Summary
Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.
Abstract
Bei Mäusen lagert sich ejakuliert Sperma in die Gebärmutter. Nach der Ejakulation, ändert sich das Sperma von Gel-artige Konsistenz zu wässrig, einen Prozess namens Verflüssigung. In der vorliegenden Studie zeigen wir, wie das Post-ejakuliert Sperma von der weiblichen Fortpflanzungsorgane in einem Mausmodell zu sammeln. Erste, Erwachsene weibliche Mäuse in der Brunst waren über Nacht in einem männlichen Käfig untergebracht. Am nächsten Morgen bestätigte das Vorhandensein von copulator Stecker an die vaginale Öffnung Kopulation. Weibliche Mäuse mit copulator Stecker wurden eingeschläfert, und jeder Fortpflanzungsorgane wurden als Ganzes (Scheide, Gebärmutter, Eileiter, Eierstöcke), gewährleistet ein geschlossenes System, das Sperma enthalten. Die Fortpflanzungsorgane in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde, und die Scheide war, lassen Sie das Sperma in das Rohr abgeschnitten. Um maximale Samenvolumen für die Analyse zu gewährleisten, dienten zahnlose Zange, die uterine Hörner vom Eierstock Ende vaginalen Ende wegtreiben restlichen Sperma zu quetschen. Die gesamte Fortpflanzungsorgane wurde dann verworfen. Die Sperma-haltigen Röhre wurde kurz nach unten gesponnen. 25 μL Kapillare Pipette wurde in das Rohr in einem Winkel von 180° (Parallel zur Rohrwand) gelegt. Die Zeit genutzt, um das Kapillarrohr, 25 μL Linie zu füllen wurde aufgezeichnet. Sperma von einem bewährten männlichen Züchter dauert in der Regel ca. 60-180 s, ein 25 μL Kapillarrohr zu füllen. Diese Samen-Kollektion-Technik kann auch in anderen downstream-Anwendungen wie Bildbearbeitung und Motilität Spermiogramm verwendet werden.
Introduction
Die weiblichen Fortpflanzungsorgane besteht aus der oberen und unteren Flächen. Den oberen Genitaltrakt umfasst Eileiter, die Gebärmutter und die Endocervix. Die unteren Genitaltrakt umfasst das Ectocervix und der Vagina. Beim Menschen ist das Sperma ejakuliert an der vorderen Wand der Vagina, angrenzend an das Ectocervix1hinterlegt. Bei Mäusen jedoch wird das Sperma in die Gebärmutter innerhalb von Minuten nach der Paarung2gefegt.
Sperma enthält wegweisende Gel, das ist innerhalb von Sekunden der Ejakulation, verursacht die Spermien zu gefangen werden verfestigt und3immobilisiert. Verflüssigung löst das immobilisierte Sperma indem Sie Sperma aus einem gelartigen in eine wässrige Konsistenz ändern. Dieser Prozess ist unerlässlich für die Beweglichkeit der Spermien und Säugetieren Reproduktion. Kenntnis der Samen Verflüssigung basiert hauptsächlich auf in-vitro- Studien, wo Sperma in der Kulturschale verflüssigt wird. Beim Menschen ist die enzymatische Aktivität der Prostata-spezifisches Antigen oder PSA (auch bekannt als Kallikrein-bezogene Peptidase 3 oder KLK3) den größten Anteil zur Verflüssigung durch Hydrolyse von Semenogelins (Gel-bildende Proteine in der Samenflüssigkeit vorhanden)4 ,5,6. Abbau von Semenogelins befreit die Spermien von der bahnbrechenden Koagulum, zunehmende Mobilität der Spermien. Befreit Spermien schwimmen in Richtung Eileiter auf das Ei zu befruchten. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) Tests sind eines der standard ersten Vorführungen für Spermiogramm in Fruchtbarkeitskliniken männliche Ergiebigkeit7bewerten.
