Summary
精子的液化需要从精凝胶中解放出来。本研究提供了从雌性生殖道 post-coitus 中收集精子, 以及测定精子液化时间的程序。
Abstract
在小鼠体内, 被射出的精子在子宫内沉积。射精后, 精子的一致性从凝胶状变为水样, 这一过程称为液化。在这项研究中, 我们展示了如何收集 post-ejaculated 精子从女性生殖道在一个小鼠模型。首先, 发情阶段的成年雌性老鼠在一夜之间被安置在一个雄性笼子里。第二天早上, 交配被证实的交配插头在阴道开口。交配插头的雌性小鼠被安乐死, 每个生殖道都被收集成一个整体 (阴道、子宫、输卵管、卵巢), 确保一个封闭的系统来控制精子。生殖道被放置在1.5 毫升离心管, 阴道被切断, 以释放的精子进入管。为了保证最大的精子量进行分析, 用无牙钳将子宫角从卵巢端挤压到阴道末端, 排出残余的精子。整个生殖道被丢弃。该精子管被短暂剥离。25μ l 毛细管吸管被放置在一个180°角 (平行于管壁) 管。记录了在25μ l 线上填充毛细管所用的时间。从一个成熟的雄性饲养者的精子通常需要大约60-180 秒来填满25μ l 毛细管。这种精子收集技术也可用于其他下游应用, 如精象和运动分析。
Introduction
雌性生殖道由上部和下层组成。上生殖道包括输卵管、子宫和宫颈。下生殖道包括 ectocervix 和阴道。在人类, 被射出的精子沉积在阴道前壁, 毗邻 ectocervix1。然而, 在小鼠体内, 精子在交配2后几分钟内就会被扫入子宫。
精子含有精凝胶, 在射精的几秒钟内凝固, 导致精子被诱捕并固定在3。液化释放的固定精子通过改变精子从凝胶状到水样的一致性。这一过程对精子的运动和哺乳动物的繁殖至关重要。关于精子液化的知识主要是基于体外研究, 其中精子在培养皿中液化。在人类中, 前列腺特异抗原或 PSA (也称为激肽释放酶相关的肽3或 KLK3) 的酵素活性是通过水解 semenogelins (在精子中存在凝胶形成的蛋白质) 来液化的主要贡献者4 ,5,6。降解 semenogelins 释放精子从精物, 增加精子的流动性。自由精子游向输卵管, 使卵子受精。液化 (或精子粘度) 试验是标准的初步筛查精子分析的生殖诊所, 以评估男性生育能力7。
最近发表的一篇文章表明 , 从雌性小鼠生殖道 post - mating 中收集到的的分析可以用来说明液化的不足 , 从而导致生育缺陷8。有缺陷的液化, 如精子高, 导致 11.8-32.3% 的男性不育症患者的9, 表明正常的液化是必不可少的哺乳动物繁殖。然而, 对液化缺陷的研究和处理完全集中在男性7。女性生殖道在精子液化中发挥作用的可能性尚未得到探讨。因此, 收集和测定液化时间的方法将为研究人员提供一种新的诊断工具, 以确定液化是否可能是模型机体中不育的原因之一。
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Protocol
本研究中使用的所有动物和程序都是根据华盛顿州立大学 (立) 动物保育和使用委员会的指导方针, 并遵照立批准的动物议定书 #4702 和 #4735 处理的。
1. 小鼠
-
使用标准 C57BL/6J 成年雄性小鼠或其他有兴趣的品系。在温度和湿度控制的环境下维护动物, 使用ad 随意获取水和食物。
- 使用雄性饲养者, 从8周大到10月大不等。在实验中只使用经过验证的育种者。
-
使用具有组织选择性删除生殖道雌激素受体α (由Esr1基因编码) 的成年雌性小鼠在上皮细胞中10 (Wnt7a.在本研究中, Esr1f/f, 称为挖空或 "KO") 和控制窝 (Esr1f/f, 称为 "CTRL")。
- 使用8周大的女性。女性的年龄根据兴趣实验而变化。
- 确定在早上08:00h 的动情周期的阶段。只在周期的发情阶段使用雌性。有关阴道涂抹和细胞学分析的详细方法, 请参阅以前发布的过程11。
2. 交配和评估交配插头
- 在发情的那天 (16:00h), 把雌性放在雄性笼子里。
- 第二天早上 (08:00h), 把雌鼠和雄性老鼠分开。
- 使用以前发布的方法12的改编来访问阴道或交配插头的存在或缺失作为交配的指示。
