 생존 능력을 유지 하기 위해 슬라이드에 빛 노출을 최소화.
참고:이 이미징 절차는 2-3 분 내에서 행해져야 한다. - 앞에서 설명한8ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다.
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Representative Results
정액은 비옥한 CTRL 남성과 짝짓기 후 ctrl 키와 코 여성 약 8 h에서 수집 되었다. 액 화 (또는 정액 점도) 정액 25 μ 모 세관 튜브를 작성 하는 데 걸린 시간에 의해 정량 이다. 정액에서 CTRL uteri 수집 했다 2.06 ±0.12 분 (mean±S.E.M, n = 5) 모 세관 튜브 (그림 1)을 채우기 위해. 그러나, 정액 코 uteri에서 수집 했다 60 분 이상 (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 실험 시간. 이러한 데이터 정액은 크게 더 액 화 또는 CTRL에 보다 적게 점성 코 uteri에 비해 좋습니다.
여성 재생산 지역에서 정액을 모으기의 다운스트림 응용 프로그램 중 하나를 설명 하기 위해 정자 운동 성 비디오 이미지를 사용 하 여 평가 했다. 정액 그림 2A에서 스냅숏에서 미세한 필드 내에서 자유롭게 수영 정자를 보여주었다 CTRL uteri에서 수집. 코 uteri에서 수집한 정액 정액의 대부분 최소한의 이동성 (그림 2B) 함께 클러스터 했다 보여주었다. 이러한 연구 결과 정액 수집 여성 생식 관 8 h에서에서 짝짓기 더 정자 분석에 사용할 수 있습니다 나타냅니다.
그림 1 : 액 화 시간 (정액 점도) 정액에서 수집 마우스 uteri에서. 정액의 액 화 시간 (분)의 그래픽 표현을 짝짓기 후 약 8 h ctrl 키와 코 uteri에서 수집. 데이터를 나타내는 mean±S.E.M., n = 5 여성/유전자. p < 0.001, 짝이 없는 학생 t-테스트. 허가 이전에 게시 결과8 에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 정액 내 정자의 대표 이미지 마우스 uteri에서 수집. 정액에 정자의 1000 X 배율에서 찍은 비디오 영상에서 대표적인 스냅샷 ctrl 키 (A) 와 (B) 코 uteri에서 수집. 이전 게시 결과8 동의에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
같이 전 수 정액 및 여성 재생산 지역. 에서 분 비 물 간의 생리 적인 상호 작용 정액 분석에서 생체 외에서 이점을 제공할 수 있습니다 마우스 uteri에서 정액을 수집 이 연구에서 제시 하는 기술 연구원 정액 품질과 정자 생존으로 이상적인 생리 조건에서 운동 성을 확인 하 수 있습니다. 또한, 정액은 uteri에서 수집 된를 사용 하 여 수행할 수 있는 다양 한 다운스트림 분석, 예를 들어 정자 자 궁 및 정자 입력 실제 정자 수는 또한 운동 성 분석에 대 한 몇 군데 수 결정 계산 하실 수 있습니다. 수정 기능에 대 한 정액을 수집 하도록 이상적인 시간 포인트1짝짓기 후 1 ~ 2 h 이내 이어야 한다.
이전에 언급 한 다운스트림 응용 프로그램 뿐만 아니라 조사 또한 정자 수송에 억제제/화합물 관심의 효과 평가 수 처리, 정액 액 화 (또는 정액 점도), 정자 수, 정자에 운동 성, 또는 다른 지역 여성 생식 관의 정자 마이그레이션. 화합물8짝짓기 전에 여성 재생산 지역에 적용할 수 있습니다. 그런 다음, 그 억제제/화합물의 영향. 을 짝짓기 후 정액 샘플에서 평가 될 수 있다 이러한 메서드는 정자 수송을 억제 하는 피임 약의 실용성 테스트 유용할 수 있습니다.
정액 컬렉션 및 액 화/점도 측정에 대 한 배려의 중요 한 포인트는 정자의 감도 및 모 세관 튜브의 각도. 정자는 온도 변화에 민감합니다. 정자의 기능과 운동 성의 다운스트림 분석 실험 결과, 조직에 대 한 필수적 이며 정액에서 37 ° C에서 지켜질 필요가 경우 항상, 빛에 최소한의 노출. 만약 여러 여성에서 수집, 대기를 최소화 하기 위해 한 번에 한 동물을 안락사 여러 샘플을 확인 하 고 있습니다. 측정을 위해 액 화, 모 세관 튜브의 다른 각도 액 화 시간에 불일치를 생성합니다. 따라서, 조사자를 모 세관 튜브 튜브 벽에 병렬 (180 ° 각도)에서 각 조사에 의해 만들어진 변화를 최소화 하기 위해 있다. 정액 샘플 09시 h 이후에 수집 되어야 하지, 이것은 자 궁에서 액체 재흡수 때문 이다. 조사 하지 액 측정에 대 한 충분 한 액체 재료를 얻을 수 있습니다.
정액 액 화13전립선 분 비 하는 PSA의 효소 활동에 의해 중재 주로 설치 된다. 그러나, vivo에서 액 화 과정8동안 여성 생식 관의 역할을 결정 하기 위해 제한 된 연구 있다. 따라서, 컬렉션 여성 재생산 지역에서 정액의 액 화 연구에 중요 한 이점은 처리 vivo에서, 정액 여성 재생산 지역14에서 분 비 물에 노출 되었습니다 후 제공 합니다. 끝으로, 후 ejaculated 정액 액 화/점도 측정 정액과 여성 생식 기관 사이 상호 작용 해독 연구 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 ww 수의학 대학 (WSU) 시작 기금에 의해 지원 됩니다. 저자는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 시에라 올 슨 (WSU) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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