Ein kürzlich erschienenen Artikel zeigt, dass die Analyse der Samenflüssigkeit gesammelt aus der Maus weiblichen Genitaltrakt Post-Verpaarung verwendet werden, um einen Mangel an Verflüssigung zu illustrieren, die anschließend Fruchtbarkeit Defekte8verursachen können. Defekte Verflüssigung wie Sperma Hyperviskosität trägt zur 11,8-32,3 % der unfruchtbaren Fälle Männer9, darauf hindeutet, dass normale Verflüssigung für Säugetier-Wiedergabe unabdingbar ist. Jedoch haben Studien und Behandlung der Verflüssigung Mängel ausschließlich auf die männlichen7konzentriert. Die Möglichkeit, dass die weiblichen Fortpflanzungsorgane eine Rolle bei der Verflüssigung des Samens spielt ist nicht untersucht worden. Daher werden die Methoden zur Samengewinnung und Verflüssigung Messzeit Forscherinnen eine neuartige Diagnose-Tool um festzustellen, ob Verflüssigung eine der Ursachen der Unfruchtbarkeit bei Modellorganismus von Interesse sein könnte.
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Protocol
Alle Tiere und Verfahren, die in dieser Studie wurden nach Washington State University (WSU) Animal Care und Use Committee Richtlinien und unter Einhaltung der WSU zugelassene tierische Protokolle #4702 "und" #4735 bearbeitet.
(1) Mäuse
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Verwenden Sie standard C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen oder anderen Stämmen von Interesse. Tiere unter einer kontrollierter Temperatur und feuchte Umgebung, mit Ad Libitum Zugang von Wasser und Nahrung zu erhalten.
- Verwenden Sie männlichen Züchter von 8 Wochen bis 10 Monate alt. Verwenden Sie nur bewährte Züchter in den Experimenten.
-
Erwachsene weibliche Mäuse mit einem Gewebe selektives Löschen der Fortpflanzungsorgane Östrogen Rezeptor α (kodiert durch Esr1 gen) in den Epithelzellen10 verwenden (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, Ko- oder "KO" genannt) und Wurfgeschwistern (Esr1f/f, genannt "Strg") in dieser Studie zu kontrollieren.
- Verwenden Sie 8 Wochen alten Weibchen. Alter der Weibchen variiert in Abhängigkeit von dem Experiment von Interesse.
- Bestimmen Sie die Phasen des Estrous Zyklus morgens um 08:00 h. Verwenden Sie nur die Weibchen in der Brunst Phase des Zyklus. Für detaillierte Methoden der vaginalen verschmieren und zytologische Analyse beziehen sich auf die bisher veröffentlichten Verfahren11.
2. Paarung und Bewertung copulator Stecker
- Am Tag des Östrus (16:00 h) Haus der Frau in einer männlich Käfig.
- Trennen Sie am nächsten Morgen (08:00 h), das Weibchen von der männlichen Maus.
- Verwenden Sie eine Anpassung eines bereits veröffentlichten Methode12 , um das Vorhandensein oder Fehlen eines vaginalen oder copulator Steckers als Indiz für die Paarung zuzugreifen.
- Halten Sie die weibliche Maus von der Schwanzwurzel kurz anheben der Hintergliedmaßen.
- Finden Sie den copulator Stecker durch die Anwesenheit von ein wollweißer bahnbrechenden Koagulum an die vaginale Öffnung mit einem Zahnstocher. Wenn der copulator Stecker vorhanden ist, werden die Zahnstocher in den Vaginalkanal eingefügt nicht.
3. Vorbereitung vor dem Gewebe Sammlung
- 10 mL Leibovitzs L-15 Medien, ergänzt mit 1 % fötalen Rinderserum vorbereiten (namens L15 Medien + 1 % FBS) in einem 15 mL-Tube. Inkubieren Sie die Medien bei 37 ° C für 15 Minuten in ein Wasserbad.
- Um die Lebensfähigkeit des Gewebes und Sperma für downstream-Anwendungen zu erhalten, Rohr aliquoten 2 mL vorgewärmten L15 Medien + 1 % FBS in ein 2 mL Microcentrifuge für Gewebe-Sammlung.
- Die Bühne des Stereomikroskops auf 37 ° c warm Der Heizblock auf 37 ° C festgelegt, und legen Sie einen leere 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in den Block.
- Wenn die downstream-Anwendungen erfordern imaging der Beweglichkeit der Spermien, warme Objektträger auf 37 ° C.