- 将母鼠从尾部的底座中抱起, 以短暂地抬起后肢。
- 找到交配插头的存在, 一个白色的精物在阴道开口使用牙签。如果交配插头存在, 牙签将无法插入到阴道管。
3. 组织收集前的准备
- 准备10毫升的莱博维茨的 L-15 培养基, 辅以1% 胎牛血清 (称为 L15 培养基 + 1% FBS) 在15毫升管。在37° c 的培养基上孵育15分钟的水。
- 为了保持组织和精子在下游应用的可行性, 分2毫升的 5ml L15 培养基 + 1% FBS 在2毫升离心管组织收集。
- 温暖的阶段显微镜到37° c。将热块设置为37° c, 并在块中放置一个空的 1.5 mL 离心管。
- 如果下游应用需要成像的精子运动, 温暖的玻璃幻灯片到37° c。
4. 组织收集
- 带 5ml L15 媒体 + 1% FBS 分到组织收集区。
- 安乐女性 (~ 08:30h) 使用二氧化碳窒息, 其次是颈椎脱位。
注意: 这是大约 8 h 在交配之后, 假设交配发生在午夜。 - 将动物置于仰卧位以暴露腹部区域。
- 在后肢附近的腹部喷洒70% 酒精。
- 使用解剖剪刀在下腹部的皮肤上做一个小切口 (~ 1 厘米)。
- 使用占优势的手拉尾巴 (和后肢, 如果有必要) 而非手拉皮肤相反的方向 (向头部) 暴露腹部肌肉。这种方法是用来减少头发污染的内脏器官的数量。
- 将腹部底部的 V 型肌肉切开, 靠近阴道, 露出内脏器官。
- 将肠道和腹部脂肪移到侧面以暴露生殖道。
- 在阴道区域上方修剪膀胱和其他组织。
- 切开耻骨联合以获得阴道组织。
- 在阴道开口处提起阴道组织, 用剪刀将阴道导管从直肠组织中分离出来。
- 用弹簧剪刀仔细修剪子宫两侧的肠系膜脂肪。
注意: 子宫很脆弱, 里面有精子。注意不要刺穿子宫, 否则精子会丢失。 - 抬起较低的生殖道, 并切断两侧的卵巢脂肪垫。
- 将整个生殖道转移到5ml 莱博维茨的 L-15 培养基 + 1% FBS。
5. 从子宫含量采集中测定精子液化 (黏度)
- 在显微镜的加热阶段, 将组织转化为35毫米无菌组织培养皿, 填充3.5 毫升 5ml L-15 培养基 + 1% FBS, 以清洁血液和其他污染物的组织。
注意: 清洗时, 用脂肪, 而不是子宫来抓组织。此时, 精子有望在子宫内完好无损。 - 使用实验室抹布涂抹过量介质的组织。
- 在阴道末端放置组织, 同时将卵巢末端置于预热离心管中。在保持阴道末端的同时, 切下子宫底部的子宫角, 允许子宫角落入离心管。
- 让精子从子宫角流出管。用无牙钳将子宫角从卵巢末端轻轻挤压到阴道末端, 排出残余的精子。
- 丢弃生物危害袋中的组织并焚烧。
- 简单地在 minicentrifuge (1-2 秒) 内将精子向下旋转。
- 放置管, 平行于加热阶段-精子不会溢出。
- 准备好计时器并设置为 "计数"。
- 在一个180°角 (平行于管壁) 上插入一个25µL 毛细管进入精子样品。这是为了尽量减少各调查人员之间的差异, 从不同角度持有毛细血管管。
- 当毛细管与精子接触时, 立即按下定时器。
- 记录精子到达25µL 线所需的时间。
- 当测量完成后, 立即把含有精子的管子放回干热块中进行进一步的功能分析, 如对精子运动的视频成像。
- 在10% 漂白剂溶液中浸泡20分钟, 并将毛细管放在锋利的容器中, 对含有精子的毛细管进行消毒。
6. 精子运动的影像学
- 打开显微镜和视频成像软件。
- 吸管20µL 的剩余的精子的5ml 玻璃幻灯片, 而玻璃幻灯片被置于加热阶段。
- 盖上玻璃片。
- 将滑动片侧放在显微镜下。
- 使用20X 物镜来查找感兴趣的区域。
- 更改为视频成像的100X 物镜。
- 录制的视频在12帧/秒 (fps) 为三十年代。
- 随机记录每个动物至少3不同区域的视频。
- 快速进行成像, 并尽量减少光线照射到幻灯片, 以保持精子的活力和活力。
注: 此成像程序应在2-3 分钟内完成。 - 使用 ImageJ 软件执行数据分析, 如前所述8。
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Representative Results