(4) Gewebe-Sammlung
- Das Gewebe Sammelgebiet bringen Sie vorgewärmten L15 Medien + 1 % FBS aliquoten.
- Das Weibchen einschläfern (~ 08: 30h) mit Kohlendioxid Erstickung gefolgt von zervikale Dislokation.
Hinweis: Dies ist etwa 8 Stunden nach der Paarung, geht man davon aus, dass die Paarung um Mitternacht stattfindet. - Legen Sie das Tier in Rückenlage, im Bauchbereich verfügbar zu machen.
- Sprühen Sie 70 % Alkohol auf dem Bauch in der Nähe der hinteren Gliedmaßen.
- Verwenden Sie die sezierenden Schere einen kleinen Schnitt (~ 1 cm) zu machen, auf die Haut des Unterleibs.
- Die dominante Hand verwenden, um die Rute (und Hintergliedmaßen ggf.) ziehen während der nichtdominanten Hand zieht die Haut in die entgegengesetzte Richtung (in Richtung zum Kopf), um die Bauchmuskulatur freizulegen. Diese Methode wird verwendet, um Haare Kontamination der viszeralen Organe zu minimieren.
- Schneiden Sie die Bauchmuskulatur in V-Form an der Unterseite des Bauches, angrenzend an die Vagina, die viszeralen Organe aussetzen.
- Verschoben Sie Darm und Bauchfett auf die Seite, die Fortpflanzungsorgane verfügbar zu machen.
- Schneiden Sie Blase und anderen Geweben über den vaginalen Bereich.
- Schneiden Sie Schambeinfuge auseinander, um Zugang zu der vaginalen Gewebe.
- Heben des vaginalen Gewebes an der Scheidenöffnung und mittels Schere um den vaginalen Kanal aus dem rektal Gewebe zu trennen.
- Schneiden Sie sorgfältig die mesenterialen Fett von beiden Seiten der Gebärmutter mit Feder Schere ab.
Achtung: Die Gebärmutter ist sehr empfindlich mit den Samen im Inneren. Achten Sie darauf, die Gebärmutter zu durchbohren, sonst werden die Samen verloren gehen. - Heben Sie den unteren Genitaltrakt und schneiden Sie die Eierstöcke Fettpolster Weg von beiden Seiten.
- Übertragung der gesamten Fortpflanzungsorgane in das Rohr des vorgewärmten Leibovitz L-15 Media + 1 % FBS.
5. Messung der Samen Verflüssigung (Viskosität) von uterinen Content Collection
- Auf der beheizten Bühne des Stereomikroskop, Übertragung, die das Gewebe in einen 35 mm steril Gewebekultur Teller mit 3,5 mL gefüllt vorgewärmt, L-15 Media + 1 % FBS zu die Geweben von Blut und anderen Schadstoffen zu reinigen.
Achtung: Beim Waschen, schnappen Sie sich das Gewebe durch das Fett nicht in die Gebärmutter. Zu diesem Zeitpunkt dürfte das Sperma in die Gebärmutter intakt sein. - Tupfen Sie das Gewebe des überschüssigen Medien mit Labor-Feuchttücher.
- Halten Sie das Gewebe am vaginalen Ende während des Einsetzens der Eierstöcken Ends in den vorgewärmten Microcentrifuge Schlauch. Halten Sie das vaginale Ende, schneiden Sie die uterine Hörner an der Basis der Gebärmutter, so dass die Gebärmutter Hörner in den Microcentrifuge Schlauch fallen.
- Lass das Sperma fließen aus der Gebärmutter Hörner in die Röhre. Verwenden Sie zahnlos Zange, um drücken Sie vorsichtig die uterine Hörner aus dem Eierstock Ende der vaginalen Ende, Vertreibung aus übrig gebliebenen Samen.
- Das Gewebe im Biohazard Beutel entsorgen und verbrennen.
- Kurz spin-down der Samen in ein Minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Legen Sie das Rohr parallel zu den beheizten Objekttisch - Sperma wird nicht austreten.
- Den Timer bereit und "aufwärts".
- Die Samenprobe in einem Winkel von 180° (parallel zu der Rohrwand) stecken Sie eine 25 µL Kapillarrohr. Dies ist die Variabilität zwischen jeder Ermittler aus dem Besitz der Kapillare in verschiedenen Winkeln zu minimieren.
- Drücken Sie die Timer, sobald das Kapillarrohr macht Kontakt mit den Samen.
- Notieren Sie die Zeit (s) die es für das Sperma dauert um die 25 µL-Linie zu erreichen.
- Wenn die Messung abgeschlossen ist, legen Sie sofort die Röhrchen mit Sperma zurück in die trockene Hitze-Block für weitere funktionelle Analysen, wie z.B. video Darstellung der Beweglichkeit der Spermien.
- Desinfizieren Sie das Kapillarrohr mit Sperma durch das Rohr in 10 % Bleichmittel-Lösung für 20 min eintauchen und entsorgen Sie das Kapillarrohr in Sharps Container.
6. video Imaging der Beweglichkeit der Spermien
- Schalten Sie das Mikroskop und video-imaging-Software.
- Pipette 20 µL des verbleibenden Spermas auf der vorgewärmten Glas-Folie, während die Objektträger auf den beheizten Objekttisch gelegt wird.
- Mit ein Glas Deckglas abdecken.
- Legen Sie die Folie Deckglas Seite nach unten auf das Mikroskop.
- Verwenden Sie 20 X Objektiv Interessengebiet zu finden.
- Ändern Sie in 100 X Objektiv für video Imaging.
- Nehmen Sie die Video auf 12 Bilder/s (fps) für 30 s.
- Nach dem Zufallsprinzip Videoaufnahmen Sie die in mindestens 3 verschiedenen Bereichen pro Tier.
- Führen Sie die Bildgebung schnell und Belichtung auf die Folie zu minimieren, um Beweglichkeit der Spermien und Lebensfähigkeit zu erhalten.
Hinweis: Dieses bildgebende Verfahren sollte innerhalb von 2 – 3 min. erfolgen. - Datenanalyse mit ImageJ-Software als zuvor beschriebenen8.
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Representative Results
Sperma wurde von Strg und KO Weibchen ca. 8 h gesammelt, nach der Paarung mit fruchtbaren Strg-Männchen. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) wird durch den Zeitaufwand für die 25 μL Kapillarrohr mit Sperma füllen quantifiziert. Samen gesammelt von Strg Uteri 2.06 ±0.12 min nahm (mean±S.E.M, n = 5), das Kapillarrohr (Abbildung 1) zu füllen. Die Samen gesammelt von KO Uteri dauerte jedoch länger als 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentelle Zeit. Diese Daten deuten darauf hin, dass das Sperma deutlich mehr verflüssigt wird oder dünnflüssiger in die Strg-Taste im Vergleich zu KO Uteri.
Um eines der nachgelagerten Anwendungen sammeln Samen aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane zu veranschaulichen, wurde Samenzellenmotilität anhand video Imaging. Das Sperma aus der Strg Uteri zeigte frei-schwimmen Samenzellen im mikroskopischen Bereich, dargestellt in der Momentaufnahme in Abbildung 2Agesammelt. Das Sperma von den KO-Uteri gesammelt hat gezeigt, dass die Mehrheit der Spermien zusammen mit minimalen Mobilität (Abbildung 2 b) gruppiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Samen gesammelt von der weiblichen Fortpflanzungsorgane 8 h nach Paarung für weitere Spermien Analyse verwendet werden kann.