在与肥沃的 ctrl 雄性交配后, 从 ctrl 和高雌鱼身上收集了大约8小时的精子。液化 (或精子粘度) 是量化的时间采取填补25μ l 毛细管与精子。从 CTRL 子宫收集的精子采取了2.06 ±0.12 分钟 (mean±东南亚 M, n = 5) 填充毛细管 (图 1)。然而, 从高子宫采集的精子的试验时间超过60分钟 (60.0 ±0.0, mean±东南亚米, n = 5)。这些数据表明, 与高子宫相比, 在 CTRL 的时候, 精子的液化程度和粘性都明显降低。
为了说明从女性生殖道收集精子的下游应用, 用影像学方法评估精动力。从 CTRL 子宫收集的精子显示在显微镜下的微域中自由游动, 在图 2A的快照中表示。从高子宫收集到的精子显示, 大部分人都聚集在一起, 最小的移动性 (图 2B)。这些结果表明, 交配后从女性生殖道收集的精子 8 h 可用于进一步的精分析。
图 1: 从小鼠子宫收集的精子中的液化时间 (精子粘度).在交配后大约8小时, 从 CTRL 和高子宫收集的精子的液化时间 (分钟) 的图解表示。数据代表 mean± S.E.M., n = 5 女性/基因型。p < 0.001, 未配对的学生t测试。从以前发布的结果 8改编而来, 具有权限。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 从小鼠子宫收集的精子的代表性图像.从(A) CTRL 和(B)中采集的精子的1000X 倍放大率的视频图像中的代表性快照。根据以前发布的结果8与权限改编。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
从小鼠子宫收集精子可以提供优于精子分析的优势体外, 因为前者可以说明精子与女性生殖道分泌物之间的生理相互作用.在这项研究中提出的技术使研究人员能够确定精子的质量, 以及在理想的生理条件下的活力和活力。此外, 还有各种各样的下游分析, 可以使用从子宫收集的精子, 例如, 精子可以计数, 以确定实际精子数进入子宫和精子也可以成像的运动化验。理想的时间点收集精子受精能力应在1至2小时后交配1。
除了前面提到的下游应用, 调查人员还可以评估抑制剂/化合物对精子转运过程的影响, 如精液化 (或精子粘度)、精子数、精子运动, 或精子迁移到女性生殖道的不同区域。在交配8之前, 这些化合物可用于雌性生殖道。然后, 这些抑制剂/化合物的影响可以评估从精子样本 post-mating.这些方法可用于测试抑制精子转运的避孕药物的实用性。
精采和液化/粘度测量的关键点是精子的敏感性和毛细血管管的角度。精子对温度变化敏感。如果对精子功能和运动的下游分析对实验结果是必不可少的, 组织和精子需要保持在37° c 的任何时候, 最小暴露于光。如果有几个样本收集从多个雌性, 安乐的动物一次, 以尽量减少等待。对于液化的测量, 不同角度的毛细管产生的液化时间不一致。因此, 研究人员必须将毛细管管平行于管壁 (180 °角), 以尽量减少每个调查员产生的变异性。精子样本不应迟于 09:00h, 这是由于子宫内液体吸收。研究者可能没有获得足够的液化量的流体材料。
研究证实, 精子液化主要是由前列腺分泌的 PSA 的酶活性介导的13。然而, 有有限的研究, 以确定女性生殖道在体内液化过程中的作用8。因此, 从雌性生殖道收集精子为研究体内的液化过程提供了一个重要的优势, 在精子被暴露在女性生殖道的分泌物之后,14。总之, post-ejaculated 的精子液化/粘度测量使研究人员能够破译精子和雌性生殖道之间的相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了兽医学院 (立) 启动基金对 WW 的支持。作者感谢塞拉奥尔森 (立) 对这篇手稿的批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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