Abbildung 1 : Verflüssigung Mal (Sperma Viskosität) aus den Samen gesammelt von Maus Uteri. Grafische Darstellung der Verflüssigung Zeit (min) des Samens von Strg und KO Uteri gesammelt ca. 8 h nach der Paarung. Daten darstellen mean±S.E.M., n = 5 Weibchen/Genotyp. p < 0,001, ungepaarten Student t -Test. Adaptiert von zuvor veröffentlichten Ergebnisse8 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Bilder von Spermien in der Samenflüssigkeit gesammelt von Maus Uteri. Repräsentative Schnappschüsse von dem video Imaging genommen bei 1000 X Vergrößerung von Spermien in der Samenflüssigkeit von Strg (A) und (B) KO Uteri gesammelt. Adaptiert von zuvor veröffentlichten Ergebnisse8 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Sammeln von Samen von Maus Uteri bieten Vorteile gegenüber Samen Analyse in Vitro wie die ehemaligen die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den Samen und das Sekret aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane. zeigen können In dieser Studie vorgestellten Techniken erlauben Forschern, Qualität des Spermas sowie Spermien Rentabilität und Motilität in physiologischen Voraussetzungen zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es verschiedene nachgelagerte Auswertungen, die mit den Samen gesammelt aus den Uteri durchgeführt werden können, z. B. die Spermien gezählt werden können, um festzustellen, dass die tatsächliche Spermienzahl, Eintritt in die Gebärmutter und das Sperma auch für die Motilität Assays abgebildet werden kann. Der ideale Zeitpunkt um das Sperma zur Befruchtung Fähigkeit zu sammeln sollte innerhalb von 1 bis 2 Stunden nach der Paarung1.
Neben den zuvor genannten nachgelagerten Anwendungen Ermittler können auch auswerten, die Auswirkungen der Inhibitoren/Verbindungen des Interesses auf Sperma Transport verarbeitet, z. B. Samen Verflüssigung (oder Samen Viskosität), Spermienzahl im Darm-Trakt, Sperma Motilität, oder Sperma Migration zu verschiedenen Bereichen der weiblichen Fortpflanzungsorgane. Die Verbindungen können in der weiblichen Fortpflanzungsorgane vor der Paarung8angewendet werden. Dann kann die Wirkung dieser Inhibitoren/Verbindungen aus der Samenprobe Post-Paarung. beurteilt werden Diese Methoden können nützlich sein, die Praktikabilität der empfängnisverhütende Medikamente zu testen, die Spermien Transport zu hemmen.
Kernpunkte der Gegenleistung für Sperma Sammlung und Verflüssigung/Viskosität Messungen sind die Empfindlichkeit der Spermien und der Winkel des Kapillarröhrchens. Spermien sind empfindlich auf Temperaturänderungen. Wenn nachgelagerte Analyse der Spermienfunktion und Motilität ist essentiell für experimentelle Ergebnisse, das Gewebe und Sperma überhaupt bei 37 ° C gehalten werden müssen jederzeit mit minimalen Aussetzung zum Licht. Gibt es mehrere Proben von mehreren Weibchen sammeln, einschläfern Sie die Tiere eins zu einem Zeitpunkt zu warten zu minimieren. Für die Messung der Verflüssigung verschiedene Winkeln des Kapillarröhrchens Inkonsistenzen in Verflüssigung Zeit generieren. Daher haben die Ermittler das Kapillarrohr (in einem Winkel von 180°) parallel zu der Rohrwand zu halten, um die Variabilität erstellt von jeder Ermittler zu minimieren. Samenprobe sollte nicht spätestens 09:00 h abgeholt werden, dies ist aufgrund der flüssigen Rückresorption in der Gebärmutter. Der Prüfer kann nicht ausreichend flüssige Material für die Verflüssigung Messung abgerufen werden.
Es steht fest, dass die Verflüssigung des Samens vor allem durch die enzymatische Aktivität von PSA abgesondert von der Prostata13vermittelt wird. Es gibt jedoch begrenzte Studien um die Rolle der weiblichen Fortpflanzungsorgane während in Vivo Verflüssigung Prozess8zu bestimmen. Daher bietet die Sammlung des Samens von der weiblichen Fortpflanzungsorgane, ein entscheidender Vorteil die Verflüssigung zu studieren in Vivo, Prozesse, nachdem das Sperma aus dem weiblichen Genitaltrakt14Sekrete ausgesetzt war. Zusammenfassend kann Post-ejakuliert Sperma Verflüssigung/Viskositätsmessung die Forscher, das Zusammenspiel zwischen Samen und die weiblichen Fortpflanzungsorgane zu entschlüsseln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird unterstützt vom Anschubfonds College of Veterinary Medicine (WSU), WW. Die Autoren danken Sierra Olsen (WSU) für kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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